专利名称：过滤、吸附及灭活病毒的纳米催化材料的快速筛选方法
技术领域：
本发明涉及催化材料，具体地说是一种过滤、吸附及灭活病毒的纳米催化材料的快速筛选方法。
背景技术：
非典型性肺炎(atypical pneumonia)又名严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)[文献1.Poutanen SM，Low DE，Henry B，Finkelstein S，Rose D，Green K，Tellier R，Draker R，Adachi D，AyersM，Chan AK，Skowronski DM，Salit I，Simor AE，Slutsky AS，Doyle PW，Krajden M，Petric M，Brunham RC，McGeer AJ，N.Engl.J.Med，2003，3481993；文献2.Lee N，Hui D，Wu A，Chan P，Cameron P，Joynt GM，Ahuja A，Yung MY，Leung CB，To KF，Lui SF，Szeto CC，Chung S，Sung JJ，N.Engl.J.Med，2003，3481984；文献3.Tsang KW，Ho PL，Ooi GC，Yee WK，Wang T，Chan-Yeung M，Lam WK，Seto WH，Yam LY，Cheung TM，Wong PC，Lam B，Ip MS，Chan J，Yuen KY，Lai KN.，N.Engl.J.Med，2003，3481975]，从2002年11月26日我国广州出现第一例非典型性肺炎病人，至2003年4月份达到流行高峰并曼延至全国多个省份及城市，病人达5000余，世界上其他国家也有病例报道；全世界的科学家正以极大的热情投入到相关的研究中。目前，SARS病毒的基因测序已经完成，SARS病毒的可能结构模型已经得出[文献4.Thomas G.Ksiazek，Dean Erdman，Cynthia S.Goldsmith，et al.N.Engl.J.Med.2003，3481953-65]，抗SARS药物和疫苗的研制也在加紧进行，但根据药物和疫苗研制的规律，短时间内恐难以进入临床实用阶段；为预防SARS，保障人类的安全与健康，申请人联合大连医科大学组织开展了“用于呼吸道病毒阻隔、吸附和灭活的纳米催化材料及相关作用机制研究”，拟利用化物所在催化、分析的优势，研制出能对病毒具有广谱杀灭作用的纳米催化材料，应用于各种防护设施，有效控制SARS的传播。
SARS病毒主要是由近三万个碱基组成的RNA和三个糖蛋白组成的蛋白外壳构成[参见文献1～4]；由于直接使用病毒进行催化材料过滤、吸附及灭活评价的周期较长，因此首先要建立可对催化剂进行快速筛选的方法；由于拟发展的材料是广谱性的吸附、氧化材料，初步可考虑选用构成SARS病毒的相近糖蛋白和RNA作为催化材料快速筛选的评价对象；传统的病毒活性检测方法是通过细胞培养的方式来分离培养病毒，然后对其特性，包括感染细胞后的细胞病变效应及血凝试验等来加以鉴定，但传统方法对病毒进行鉴定需要的周期较长，对操作环境的要求也较高；但由于糖蛋白的分析、检测方法的建立，RNA的合成均需要较长的时间，也存在一定难度，而且我们的最终目的是筛选非特异性的高效纳米催化材料，因此本发明选用较RNA更稳定的DNA分子[文献5.Leone K.S.，Wessner L.L.，McenteeM.F.，Carcinogenesis 1997，181163；文献6.Ren J.，Ulvik A.，Ueland P.M.，Refsum H.，Anal.Biochem.1997，24579]做探针，建立对纳米催化材料吸附性能和抗水性能进行快速筛选和评价的方法，并利用本发明给出的气溶胶发生器装置，建立纳米催化材料对病毒阻隔、吸附和灭活评价的实验方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对催化材料性能评价周期短的过滤、吸附及灭活病毒的纳米催化材料的快速筛选方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为1)以100～1000个碱基的核酸分子片段作为探针，采用喷洒或浸泡的方式将核酸分子吸附于催化剂上，然后用不少于探针原液9倍的水进行洗脱，筛选出吸附能力强的(吸附量为原液的90％(w/w)以上)或较强(吸附量为原液的60％(w/w)以上)催化剂；
2)将上述步骤选取的催化剂对目标病毒进行吸附、洗脱，对催化剂用水或生理盐水一次或多次洗脱，然后对洗脱液中的病毒进行传统的活性检测；筛选出对病毒的过滤、吸附及灭活作用好的(吸附量为原液的95％(w/w)以上且能杀灭病毒)催化剂。
所述的核酸分子最好为荧光标记的核酸分子；最好采用PCR方式制备而成；本发明步骤1)中的洗脱液的检测是采用毛细管电泳方法，其采用的筛分介质为线性聚丙烯酰胺凝胶；具体操作条件为，线性聚丙烯酰胺凝胶涂层毛细管柱50μm×47cm，进样电压为15kV，分离温度为50℃，分离电压15kV；本发明所述目标病毒也可以为与其性质类似的病毒，性质类似是指直径大小相近、包膜的结构相似；当目标病毒为SARS病毒，性质类似的病毒应为副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒。
为进一步简化病毒实验，本发明提供了一种专用装置，用于步骤2)中催化剂对目标病毒的吸附过程；气溶胶发生器由空气气瓶、三通、吸附腔、病毒样品容器构成，具体为空气气瓶经减压表和净化管接三通的进气口，三通的一出气口经数字调节阀和压力表接吸附腔中上部，三通的另一出气口经喷雾量调节阀接吸附腔上端，在喷雾量调节阀和吸附腔之间的管路上连接有病毒样品容器和喷雾开关，吸附腔下端带有排气口，排气口插入吸液瓶中；所述吸附腔上部为可拆卸的有机玻璃套管，中下部装有不锈钢纱网，纱网上装催化剂，催化剂上盖有纱布。
催化剂毒性用细胞毒实验评价，采用白血病耐药细胞株和白血病敏感细胞株，用不同浓度梯度的催化剂对细胞毒性的作用大小，来确定其毒性范围。
本发明具有如下优点1.首先以核酸分子作为探针，以副流感病毒作为模拟对象，建立了对纳米催化材料吸附性能和抗水性能进行快速筛选和评价的方法，并进行了相应催化材料过滤、吸附核酸分子的作用特性研究；进行纳米催化材料阻隔、吸附和灭活病毒的可能性的快速研究，并以此为思路建立了DNA吸附能力的快速评价方法。
2.为进一步简化病毒实验，本发明提供了一种简便易操作的气溶胶发生器装置，在此基础上建立了对纳米催化材料阻隔、吸附及灭活病毒作用进行评价的实验方法，可对新合成的催化剂对病毒的阻隔、吸附和灭活作用进行评价，知道是否对病毒具有吸附和杀灭作用；并对多种催化材料进行了病毒吸附及灭活实验。
3.运用吸附-洗脱-接种鸡胚再增殖试验的办法来评价固体材料对病毒的吸附、灭毒效果(具体地说，病毒在固体吸附剂上吸附后，用水或生理盐水一次或多次洗脱，对洗脱液采用鸡胚再增殖试验病毒是否有活性的办法)；针对SARS病毒，选用与其性质类似的副流感病毒(PIV)、流感病毒(IV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒(AdV)等进行催化剂吸附与灭活病毒的实验研究。对催化剂吸附病毒后的洗脱液进行血凝试验，以血凝效价对催化剂的吸附能力进行评价；经纳米催化剂吸附作用于病毒后先后三次洗脱病毒液经100倍稀释后接种于9-11日龄鸡胚(尿囊腔)，孵育后收获尿液测病毒血凝效价，并与接种前的血凝效价进行比较、孵育，取出鸡胚置4℃过夜，次日收获尿液测病毒血凝效价，并与接种前的血凝效价进行比较，以证明病毒增殖状况，判定病毒是否被灭活。
图1带病毒的气溶胶发生器；图2玻璃微球的DNA洗脱液CE图；图3普通分子筛的DNA洗脱液CE图；图4吸附性能较强的催化材料DNA洗脱液CE图；图5慢吸附催化材料的DNA洗脱液CE图；图6弱吸附催化材料的DNA洗脱液CE图。
具体实施例方式
实施例1.
DNA分子制备本实例所用的DNA分子为K-ras基因第一外显子中一段长为211bp的DNA片段，由荧光(6-FAM，也可以用其它荧光素标记，如HEX，TET，ROX等)标记的引物经聚合酶链反应(PCR)扩增而成；PCR反应体积为50μl，包括1μl模板DNA(100ng)，5μl PCR缓冲液，4μl dNTP混合物，1.5U Taq DNA聚合酶，PCR引物各25Pmol，去离子水适量；PCR反应条件为96℃预变性5min，然后94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后，72℃再延伸7min，4℃放置。
催化材料的DNA分子吸附实验将上述的PCR产物用去离子水稀释成30倍的DNA分子原液。然后称取0.2-0.3g催化材料，使之在表面皿上均匀铺开。取50μl的DNA分子原液喷洒到催化材料表面，并调匀，分别过10min，20min后洗脱，离心过滤，取上清液进行分析。
在310型DNA全自动遗传分析仪上电泳，激光诱导荧光检测。筛分介质为短链线性聚丙烯酰胺凝胶[10]，涂层毛细管柱[11]50μm×47cm，进样时间和进样电压分别为5-50s，15kV，分离温度为50℃，分离电压15kV。
吸附量大于90％为强吸附，60％-90％为中等吸附，小于60％为弱吸附。
病毒气溶胶的阻留与吸附实验副流感病毒(1∶1280)0.1ml置气溶胶发生器内，以每秒按开关进行1次喷雾，共喷雾气溶胶120次，形成的病毒气溶胶通过两层200目孔不锈钢网(于两层200目不锈钢网之间加每种不同纳米催化材料2g，铺平约4.5-5.0mm)，收集在2.0ml生理盐水中，立即测试病毒的血凝效价。
实施例2.玻璃微球对DNA分子吸附能力的评价玻璃微球表面光滑，原理上对DNA分子无吸附能力。经其吸附后的洗脱液中DNA分子的含量应该与DNA分子原液相近，我们的实验也得到了预想的结果；如图2所示，未经纯化处理的玻璃微球对DNA分子有少量吸附，经过乙醇和水清洗的玻璃微球对DNA分子无吸附，这也说明所建立的方法可用于纳米催化材料的DNA吸附能力评价。
实施例3.分子筛对DNA分子吸附能力的评价5A分子筛是一种常见的吸附剂，对DNA分子应该有一定的吸附作用，但不会太强。我们也用上述方法对5A分子筛的DNA分子吸附性能进行了考察，与预期效果完全一致(图3)；与此同时，我们还比较了水洗脱及甲醇/水(1∶1)洗脱的效果，发现两种洗脱方法的效果相近，因此对所有材料的DNA吸附能力评价均选用水洗脱。
实施例4.固体材料对DNA分子吸附能力的评价大部分都具有不同程度的吸附能力，对DNA分子也应有不同程度的吸附；因此本实验用此法对近百种催化材料进行了吸附实验；结果表明，大部分吸附性能强的催化材料在10min内即可将DNA完全吸附(图4)，少部分需要近20min分钟才能吸附完全(图5)，对DNA分子吸附性能较差的催化材料在20min后，其洗脱液中仍然含有大量DNA分子(图6)。
实施例5.纳米催化剂细胞毒试验本实验所用的细胞株为白血病耐药细胞株(K562/A)和白血病敏感细胞株(K562/S)，分别将K562/A和K562/S制成2×105个/ml和1×105个/ml的细胞悬液。每种催化材料均制成三个浓度梯度原液(1000ug/ml)、1/10原液(100ug/ml)、1/100原液(10ug/ml)。取各催化材料样品100μL和细胞100μL加入96孔细胞培养板，催化材料的三个剂量(绝对量)100μg、10μg、1μg来确定其细胞毒范围；将96孔细胞培养板放入CO2孵箱孵育24h，显微镜下观察细胞形态。
实施例6.纳米催化剂吸附与灭活病毒试验
1)方法称取催化剂1g于无菌瓶中，加病毒液(1∶1280)0.1ml于室温混合作用30min，每10min振荡2min，共操作3次，加入2ml无菌生理盐水，立即混匀振荡2min 1000r/min离心5min。吸取洗脱病毒液进行血凝试验，同时吸取0.1ml稀释100倍后，取0.1ml接种9-11日龄鸡胚(尿囊腔接种)，置37℃孵箱孵育72h后收集尿液测病毒血凝效价，并与培养前的血凝效价进行比较，以证明病毒增殖状况，判定病毒是否被灭活。
2)结果催化剂吸附病毒液30min后，用2ml生理盐水振荡2min洗脱病毒，离心后收集洗脱液1；然后加3ml生理盐水轻微摇动以洗脱游离的病毒，离心后收集洗液2；最后加2ml生理盐水，混匀后强振荡3次，每次2min。每隔10分钟振荡1次，离心后收集洗脱液3。将三种洗液分别测血凝效价(表1)，然后用洗脱液1和洗脱液3分别接种9-11日龄鸡胚，进行病毒增殖；3天后收获尿囊液测病毒血凝效价，结果如表2。
表1 催化剂吸附病毒的3次洗脱液血凝效价
表2 洗脱液接种鸡胚前后的血凝效价比较
催化材料对副流感病毒的吸附-洗脱-接种鸡胚再增殖试验的结果表明，ASC-28和AB-2-1两种纳米催化材料具有吸附与灭活副流感病毒的作用。其中ASC-28吸附病毒后洗脱液能查出少量病毒(1∶20)，但接种鸡胚后无病毒增殖，证明病毒已被灭活。AB-2-1的洗脱液接种鸡胚前后均为阴性，证明病毒完全被吸附并已被灭活。实验中也有在洗脱液中有少量病毒存在，但保持活性，经接种鸡胚增殖后血凝效价呈升高趋势，如ASC-32和DSA-4接种前血凝效价分别为1∶60和1∶40，接种鸡胚后增殖，血凝效价均上升为1∶1280，说明这种吸附并不能灭活病毒。
发明效果选用核酸分子及副流感病毒作为探针和模拟对象，进行了纳米催化材料吸附、灭活病毒的实验研究。结果表明，选用DNA分子作为探针，可对研制的纳米催化材料的吸附能力进行快速地筛选及评价，可为进一步的病毒模拟实验提供依据。副流感病毒实验的结果表明，应用本发明评价的101种纳米催化材料中，发现两种材料具有吸附与灭活副流感病毒的作用。其中一种吸附病毒后洗脱液能查出少量病毒，但接种鸡胚后无病毒增殖，证明病毒已被灭活。另一种的洗脱液接种鸡胚前后均为阴性，证明病毒完全被吸附并已被灭活。说明我们所建立的方法完全适用于对催化材料过滤、吸附及灭活病毒的评价。
权利要求
1.过滤、吸附及灭活病毒的纳米催化材料的快速筛选方法，其特征在于1)以100～1000个碱基的核酸分子片段作为探针，采用喷洒或浸泡的方式将核酸分子吸附于催化剂上，然后用不少于探针原液9倍的水进行洗脱，筛选出吸附能力强的、即吸附量为原液重量60％)以上的催化剂；2)将上述步骤选取的催化剂对目标病毒进行吸附、洗脱，对催化剂用水或生理盐水一次或多次洗脱，然后对洗脱液中的病毒进行传统的活性检测；筛选出对病毒的过滤、吸附及灭活作用好的、即吸附量为原液重量95％的催化剂。
2.按照权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于所述的探针为核酸分子。为了提高灵敏度，可采用荧光标记的办法。
3.按照权利要求2所述的快速筛选方法，其特征在于所述的核酸分子是采用PCR方式制备而成。
4.按照权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于所述步骤1)中的洗脱液的检测是采用毛细管电泳方法，其采用的筛分介质为线性聚丙烯酰胺凝胶。
5.按照权利要求4所述的快速筛选方法，其特征在于所述毛细管电泳方法具体操作条件为，线性聚丙烯酰胺凝胶涂层毛细管柱50μm×47cm，进样电压为15kV，分离温度为50℃，分离电压15kV。
6.按照权利要求1所述的快速筛选方法，其特征在于所述目标病毒也可以为与其性质类似的病毒，所述性质类似是指直径大小相近、包膜的结构相似。
7.按照权利要求6所述的快速筛选方法，其特征在于所述目标病毒为SARS病毒，性质类似的病毒副流感病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒等。
8.一种按照权利要求1所述的快速筛选方法的专用装置，其特征在于步骤2)中催化剂对目标病毒的吸附过程是在气溶胶发生器进行的，气溶胶发生器由空气气瓶(1)、三通(4)、吸附腔(7)、病毒样品容器(8)构成，具体为空气气瓶(1)经减压表(2)和净化管(3)接三通(4)的进气口，三通(4)的一出气口经数字调节阀(5)和压力表(6)接吸附腔(7)中上部，三通(4)的另一出气口经喷雾量调节阀(8)接吸附腔(7)上端，在喷雾量调节阀(8)和吸附腔(7)之间的管路上连接有病毒样品容器(8)和喷雾开关(9)，吸附腔(7)下端带有排气口，排气口插入吸液瓶(10)中；所述吸附腔(7)上部为可拆卸的有机玻璃套管，中下部装有不锈钢纱网(11)，纱网(11)上装催化剂(12)，催化剂(12)上盖有纱布(13)。
全文摘要
本发明涉及催化材料，具体地说是一种过滤、吸附及灭活病毒的纳米催化材料的快速筛选方法，具体操作为1)以100～1000个碱基的核酸分子片段作为探针，采用喷洒或浸泡的方式将核酸分子吸附于催化剂上，然后用不少于探针原液9倍的水进行洗脱，筛选出吸附能力强的、即吸附量为原液重量60％)以上的催化剂；2)将上述步骤选取的催化剂对目标病毒进行吸附、洗脱，对催化剂用水或生理盐水一次或多次洗脱，然后对洗脱液中的病毒进行传统的活性检测；筛选出对病毒的过滤、吸附及灭活作用好的、即吸附量为原液重量95％的催化剂。本发明首先以核酸分子作为探针，建立了对纳米催化材料吸附性能和抗水性能进行快速筛选和评价的方法。
文档编号G01N33/00GK1553180SQ0313353
公开日2004年12月8日 申请日期2003年5月31日 优先权日2003年5月31日
发明者许国旺, 明平文, 杨凌, 刘中民, 张卓然, 赵春霞, 马磊, 许磊, 齐越, 孙承林, 韩秀文, 陈研, 曲振平, 缪少军, 郑丛龙, 赵欣捷, 杜逊甫, 刘波, 孔宏伟, 王畅, 叶芬, 胡刚, 刘宇新, 刘页, 张涛, 黄向阳, 包信和 申请人:中国科学院大连化学物理研究所