专利名称：无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-AC群脑膜炎球菌联合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明提供一种吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗。即由吸附无细胞百白破联合疫苗、b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌结合疫苗联合而成的六联疫苗，用以预防百日咳、白喉、破伤风及由A、C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎，由b型流感嗜血杆菌引起的中耳炎、脑膜炎等疫苗，属于疫苗生产制备技术领域。
背景技术：
传染病至今仍是导致婴幼儿死亡的重要原因，在全世界可通过免疫接种来预防的疾病已达三十多种。据统计儿童入学前需接受预防注射达21次左右，按现行的免疫程序，免疫计划很难安排。改进现有疫苗，减少接种针次，提高疫苗的可接受性已势在必行。联合疫苗是新型疫苗研发的主要方向之一。联合疫苗较之单价疫苗有如下优点更少的针次；减少婴幼儿创伤；提高复杂的免疫计划表的实施效率，减少漏种；更高的疫苗覆盖率；更低的空间存放要求；有助于新品种的疫苗增加到免疫计划表中。以无细胞百白破联合疫苗(DTaP)为基础的联合疫苗是研究的热点。不少新疫苗的出现，不仅使联合疫苗的研制变得日趋迫切，使联合疫苗的组成成分越来越多，百日咳(P)、白喉(D)、破伤风(TT)等疾病在我国流行范围广，危害程度相当严重，及时进行疫苗接种，是唯一有效的预防保护性措施。侵袭性b型流感嗜血杆菌(Hib)是我国儿童呼吸道感染的重要致病菌，是引起细菌性脑膜炎和细菌性肺炎的主要病原菌。肺炎链球菌是儿童肺炎，急性中耳炎，脑膜炎，心内膜炎，败血症的主要致病菌。我国每年有250万人患肺炎球菌性肺炎，并造成12. 5万人死亡。脑膜炎奈瑟氏球菌(Nm)是流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)的主要病因，并且是唯一能引起脑膜炎大流行的细菌，在许多国家仍然严重威胁大众健康。据WHO估计，全球每年由脑膜炎球菌引起约30万一35万的病例。与美国或西欧(发病率为14 / 10万)相比，许多发展中国家发病率更高(约25 / 10万)。因此开展吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌联合疫苗是针对已有技术的拓展与延伸，可为我国儿童预防传染病工作提供质优价廉的联合疫苗，创造较好的社会效益和经济效益。由于流行病分布的差异，国外还未上市包含DTaP、Hib荚膜多糖蛋白结合物与AC群脑膜炎球菌荚膜多糖蛋白结合物联合的疫苗。目前国内外的相关产品主要有GlaxoSmithKline Biologicals(GSK)公司生产的 Infanrix-Hib ,它是具有 DTaP/Hib 抗原的联合疫苗。其中DTaP抗原为液体，Hib抗原为冻干制剂，两部分抗原分开包装。GSK还生产DTaP与IPV联合的Kinrix 联合疫苗，包含DTaP与乙肝抗原和IPV成分的Pediarix 。Sanofi Pasteur生产的Pentacel 是包含DTaP-IPV和Hib抗原的联合疫苗。国内虽有相似产品的专利(申请号200910067156)，但说明书中仅描述流脑多糖生产工艺，过程公开不充分，且尚无产品上市。这是因为六联疫苗成分复杂，疫苗成分的简单混合可能引起的抗原干扰，导致多糖特异性抗体滴度降低，加之各单组分疫苗混合后质控标准难以确立，内毒素标准难以达到等因素所致。因此在疫苗配比过程中，需要长期疫苗生产经验的积累与国外临床研究的反馈，并进行免疫干扰相关研究，确认其安全有效的范围。由于疫苗成分复杂，除有效成分外，其他组分，如冻干赋形剂等组分，会对检测方法造成一定的干扰。如乳糖就会对多种多糖的游离多糖检测造成干扰。
发明内容
本发明的任务是提供一种吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌联合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一针防多病的特点，并符合2010版《中国药典》三部“吸附无细胞百白破联合疫苗” “b型流感嗜血杆菌结合疫苗” “A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”及拟定“吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗制造与检定规程”的相关要求，以实现能实际应用的目的。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种联合疫苗由以下组分(a)和组分 (b)组成(a)吸附无细胞百白破联合疫苗；(b) b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗；(a)和(b)分别装在分开的容器中。所述的(a)吸附无细胞百白破联合疫苗是按以下方法制备的(I)制备各单价疫苗原液(I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中国药典》“吸附百白破联合疫苗”中附录I “百日咳疫苗原液制造及检定要求”工作种子批经血清学试验、皮肤坏死试验、毒力试验和效价测定后冻干保存，工作种子批菌种启开后，接种于培养基，如改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35 37°C培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用终浓度小于O. 1%甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2 3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获，收获后精制，可采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C进行脱毒,脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素；(III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传广3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基。采用培养罐液本培养，培养过程应严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C进行脱毒,制成类毒素，即为破伤风类毒素；(2)合并及稀释配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化招原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液，将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗。
所述的(b) b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌联合疫苗是按以下方法制备的(I)制备各单价疫苗原液(I) A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；
依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得A群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群脑膜炎球菌结合疫苗原液C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得C群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存；(III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度75°/Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入一定浓度碳二亚胺(EDAC)冰浴反应一定时间，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2l°C保存； (2)合并冻干将A、C群脑膜炎球菌多糖结合原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖计)混匀后，加入乳糖或甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗。本发明提供的联合疫苗的制备方法，包括以下步骤步骤一制备吸附无细胞百白破联合疫苗 (I)制备各单价疫苗原液(I)百日咳菌种工作种子批启开后，接种于培养基，如改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35 37 °C培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用终浓度小于O. 1%甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液；(II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2 3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子。采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获。收获后精制，可采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C进行脱毒。脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素；(III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传f 3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基。采用培养罐液本培养，培养过程应严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C进行脱毒,制成类毒素，即为破伤风类毒素；(2)合并及稀释配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化招原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液。将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗；步骤二 制备b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗
(I)制备各单价疫苗原液(I) A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去 溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得A群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存；(II) C群脑膜炎球菌结合疫苗原液C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得C群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存；(III) b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25%，2 - 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度75°/Γ80% ；离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼( ADH)反应适宜时间后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量碳二亚胺(EDAC)冰浴反应1-4小时，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2l°C保存；(2)合并冻干将A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖计)混匀后，加入乳糖或甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗；步骤三分装将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗与b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗分别分装在预充式注射器与低硼硅西林瓶中。所述脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖与b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为各自偶联至载体蛋白上，如偶联至破伤风类毒素。其中，多糖蛋白偶联物中，多糖蛋白比在I :2至I :4之间。载体蛋白的选择上，可为破伤风类毒素，也可为白喉类毒素载体或CRM197等适宜蛋白。本发明提供的疫苗在使用时将以下两种组分临用前混合(a)吸附无细胞百白破联合疫苗；(b) b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗；(a)和(b)分别装在分开的容器中。本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤本发明疫苗可以O. 5ml的剂量给予接种者。所述混合的偶联物组分未经佐剂处理；所述混合的偶联物组分不含汞防腐剂；所述(b)部分的偶联物为冻干制剂；所述(b)部分赋形剂包含乳糖或(和)甘氨酸。国内虽有相似产品的专利(申请号200910067156)，但说明书中仅描述流脑多糖生产工艺，过程公开不充分，且尚无产品上市。这是因为六联疫苗成分复杂，疫苗成分的简单混合可能引起的抗原干扰，导致多糖特异性抗体滴度降低，加之各单组分疫苗混合后质控标准难以确立，内毒素标准难以达到等因素所致。因此在疫苗配比过程中，需要长期疫苗生产经验的积累与国外临床研究的反馈，并进行免疫干扰相关研究，确认其安全有效的范围。由于疫苗成分复杂，除有效成分外，其他组分，如冻干赋形剂等组分，会对检测方法造成一定的干扰。如乳糖就会对多种多糖的游离多糖检测造成干扰。故本专利申请中采用甘氨酸作为赋形剂，以冻干曲线，探索出适宜的冻干方法，添加退火步骤，使冻干效果更佳。故本专利申请提供的是一种稳定的吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌联合疫苗，所述生产工艺、产品剂型与添加的辅料及效果与现有技术相比有实质不同，具有显著的进步。本发明的优点在于(I)接种一种疫苗就可预防百日咳，白喉，破伤风，由A、C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎，b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎，中耳炎等疾病。(2)提高疾覆盖率，减少漏种。(3)减少疫苗的多次接种对儿童及其家长带来的痛苦和负担。(4)生产过程可控，产品安全有效。
具体实施例方式本发明包括但不限于以下实施例。实施例I :一、吸附无细胞百白破联合疫苗制备( I)制备各单价疫苗原液 (I)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中国药典》“吸附百白破联合疫苗”中附录I “百日咳疫苗原液制造及检定要求”工作种子批经血清学试验、皮肤坏死试验、毒力试验和效价测定后冻干保存。工作种子批菌种启开后，接种于培养基，如改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35 37°C培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用终浓度小于O. 1%甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液。(II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2 3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子。采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获。收获后精制，可采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C进行脱毒。脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素。(III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传广3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基。采用培养罐液本培养，培养过程应严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C进行脱毒,制成类毒素，即为破伤风类毒素。(2)合并及稀释配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化招原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液。将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗。二、b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗的制备(I)制备各单价疫苗原液(I) A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%, 2 一 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液。依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，既为A群脑膜炎结合物原液，于2 8°C保存；(II) C群脑膜炎球菌结合疫苗原液C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液。依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜,反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，既为C群脑膜炎结合物原液，于2 8°C保存；(III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度75°/Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液。依据2010版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应适宜时间后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入一定浓度碳二亚胺(EDAC)冰浴反应一定时间，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，既b型流感嗜血杆菌结合物原液，于2 8°C保存；(2)合并冻干将A、C群脑膜炎球菌多糖结合原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液I :1 :1 (w/w,以多糖计)混匀后，加入乳糖或甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗。三.分装将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗与b型流感嗜血杆菌_A、C群脑膜炎球菌联合疫苗分别分装在预充式注射器与低硼硅西林瓶中再包装至每人份市售独 立包装。四.成品检定除水分测定外，按制品标示量加入吸附无细胞百白破复溶后进行其余各项检定，其中检测制品多糖含量时加入注射用水复溶后进行检测。成品检定如下I物理检查I. I外观冻干制剂应为白色疏松体，按标示量加入吸附无细胞百白破后应迅速复溶为白色混悬液，无摇之不散的异物。I. 2装量差异依法检查(2010版《中国药典》三部，附录I A)，装量差异限度应(±15% οI. 3鉴别试验采用免疫双扩散法(2010版《中国药典》三部，附录VDI C)，本品应分别与A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌、b型流感嗜血杆菌诊断血清和破伤风抗毒素形成明显沉淀线。无细胞百日咳疫苗注射动物应产生抗体(同效力检测)白喉类毒素采用小鼠一 Veix)细胞法。破伤风类毒素注射动物后应产生破伤风抗体(同效力检测)；疫苗加入枸椽酸钠或絮状反应。2化学检定2. I pH值应为5. 8 7. 5《中国药典》三部，2010版附录V A)2. 2游离多糖A群脑膜炎球菌和C群脑膜炎球菌、Hib游离多糖含量均应不高于20%。2. 3水分应不高于3. 0%(2010版《中国药典》三部，附录YD D)。2. 4多糖含量:A群脑膜炎球菌多糖采用钥酸铵法(2010版《中华人民共和国药典》三部附录νπ A)，C群脑膜炎球菌多糖采用间苯二酚显色法(2010版《中华人民共和国药典》三部附录VI C)，b型流感嗜血杆菌多糖采用钥酸铵法(2010版《中华人民共和国药典》三部附录YD Α)或核糖法(2010版《中华人民共和国药典》三部附录珊J)进行检测。其中A群脑膜炎球菌多糖根据WHO规程规定的计算公式(A群多糖含量磷含量为1000 75 ;C群多糖含量唾液酸含量为100 :75)，b型流感嗜血杆菌多糖根据WHO规程规定的计算公式(Hib多糖含量核糖含量为100 84)和2010版《中华人民共和国药典》三部提供的计算公式(Hib多糖含量核糖含量为I :0. 41)，按照《A、C群脑膜炎球菌_b型流感嗜血杆菌联合疫苗中各群多糖及游离多糖含量检定方法》中的计算方法得出各群多糖含量。每I次人用剂量以多糖含量计算应不低于30 μ g (A群、C群多糖和Hib多糖各应不低于10 μ g)。装量依法检查(2010版《中国药典》附录I A),应不低于标示量。2. 5氯化钠含量应为7. 5 — 9. 5g/L (2010版《中国药典》附录VII G)。2. 6氢氧化铝含量应为1.0— I. 5mg/ml (2010版《中国药典》附录VII F)。2. 7硫柳汞含量应不高于O. lg/L (2010版《中国药典》附录VII B)。2.8游离甲醛含量应不高于0.28/1 (2010版《中国药典》附录VI L)2. 9戊二醛含量应小于O. 01g/L (2010版《中国药典》附录VI I)2. 10热原检查用无菌生理氯化钠溶液将供试品稀释成半成品浓度的1/50，依法检查(2010版《中国药典》三部附录ΧΠ D)，符合规定。注射量按家兔体重Ikg注射lml。 3.效价测定3.1无细胞百日咳疫苗按2010版《中国药典》“吸附百白破联合疫苗”中附录2进行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每I次人用剂量的免疫效价应不低于4. 0IU,且95%可信限的低限应不低于2. OIU0如达不到上述要求时可进行复试，但所有的有效试验结果必须以几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均)来计算。达到上述要求即判为合格。3. 2白喉疫苗每I次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU(2010版《中国药典》附录XI C)。3. 3破伤风疫苗每I次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU (附录XI B)。4.无菌检查依法检查(附录XII A)，应符合规定。5.特异性毒性检查5. I无细胞百日咳疫苗按2010版《中国药典》本品种附录中2. 5项进行。5. 2白喉、破伤风疫苗用体重25(T350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2. 5ml，分两侧注射，每侧I. 25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5 10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天，第20天，每30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。6.毒性逆转试验供试品置37°C 4周，按2010版《中国药典》本品种附录中2. 6项进行。检测结果
权利要求
1.一种联合疫苗，由以下组分(a)和组分(b)组成 (a)吸附无细胞百白破联合疫苗； (b)b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗； (a)和(b)分别装在分开的容器中。
2.根据权利要求I所述的联合疫苗，其特征在于所述的(a)吸附无细胞百白破联合疫苗是按以下方法制备的 (I)制备各单价疫苗原液 (1)百日咳疫苗原液制造按照2010版《中国药典》“吸附百白破联合疫苗”中附录1“百日咳疫苗原液制造及检定要求”工作种子批经血清学试验、皮肤坏死试验、毒力试验和效价测定后冻干保存，工作种子批菌种启开后，接种于培养基，如改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35 37°C培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中；采用终浓度小于O. 1%甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2 3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子，采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获，收获后精制，可采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制，精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C进行脱毒,脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素； (III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传Γ3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基。采用培养罐液本培养，培养过程应严格控制杂菌污染，检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素,毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C进行脱毒,制成类毒素，即为破伤风类毒素； (2)合并及稀释配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化铝原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液，将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗。
3.根据权利要求I所述的联合疫苗，其特征在于所述的(b)b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗是按以下方法制备的 (I)制备各单价疫苗原液 (I)A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；依据2010版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得A群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群脑膜炎球菌结合疫苗原液C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌·或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液； 依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得C群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度75°/Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液； 依据2010版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入一定浓度碳二亚胺(EDAC)冰浴反应一定时间，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并冻干将A、C群脑膜炎球菌多糖结合原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖计)混匀后，加入乳糖或甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗。
4.权利要求I所述的联合疫苗的制备方法，包括以下步骤 步骤一制备吸附无细胞百白破联合疫苗 (I)制备各单价疫苗原液 (1)百日咳菌种工作种子批启开后，接种于培养基，如改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35 37°C培养不超过72小时，经纯菌检查后收集菌体，混悬于ρΗ7. (Γ7. 4的PBS中。采用终浓度小于O. 1%甲醛溶液杀菌，经杀菌检查后，即得百日咳疫苗原液； (II)白喉菌种工作种子批传代至产毒培养基种子管2 3代，再传至产毒培养基培养制成生产用种子。采用培养罐液体培养，培养过程中严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获。收获后精制，可采用硫酸铵、活性炭二段盐析法精制。精制毒素中加入甲醒溶液置35 — 37°C进行脱毒。脱毒到期的类毒素即为白喉类毒素； (III)破伤风菌种工作种子批先在产毒培养基种子管中传广3代，再转至产毒培养基制成生产用种子。采用酪蛋白、黄豆蛋白、牛肉等蛋白经加深水解后的培养基作为生产用培养基。采用培养罐液本培养，培养过程应严格控制杂菌污染。检测培养物滤液，毒素效价不低于40Lf/ml时收获毒素。毒素或精制毒素中加入甲醒溶液置35-37°C进行脱毒,制成类毒素，即为破伤风类毒素； (2)合并及稀释配制氢氧化铝佐剂，采用三氯化铝加氢氧化钠法，配制成的氢氧化招原液应为浅蓝色或乳白色胶体悬液。将白喉类毒素、破伤风类毒素及无细胞百日咳疫苗原液依次加入到已稀释的氢氧化铝佐剂中，用NaOH调pH值至5. 8^7. 2，即得到吸附无细胞百白破联合疫苗； 步骤二 制备b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗 (I)制备各单价疫苗原液 (I)A群脑膜炎球菌结合疫苗原液:A群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%, 2 一 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液； 依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得A群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存； (II)C群脑膜炎球菌结合疫苗原液C群脑膜炎球菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，加入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ;按I 2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度759Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液；· 依据2010版《中国药典》三部中“Α群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应6-60分钟后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰浴反应I 一 4小时，用O. 2Μ的NaCl溶液透析过夜，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得C群脑膜炎球菌结合疫苗原液，于2l°C保存； (III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，力口入乙醇至终浓度25%，2 — 8°C静置I 一 3小时或过夜，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却乙醇至终浓度80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次及以上，沉淀物即粗制多糖。粗制多糖溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达l(T20mg/ml ；按I :2容量用冷酚(IOOg结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取，离心收集上清液，并用O. lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度75°/Γ80% ;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙铜各洗2次以下，干燥后用注射用水溶解沉淀，即得纯化多糖原液； 依据2010版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求对多糖进行检定，多糖原液经溴化氰活化，加入1、6_已二酰肼(ADH)反应适宜时间后除去溴化氰和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；取样检定合格后，将多糖-AH衍生物与破伤风类毒素等质量混合，然后加入过量碳二亚胺(EDAC)冰浴反应1-4小时，用O. 2M的NaCl溶液透析过夜或超滤，反应物经Sepharose 4FF层析纯化,收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于疒8°C保存； (2)合并冻干将A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液与b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液1:1:1 (w/w,以多糖计)混匀后，加入乳糖或甘氨酸分装冻干，即得到b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗； 步骤三分装将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗与b型流感嗜血杆菌-A、c群脑膜炎球菌联合疫苗分别分装在预充式注射器与低硼硅西林瓶中。
5.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于，白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳抗原被吸附到氢氧化铝佐剂上。
6.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述组分(a)可包含氢氧化铝和/或磷酸招佐剂。
7.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述白喉类毒素与破伤风类毒素的比例在2 :1和3 :1之间，以Lf单位测量。
8.根据权利要求I所述疫苗，其特征在于，所述组分(b)中脑膜炎球菌荚膜多糖与b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为各自偶联至载体蛋白上，如偶联至破伤风类毒素。
9.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的单位剂量包含每种偶联物4一16Pg。
10.根据权利要求I所述疫苗，其特征在于，所述组分(b)包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清型A和C的多糖。
11.根据权利要求I所疫苗，其特征在于，所述组分(b)的偶联物，其多糖与蛋白的质量比为O. 3至I. 2之间。
12.根据权利要求I所述的疫苗，其特征在于，所述组分(b)中A群、C群血清型多糖偶联物比例为I :1。
全文摘要
本发明提供了一种吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗，使其具有安全、有效、可控及一针防多病的特点，并符合2010版《中国药典》三部“吸附无细胞百白破联合疫苗”“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”及拟定“吸附无细胞百白破/b型流感嗜血杆菌-A、C群脑膜炎球菌联合疫苗制造与检定规程”的相关要求，达到了可投入实际应用的效果。
文档编号A61P31/04GK102813917SQ20121029554
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者杨晓明, 魏树源, 段凯, 薛红刚, 李新国, 项美娟, 卢佳丽 申请人:武汉生物制品研究所有限责任公司