一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法
【专利摘要】本发明涉及一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法，具体涉及一种用14L生物反应器大规模培养轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：1)Vero细胞的复苏与传代，2)细胞收集与接种生物反应器，3)细胞的生物反应器培养，4)换液与细胞的洗涤，5)轮状病毒的活化及感染，6)轮状病毒的维持培养及收获；本发明的一个目的在于解决大规模轮状病毒疫苗生产中轮状病毒不易释放出细胞导致获得的病毒毒力滴度低的缺陷，从而获得了高滴度轮状病毒病毒，极大地提高了轮状病毒的产量；另一个目的在于解决大生产过程中轮状病毒的吸附感染力度低的缺陷，从而极大地提高了轮状病毒质量，进而提升轮状病毒灭活疫苗的抗原性和免疫原性。
【专利说明】
一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法
技术领域：
[0001] 本发明属于制备病毒灭活疫苗的方法，特别是涉及一种用14L生物反应器大规模 培养轮状病毒的方法。
【背景技术】：
[0002] 轮状病毒是全球导致婴幼儿发生严重脱水性腹泻（severe dehydrating diarrhea)的主要病原体。几乎所有的儿童在2~3岁之前都被轮状病毒感染过。甚至在卫生 水平很高的发达国家，轮状病毒也是导致严重腹泻最常见的病原体。据报道，轮状病毒引起 的腹泻约占秋季腹泻的50%。全世界每年因轮状病毒感染可导致就诊的约2400万人次，其 中约有230万人次住院治疗，约有60万人死亡轮状病毒感染。通过全球范围内的多方努力， 在发展中国家推广的口服补液治疗降低了腹泻死亡率。然而，不断出现的与轮状病相关的 死亡病例(每天约1200~1600例）告诉我们，只有通过广泛使用安全、经济且有效的疫苗，才 能显著降低轮状病毒感染所致的患病率和死亡率。
[0003] 目前，国内外先后开发上市的轮状病毒疫苗均为口服了轮状病毒减毒活疫苗，包 括GSK公司的单价减毒活疫苗Rotarix，Merck公司生产的5价重配减毒活疫苗RotaTeq，越南 生产的单价减毒活疫苗Rotavin-Ml，以及国内兰州生物制品研究所生产的单价羊株减毒活 疫苗罗特威。迄今为止，尚未有轮状病毒灭活疫苗生产。从预防免疫角度来讲，轮状病毒活 疫苗虽然起到了一定的免疫和预防作用，但由于疫苗的成份为活病毒，在应用过程中，极易 与机体在自然界中获得的轮状病毒进行重配，进而肯能演变成新的轮状病毒株，或者，疫苗 活病毒株在特殊情况下可能发生返祖现象。因此，轮状病毒活疫苗对人体具有潜在的感染 性，对自然界产生新的未知病毒种类风险。为了避免以上风险，轮状病毒灭活疫苗的开发势 在必行。
[0004] 据报道，中国医学科学院医学生物学研究所已开展了轮状病毒灭活疫苗的研究 (专利申请号200710065708.5 )，采用的人二倍体细胞培养，培养规模仅是在培养瓶上小规 模培养。兰州生物制品研究所开展的轮状病毒灭活疫苗研究（专利申请号 200510041858.3)，采用的是细胞培养瓶小规模的培养原代细胞或Vero细胞，尚未实现疫苗 的规模化生产。
[0005] 轮状病毒灭活疫苗大规模生物反应器产业化生产不同于小规模的培养瓶培养工 艺疫苗生产，有许多需要攻克的技术难点，具体如下：
[0006] 1、传统的利用培养瓶培养轮状病毒过程中，是将感染后的细胞培养了数天后，将 细胞与培养液进行反复冻融，使细胞破碎，将病毒释放到培养液中。这样的病毒培养及收获 方式不仅繁琐、费时费力，而且培养工艺不易大规模产业化。然而，传统工艺中，如果不破碎 细胞，仅收获上清的培养液，其病毒毒力滴度却很低。所以，要想利用生物反应器大规模培 养轮状病毒，首先需解决不采用冻融细胞的方式，而又能够获得高毒力滴度的病毒收获液。
[0007] 2、轮状病毒是温和式病毒，相较于其他病毒而言，培养过程中不能很好地释放到 细胞外，在传统小规模培养过程中该缺点不明显，但工业化大生产过程中，轮状病毒不易释 放出细胞的缺陷被放大，导致获得的病毒毒力滴度很低，因此需要对工艺进行摸索改进，以 提高收获液的产量。
[0008] 3、轮状病毒吸附感染细胞的前提是轮状病毒的VP4(-种轮状病毒蛋白）活化成 VP5和VP8，这一活化过程需要胰蛋白酶和Ca++参与，而细胞培养基中的某些成分，如牛血清， 终止胰蛋白酶的作用或影响Ca ++的参与，导致病毒吸附感染作用减弱，所以如何改善培养条 件从而如何提高轮状病毒吸附感染也是轮状病毒疫苗大生产过程中的难题。
【发明内容】
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[0009] 本发明涉及一种规模化生产轮状病毒灭活疫苗的方法，具体涉及一种用14L生物 反应器大规模培养轮状病毒疫苗的方法。本发明的一个目的在于解决大规模轮状病毒疫苗 生产中轮状病毒不易释放出细胞导致获得的病毒毒力滴度低的缺陷，从而获得了高滴度轮 状病毒病毒，极大地提高了轮状病毒的产量。本发明的另一个目的在于解决大生产过程中 轮状病毒的吸附感染力度低的缺陷，从而极大地提高了轮状病毒质量，进而提升轮状病毒 灭活疫苗的抗原性和免疫原性。
[0010] 本发明所述的规模化生产轮状病毒灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
[0011] l)Vero细胞的复苏与传代:将Vero细胞加入细胞生长液后放入到C02培养箱中培 养，细胞长成单层后，消化贴壁细胞，并制成均匀的细胞悬液，分种于培养瓶中，然后加入细 胞生长液继续培养，细胞在培养瓶中传代3次，最后一次使用细胞工厂培养细胞。
[0012] 2)细胞收集与接种生物反应器：当第三次传代的细胞长满单层后，对每一瓶的贴 壁细胞用消化液进行消化，并将细胞收集到接种瓶中，从瓶中取样计数细胞，接种于事先加 入细胞生长液和载体的14L的生物反应器中。
[0013] 3)细胞的生物反应器培养:细胞接种后，采用灌流的方式加进细胞生长液，同时排 除细胞培养废液，并且每天从反应器中取样计数细胞，细胞生长液是含有6 %牛血清的M199 培养液；
[0014] 4)换液与细胞的洗涤：当细胞达到5.4~6.4\106(^118/1111时，更换生物反应器的 进液，即由不含牛血清的细胞维持液更换含有牛血清的细胞生长液，继续灌流培养；
[0015] 5)轮状病毒的活化及感染：生物反应器中换为细胞维持液后24小时，调整生物反 应器的控制条件，维持1~4小时后，取样计数细胞，并将Μ0Ι值控制在0.05~0.5接种活化后 的轮状病毒种子；
[0016] 6)轮状病毒的维持培养及收获:毒种接种后采用连续灌流的方式进行培养，并调 整生物反应器培养条件，每天从反应器中取样并用胶体金试纸卡检测，检测卡样品条带颜 色深浅与阳性条带相同，开始连续收获病毒液，检测卡样品条带颜色深浅度低于阳性条带 颜色深浅度，停止收获病毒液。
[0017] 具体地，步骤1)所述的细胞生长液组成成分为含有6 %~10 %牛血清的M199培养 液。
[0018] 具体地，步骤2)所述的细胞接种的分种率为1:3~1:4。
[0019] 具体地，步骤2)所述的载体为球状微载体或者片状载体，所述细胞生长液是:含有 6 %牛血清的Ml 99培养液。
[0020] 优选地，步骤2)所述的球状微载体为Cytodexl，0}^〇(1612,〇71:〇(1613中的一种。
[0021] 具体地，步骤3)所述的14L生物反应器的培养条件为，温度:37.0°C ;pH: 7.3;溶氧： 35%〇
[0022] 具体地，步骤3)所述的14L生物反应器培养的灌流速度:0.5~1.5WV/D。
[0023] 具体地，步骤4)所述的不含牛血清的细胞维持液组成成分为含有0.5ug/ml胰蛋白 酶的Ml 99培养液。
[0024] 具体地，步骤4)所述的灌流培养的灌流速度为5~7WV/D。
[0025] 具体地，步骤5)所述活化后的轮状病毒种子，采用的活化母液为含有胰蛋白酶终 浓度 1 〇_20ug/ml，Ca++终浓度40~80ug/ml 的D-Hank ' s溶液。
[0026]具体地，步骤5)所述的生物反应器的控制条件为:温度34.0~36.5°C，pH值7.3~ 7.6,溶氧 20%~30%;
[0027]具体地，步骤6)所述的生物反应器维持培养条件为:温度：36.5~37.0 °C，pH: 7.3 ~7.4，溶氧:30 %~50 %，采用连续灌流的灌流速度为1.0~1.5WV/D。
[0028] 本发明涉及一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法，优点如下：
[0029] 1)本发明克服了传统的利用培养瓶或细胞工厂静止培养轮状病毒的缺陷，采用 14L生物反应器培养轮状病毒的方法大大地提高了轮状病毒的产量和质量，每14L生物反应 器单次培养收获病毒液65~75L，相当于85~90个3L转瓶培养收获的病毒总量；35~40个 10L转瓶培养收获的病毒总量;30~35个10层细胞工厂培养收获的病毒总量。生物反应器培 养获得的轮状病毒液的毒力滴度平均为7.0~7.51gCCID50/ml，而转瓶或细胞工厂培养收 获轮状病毒液，其毒力滴度一般在6.0~7.01gCCID 5Q/ml，提高近1个数量级。生物反应器培 养的抗原含量平均为2.5ug/ml，而利用培养瓶或细胞工厂培养的轮状病毒抗原含量一般不 高于 2 · Oug/ml。
[0030] 2)本发明采用连续灌流的方式进行轮状病毒的增殖培养以及连续收获轮状病毒 上清液，不同于细胞培养瓶或细胞工厂培养病毒时，一次性收获，并需要连同细胞一起收 获，再进行冻融、离心，收取病毒上清，本发明避免了冻融细胞，离心收获病毒的繁琐工艺步 骤，更有利于工业化大生产。
[0031] 3)轮状病毒与其他剧烈式病毒不同，它是一种温和式病毒，不易从细胞内释放出 来，在大生产过程中此缺陷会进一步放大，本发明通过大量实验，调整大生产过程中的各项 反应参数，使细胞持续性的裂解衰亡，释放出病毒，进而可以连续收获高毒力滴度的轮状病 毒液；
[0032] 4)轮状病毒吸附感染细胞的前提是轮状病毒的VP4(-种轮状病毒蛋白）活化成 VP5和VP8，这一活化过程需要胰蛋白酶和Ca++参与，而细胞培养基中的某些成分，如牛血清， 终止胰蛋白酶的作用或影响Ca++的参与，导致病毒吸附感染作用减弱。本发明在生物反应器 培养Vero细胞的后期，采用连续洗换的方式，将细胞培养液(含有一定浓度的牛血清)更换 成了无血清的细胞维持液，并相应地增加了 Ca++，并在病毒种子接种到生物反应器内的同 时，调整生物反应器的控制条件，使细胞状态达到一种"病态"，同时将这种"病态"需要控制 在一定的时间内（2~3小时），使病毒更容易感染细胞，本发明贴合轮状病毒温和性的特点， 通过调整培养条件有效提高了轮状病毒的吸附感染力度。
[0033] 5)轮状病毒吸附感染细胞之后，及时调整生物反应器的控制条件，改善细胞的营 养环境和状态环境，使Vero细胞保持良好的生长状态，一方面有利于病毒的增殖，另一方面 保障细胞可以较长时间维持新陈代谢，即较长时间的作为病毒的"培养基"，进而提高病毒 产量。其实，病毒感染细胞后，病毒增殖与细胞保持良好的状态是一对矛盾，平衡好这对矛 盾，就会提高病毒的产量和质量。通过大量的试验，我们特别针对轮状病毒温和的特性，建 立了克服这对矛盾的办法。首先，通过调整是细胞培养的营养环境，增强传质和传氧能力， 如采用连续灌流的补液和收获方式，提高了传质能力;改善反应器的搅拌转速，以及换气次 数和维持合适的罐内压，提高了传氧能力等等。其次，通过调整细胞培养的状态环境，改善 细胞培养环境，如及时调整合适的培养温度，维持稳定的培养液酸碱度，采用无泡式通气等 等。通过维持良好的营养环境和状态环境，不仅提高了病毒在细胞中的增殖，并且充分地释 放到培养液中，而且维持良好细胞状态，也为提高病毒的产量奠定了良好的基础。
[0034] 综上所述，本发明可利用14L生物反应器培养轮状病毒，克服了培养瓶或细胞工厂 培养过程中，需要一并收获细胞及培养液，进行冻融后还需要离心，污染风险极大，不利于 疫苗规模化的生产的缺陷，特别针对温和性轮状病毒设计各反应参数，大大地提高病毒毒 力和抗原含量，并且病毒液的收获也大幅提高，收获的上清液仅需要简单的管道连接式的 微滤就可进行后续的纯化了，污染风险极小，适合规模化产业化生产疫苗生产的理念。
【附图说明】：
[0035] 图1:胶体金试纸卡样品色带与标准色带的比较说明图；
[0036]卡上标示:C为标准色带；T为样品色带；S为加样孔；1号上样卡为样品色带浅于标 准色带;2号上样卡为样品色带与标准色带相近;3号上样卡为样品色带深于标准色带。 具体实施例：
[0037]实施例1:轮状病毒液的制备
[0038] l)Vero细胞的复苏与传代:装有Vero细胞工作种子(细胞来源于ATCC，细胞工作种 子为自制）的冻存管从液氮中取出后，快速放入40 °C的水浴中融化，然后在超净台中取出细 胞悬液，加入细胞培养瓶中，并加入细胞生长液，放入到C02培养箱中培养;细胞长成单层 后，将贴壁细胞进行消化，并制成均匀的细胞悬液，按照1:3的分种率，接种于细胞瓶中，加 入细胞生长液后，放入到C02培养箱中继续培养，本次细胞接种生物反应器前传代3次，最后 一次使用的是10层细胞工厂培养；
[0039] 2)细胞收集与接种生物反应器：当第三次传代的细胞长满单层后，对贴壁的细胞 用消化液进行消化，并将细胞收集到接种瓶中，从瓶中取样计数细胞，然后将细胞接种于事 先加入6%牛血清的M199培养液(细胞生长液)和载体Cytodexl的14L生物反应器中；
[0040] 3)细胞在生物反应器内培养：细胞接种后，设置培养条件为，温度：36.8 °C; pH: 7.2;溶氧:35 % ;灌流速度:1.5WV/D。每天从反应器中取样计数细胞，继续培养。
[0041 ] 4)换液与细胞的洗涤：当细胞计数为6.4 X 106cellS/ml时，更换生物反应器的进 液，生物反应器的进液为:含有0.5ug/ml胰蛋白酶的M199培养液，并加大灌流速度(6WV/D) 继续灌流培养；
[0042] 5)轮状病毒的活化及感染:毒种接种生物反应器之前，需要将病毒种子活化，即按 照胰蛋白酶终浓度为20ug/ml，Ca++终浓度为80ug/ml，向毒种液中加入活化母液，然后，放置 在37°C培养箱中孵育1.5小时，用于接种生物反应器内，以感染细胞;而在生物反应器换液 后24小时，调整生物反应器的控制条件为:温度36.0°C，pH值7.5，溶氧20 %，维持灌流速度 为1.5WV/D，这种状态维持在2小时，然后取样计数细胞，按照MOI为0.3接种活化后的病毒种 子；
[0043] 6)轮状病毒的维持培养及收获:毒种接种后，调整培养条件为，温度:37.0°C;pH: 7.3;溶氧:45% ;连续灌流的灌流速度：1. OWV/D。每天从生物反应器中取样，并用胶体金试 纸卡检测，感染后第4天，检测卡样品条带颜色深浅与阳性条带相近，便开始连续收获病毒 液，检测卡样品条带颜色深浅度低于阳性条带颜色深浅度，这时停止收获病毒液，总收获液 约 75L。
[0044] 轮状病毒毒力滴定与抗原检测:每天从生物反应器中取的样，以及总的收获液(收 获合并液)取样，利用轮状病毒检测细胞MA104细胞进行病毒毒力的滴定(滴度检测），利用 ELISA试剂盒检测轮状病毒抗原含量。本次病毒合并液的滴度达7.31gCCID5Q/ml，抗原含量 达2.5ug/ml〇
[0045] 实施例2:
[0046] 14L生物反应器培养轮状病毒疫苗的方法，制备方法同实施例1所示，其中步骤4) 所述的生物反应器进液，以及更换液体的灌流速度，对生物反应器生产轮状病毒也有一定 的影响，具体如表1所示。
[0047] 表1:
[0049] 结论:如表1所示，组1与组5比，组5仅仅是没有换液，即一直使用含6%牛血清细胞 生长液作为感染后的细胞维持液，但胶体金试剂盒检测的结果是，感染后10天，取样的检测 条带颜色还远浅于阳性条带的颜色，病毒滴度和抗原含量也都非常低。所以感染前是否更 换成不含血清的维持液，以及更换维持液的彻底性，会直接影响收毒的效果，同时，灌流速 度为5-7WV/D，病毒滴度和抗原含量含量较高。
[0050] 实施例3:
[00511 14L生物反应器培养轮状病毒疫苗的方法，制备方法同实施例1所示，其中步骤5) 所述的病毒种子活化与生物反应器换液后24小时到细胞感染期间的生物反应器控制条件 如表2所示。
[0052]表2:
[0054]结论:如表2所示，组1-3收获的轮状病毒合并液可达65L以上，收液的病毒滴度达 到7.01gCCID5Q/ml以上，抗原含量达2.2ug/ml以上，符合大规模生产要求，其中组1 (即为实 施例1)的轮状病毒合并液的滴度及抗原含量最优。而组4，组5收获的的收获液，收获液的病 毒滴度较低，抗原含量也较低，因此，步骤5)所述的生物反应器的控制条件为:温度34.0~ 36.5°C，pH值7.3~7.6，溶氧20%~30%，这种状态维持1~4小时；
[0055] 实施例4:
[0056] 14L生物反应器培养轮状病毒疫苗的方法，制备方法同实施例1所示，其中步骤6) 所述的感染后维持培养的控制条件和病毒收获情况如表3所示。
[0057] 表3:
[0058]
[0059]结论:如表3所示，组1-3收获的轮状病毒合并液可达65L以上，收液的病毒滴度达 到7.01gCCID5Q/ml以上，抗原含量达2.2ug/ml以上，符合大规模生产要求，其中组1 (即为实 施例1)的轮状病毒合并液的滴度及抗原含量最优。而组4，组5收获的的收获液，不仅病毒收 获液的体积较少，而且收获液的病毒滴度较低，抗原含量也较低，因此，步骤6)所述的培养 条件，温度：36.5~37.0°C，pH: 7.3~7.4，溶氧：30 %~50 %，采用连续灌流的灌流速度为 1.0~1.5WV/D〇
【主权项】
1. 一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法，包括以下步骤： 1. Vero细胞的复苏与传代:将Vero细胞加入细胞生长液后放入到C02培养箱中培养，细 胞长成单层后，消化贴壁细胞，并制成均匀的细胞悬液，分种于培养瓶中，然后加入细胞生 长液继续培养，细胞在培养瓶中传代3次，最后一次使用细胞工厂培养细胞； 2) 细胞收集与接种生物反应器：当第三次传代的细胞长满单层后，对每一瓶的贴壁细 胞用消化液进行消化，并将细胞收集到接种瓶中，从瓶中取样计数细胞，接种于事先加入细 胞生长液和载体的14L的生物反应器中； 3) 细胞的生物反应器培养:细胞接种后，采用灌流的方式加进细胞生长液和排除细胞 培养废液，并且每天从反应器中取样计数细胞，所述细胞生长液是含有6 %牛血清蛋白的 Ml 99培养液； 4) 换液与细胞的洗涤：当细胞达到5.4~6.4 X 106cellS/ml时，更换生物反应器的进液， 即由不含牛血清的细胞维持液更换含有牛血清的细胞生长液，继续灌流培养； 5) 轮状病毒的活化及感染:生物反应器中换为细胞维持液后24小时，调整生物反应器 的控制条件，维持1~4小时后，取样计数细胞，并将M0I值控制在0.05~0.5接种活化后的轮 状病毒种子； 6) 轮状病毒的维持培养及收获:毒种接种后采用连续灌流的方式进行培养，并调整生 物反应器培养条件，每天从反应器中取样并用胶体金试纸卡检测，检测卡样品条带颜色深 浅与阳性条带相同，开始连续收获病毒液，检测卡样品条带颜色深浅度低于阳性条带颜色 深浅度，停止收获病毒液。2. 如权利要求1所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤1)所述的细 胞生长液组成成分为含有6 %~10 %牛血清的M199培养液。3. 如权利要求2所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤2)所述的细 胞接种的分种率为1:3~1:4。4. 如权利要求3所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤3)所述的 14L生物反应器的培养条件为，温度:37.0 °C ; pH: 7.3;溶氧:35 %。5. 如权利要求4所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤3)所述的 14L生物反应器培养的灌流速度:0.5~1.5WV/D。6. 如权利要求5所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤4)所述的不 含牛血清的细胞维持液组成成分为含有0.5ug/ml胰蛋白酶的M199培养液。7. 如权利要求6所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤4)所述的灌 流培养的灌流速度为5~7WV/D。8. 如权利要求7所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤5)所述活化 后的轮状病毒种子，采用的活化母液为含有胰蛋白酶终浓度10_20ug/ml，Ca++终浓度40~ 80ug/ml 的 D-Hank' s 溶液。9. 如权利要求8所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤5)所述的生 物反应器的控制条件为:温度34.0~36.5°C，pH值7.3~7.6，溶氧20%~30%。10. 如权利要求9所述的规模化生产轮状病毒疫苗的方法，其特征在于，步骤6)所述的 生物反应器维持培养条件为:温度:36.5~37.0 °C，pH :7.3~7.4,溶氧:30%~50%，采用连 续灌流的灌流速度为1.0~1.5WV/D。
【文档编号】C12N7/00GK105969737SQ201610338801
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】李云富, 李刚, 黄勇, 付臻鹏, 刘春庭, 罗翀, 胡雪芹, 肖俊光
【申请人】丽珠集团疫苗工程股份有限公司