一种脐血淋巴细胞dc-cik的培养方法
【专利摘要】本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别公开了一种脐血淋巴细胞DC?CIK的培养方法。本发明以脐血为处理对象，经过脐血单个核细胞的分离、DC细胞的分离培养、CIK细胞的诱导培养、DC和CIK的共培养制备DO?DIK细胞，并添加CTLA?4mAb和PD?1mAb，最后离心收集成熟的DC?DIK细胞，得到产品。本发明通过用CD3mAb包被培养瓶，培养前期连续刺激，减少了细胞因子的使用，提高效应细胞群活化效率和扩增效率，同时降低了培养成本。
【专利说明】
_种胳血淋巴细胞DG-GIK的培养方法 (一)
技术领域
[0001 ]本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种脐血淋巴细胞DC-CIK的培 养方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞(具有特异免疫力）或其产物输给细胞免疫功 能低下者(如肿瘤病人），提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗和预防复发的目的。
[0003] 树突状细胞(Dendritic cel Is)是体内功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答 的中心环节，能够将抗原递呈给T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的杀伤作用。
[0004] 细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cells，CIK)是将人外周血 或者脐血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同 培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分 子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限 制性杀瘤优点。然而NKT细胞在正常的脐血中含量极低，仅为1 %左右。因此，在体外培养中， 提高CIK细胞的绝对数量和其中的NKT细胞的比例对提高临床治疗效果至关重要。
[0005] DC-CIK细胞是指将肿瘤抗原诱导成熟的DC细胞与CIK细胞共培养，既可以促进DC 细胞的成熟，又能增强CIK细胞的细胞毒T细胞的含量，从而发挥对肿瘤特异性的杀伤作用， 达到清除肿瘤微小病灶的目的。有研究表明，脐血来源的DC-CIK细胞和外周血来源的DC-CIK细胞相比，有更高的增殖倍数、更强的杀瘤活性和低的免疫原性。
[0006] 肿瘤组织的免疫逃逸性就是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和 攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现 恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些"非己"细胞，抵御肿瘤的 发生发展。然而，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速 增殖，形成肿瘤。也就是说:一方面，机体可通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤的发生；另一方 面，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。其分子机理在于免疫T细胞包括 CIK细胞，在其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一旦与其相应的配体结合，就能产 生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。生物体通过这一机制来控制T细胞的杀伤作用， 以避免它们攻击自身细胞，产生自身免疫反应。而CTLA4、H)-1分子就是这类受体。在免疫T 细胞被激活、扩增的各个步骤中，一旦遭遇到表达着辅助激活配体(B7-1、⑶80和⑶86)的树 突细胞或肿瘤细胞时，激活的T细胞通过提高CTLA-4、PD-1分子的表达，其中CTLA-4分子使 之替代CD28与B7-1结合，而PD-1分子与PD-L分子接合，从而提高了 T调节细胞的负调节功 能，降低T细胞的杀伤功能。
[0007] 目前现有的DC-CIK技术的不足：（1)一般的CIK制备方法是将分离的脐血单个核细 胞(PBMC)用IFN-γ处理24小时后，加入CD3mAb，IL-la和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得 一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增值倍数和有效细胞含量都不够理想；（2)在 肿瘤的微环境中CIK细胞表面CTLA4和ro-1的表达量升高，与DC上的相应配体接合，从而介 导免疫负调控机制，抑制CIK细胞的杀伤功能。现有的DC-CIK技术没有考虑到T调节细胞含 量对肿瘤免疫逃逸的影响。用CTLA-4和PD-1单克隆抗体来抑制T调节细胞在理论上和实验 中均得到证实。 (三)
【发明内容】
[0008] 本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、细胞杀伤活性大的脐血 淋巴细胞DC-CIK的培养方法。
[0009] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0010] -种脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，以脐血为原始材料，包括如下步骤：
[0011] (1)从脐血中分离出脐血单个核细胞，重悬于GT-T551H3培养基中静置培养；
[0012] (2)从步骤（1)中制得的培养液中吸出悬浮细胞；贴壁细胞加入含有rhGM-CSF和 rhIL-4的GT-T551H3培养基，静置培养;第3天半量换GT-T551H3培养基，并补加 rhGM-CSF和 rhIL-4;第5天加入肿瘤特异性抗原刺激;第6天加入rhTNF-a，继续培养到第7天，得到DC细 胞；
[0013] (3)吸出的悬浮细胞放入CD3mAb包被过的培养瓶中静置培养，并在培养基中补加 IFN- γ及经灭活过的自体血浆;第2天补GT-T551H3培养基，同时添加 IL-2和经灭活过的自 体血浆；第3天补GT-T551H3培养基，同时添加儿-2和％经灭活过的自体血浆;第4天补GT-Τ551Η3培养基，同时添加 IL-2和经灭活过的自体血浆，培养至第7天，得到CIK细胞；
[0014] (4)将DC细胞和CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至培养袋中，补GT-T551H3培养 基，同时添加 IL-2、经灭活过的自体血浆、CTLA-4mAb和PD-lmAb，静置培养5-7天，得到DC-CIK细胞；
[0015] (5)第14天将培养好的DC-CIK细胞离心收集，并用氯化钠溶液洗涤，再向收集好的 细胞中加入人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定容，得到产品。
[0016] 本发明以脐血为处理对象，经过脐血单个核细胞的分离、DC细胞的分离培养、CIK 细胞的诱导培养、DC和CIK的共培养制备D0-DIK细胞，并添加 CTLA-4mAb和ro-lmAb，最后离 心收集成熟的DC-DIK细胞，得到产品。
[0017] 本发明的更优技术方案为：
[0018] 步骤（1)中，GT-T551H3培养基中，脐血单个核细胞的细胞浓度为（1-2) X 106个/ mL，静置培养2小时。
[0019] 步骤（2)中，贴壁细胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的GT-T551H3 培养基15mL，静置培养;第3天半量换GT-T551H3培养基，并补加 rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL;第5天加入肿瘤特异性抗原50ug/mL刺激;第6天加入rhTNF-a 500U/mL，继续培养 到第7天。
[0020] 步骤(3)中，悬浮细胞放入5ug/ml的⑶3mAb包被过的培养瓶中静置培养，并在培养 基中补加 IFN- γ 1000U/ml及1 %经过56°灭活过的自体血浆；第2天补GT-T551H3培养基 20ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆;第3天补GT-T551H3培养基 20ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆;第4天补GT-T551H3培养基 至240ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆，培养至第7天。
[0021]步骤(4)中，将DC细胞和CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，补 GT-T551H3培养基至1000ml，同时添加 IL-2 500U/mL，1 %经过56°灭活过的自体血浆，CTLA-4mAb lOOng/mLJD-lmAb 100ng/mL，静置培养5-7天。
[0022] 步骤(5)中，用0.9wt%氯化钠溶液洗涤收集的DC-CIK细胞2次，然后向DC-CIK细胞 中加入体积百分比为20 %的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt %氯化钠溶液定容至1 OOmL。
[0023] 所述静置培养的条件为在温度为37°C、C02体积百分比为含量为5%、相对饱和湿 度为100%的C0 2培养箱中培养。
[0024] 本发明中一些常用的术语说明如下：
[0025] IL-2:白细胞介素2;
[0026] IFN- γ :干扰素 γ ;
[0027] CD3mAb:细胞表面分子3单克隆抗体；
[0028] GM-CSF:重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；
[0029] rhTNF-a:转化生长因子a;
[0030] IL-4:白细胞介素4;
[0031 ] CTLA-4mAb: CTLA-4 单克隆抗体；
[0032] PD-lmAb:PD-l 单克隆抗体。
[0033] 与常规的培养方法相比，本发明的有益效果表现在以下几方面：
[0034] (1)本发明所述用于单个核细胞的分离来源于脐血，脐血单个核几乎没有受到细 菌、病毒等有害因素的影响，细胞更纯，安全性更高。和外周血来源的DC-CIK细胞相比，脐血 DC-CIK细胞有更高的增殖倍数、更强的杀瘤活性和低的免疫原性；
[0035] (2)本发明所述用于扩增CIK的方法采用了 5ug/ml⑶3单抗培养瓶包被技术;试验 表明，附着的单抗比游离的单抗对细胞的促有丝分裂作用更强，从而有助于提高了细胞的 扩增水平；
[0036] (3)本发明所述用于扩增CIK的方法采用了培养前4天小剂量，连续刺激的方法，能 够有效地提高细胞的增殖倍数；
[0037] (4)本发明在DC和CIK的共培养过程中添加了 CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-lmAb 100ng/mL可以有效抑制DC-CIK细胞中的抑制性T调节细胞的含量，提高DC-CIK细胞的杀伤 活性。
[0038] 本发明通过用CD3mAb包被培养瓶，培养前期连续刺激，减少了细胞因子的使用，提 高效应细胞群活化效率和扩增效率，同时降低了培养成本;特别是体外加载CTLA4抗体、PD-1抗体以覆盖所有CIK细胞表面的CTLA4JD-1分子，使其不能和DC上相应受体结合，有效的 降低了 T调节细胞的含量，进一步提高CIK细胞对肿瘤的杀伤作用。 (四）【附图说明】
[0039]图1为培养第0天CIK细胞⑶3+⑶56+细胞流式细胞仪检测结果；
[0040]图2为培养第0天CIK细胞⑶3+⑶8+细胞流式细胞仪检测结果；
[00411图3为培养第0天CIK细胞⑶4+⑶25+细胞流式细胞仪检测结果；
[0042]图4为培养第7天CIK细胞⑶3+⑶56+细胞流式细胞仪检测结果；
[0043]图5为培养第7天CIK细胞⑶3+⑶8+细胞流式细胞仪检测结果；
[0044]图6为培养第7天CIK细胞⑶4+⑶25+细胞流式细胞仪检测结果；
[0045]图7为培养第7天DC细胞⑶11C+HLA-DR+细胞流式细胞仪检测结果；
[0046]图8为培养第7天DC细胞⑶11 c+⑶83+细胞流式细胞仪检测结果；
[0047]图9为培养第7天DC细胞⑶11 c+⑶86+细胞流式细胞仪检测结果；
[0048]图10为培养第7天DC细胞⑶llc+⑶80+细胞流式细胞仪检测结果；
[0049]图11为培养第14天DC-CIK细胞⑶3+⑶56+细胞流式细胞仪检测结果；
[0050]图12为培养第14天DC-CIK细胞CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
[00511图13为培养第14天DC-CIK细胞CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果。 图14为DC-CIK细胞增殖曲线图。 (五)【具体实施方式】 [0052] 实施例：
[0053]本实施例所用试剂如下：
[0054] 脐血，购自山东省齐鲁干细胞工程有限公司
[0055] Ficoll，购自 GE 公司；
[0056] IL-2,购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0057] ⑶3mAb，购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0058] GM-CSF，购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0059] IL-4,购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0060] rhTNF-a，购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0061] IFN-γ，购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0062] CTLA-4,购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0063] PD-1，购自北京同立海源生物科技有限公司；
[0064] GT-T551H3 培养基，购自 TAKARA公司。
[0065]本实施例所采用的用于扩增DC-CIK的方法：
[0066] 1.脐血单个核的分离和培养
[0067] (1)将血样平均分装到50ml离心管中，每管分装体积不要超过45ml，2000rpm(升速 6、降速4)离心1〇111；[11;
[0068] (2)离心后，吸取离心管内上层血浆置于50ml离心管（离心管中血浆56°C灭活 30min;灭活后于4°C存放20min析出蛋白；3000rpm(升速9、降速9)离心10min;离心后吸取上 清置于注明血样信息及操作日期50ml离心管;4°C保存），吸至距分界面0.5cm处为止，若剩 余血细胞多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新离心管，弃去底部剩余；
[0069] (3)用生理盐水按1:1的比例稀释血细胞；
[0070] (4)分装人淋巴细胞分离液至50ml离心管，每支分装15ml;
[0071] (5)倾斜装有Ficoll的离心管，缓慢地将上一步稀释的血样加到Ficoll液面上， 使其呈清晰界面，血样与Ficoll比例不超过2:l，1600rpm(升速6、降速4)离心20min;
[0072] (6)离心后，吸弃上清，缓慢吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至 45ml，混勾，1500rpm(升速9、降速9)离心10min;
[0073] (7)离心后，弃去上清，沉淀先用5ml生理盐水重悬，再加生理盐水至45ml，混匀，取 lml样本于EP管中，用于计算细胞总量，1300rpm(升速9、降速9)离心10min;
[0074] (8)离心后，弃去上清，沉淀即所需单个核细胞。
[0075] 2. DC细胞的培养
[0076] (1)将分离得到的单个核细胞，用GT-T551H3培养基调整细胞浓度为1*106个/mL接 种到T75培养瓶中，贴壁培养2小时，分离悬浮细胞至T175培养瓶中；
[0077] (2)向贴壁细胞中加入GT-T551H3培养基15mL，并加入rhGM-CSF1000U/mL和rhIL-4 500U/mL，37 °C，7.5 % C02培养箱中培养；
[0078] (3)第3天半量换GT-T551H3培养基，补加 rhGM-CSF和rhIL-4使其浓度保持不变； [0079] (4)第5天加入人肾癌细胞系ACHN提取的肿瘤抗原蛋白50ug/mL，第6天加入rhTNF-a500U/mL，继续培养到第7天。
[0080] 3.CIK细胞的培养
[00811 (1)用DPBS稀释的浓度为5μg/ml的CD3单抗10ml包被175cm2培养瓶，4°C包被瓶子 过夜备用；
[0082] (2)使用前⑶3单抗包被培养瓶各洗涤3次，其中PBS 20ml洗2次，培养基20m洗1次， 避免干燥；
[0083] (3)从步骤2中所述的吸出的悬浮细胞放入5ug/ml的⑶3mAb包被过的培养瓶放入 37 °C、5 %二氧化碳培养箱培养中静置培养，并在培养基中补加 IFN- γ 1000U/ml及1 %经过 56°灭活过的自体血浆；
[0084] (4)第2天补GT-T551H3培养基20ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过 的自体血浆；
[0085] (5)第3天补GT-T551H3培养基20ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过 的自体血浆；
[0086] (6)第4天补GT-T551H3培养基至240ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1%经过56°灭 活过的自体血浆，培养至第7天。
[0087] 4.DC-CIK细胞的制备
[0088] (1)将培养至第7天的DC与CIK细胞混合，补加 GT-T551H3培养基至1000mL，并添加 CTLA-4mAb 100ng/mL、ro-lmAb 100ng/mL，补加 IL-2 使其浓度保持不变，37°C5%C〇2 培养静 置培养；
[0089] (2)继续培养7天后，离心收集成熟的DC-CIK细胞，并用生理盐水溶液洗涤2次，将 收集好的细胞加入体积百分比为20%的人血清白蛋白5mL，并用生理盐水溶液定容至 100mL〇
[0090] 5.结果测试
[0091] 在第0、7及14天收集由本实施例所述扩增DC-CIK的方法所培养的细胞用于各项测 试。
[0092] (1)细胞增殖倍数的测定
[0093]将取得的DC-CIK细胞用台盼蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的细胞 总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察细胞 的增殖状况，具体情况见下表。
[0095] DC-CIK细胞增殖曲线图14结果显示:细胞经过14天的培养增殖了 1720倍。经过⑶3 单克隆抗体包被的培养瓶培养CIK细胞，并通过小剂量连续刺激的方法，能够有效提高细胞 的增殖倍数。
[0096]
[0097]
[0098] (2)细胞表型分析
[0099]分别在第0取单个核细胞、7取DC及CIK细胞，第14天取DC-CIK细胞，制成细胞悬液， 洗涤后调整细胞浓度为1 X 105u/ml，加入标记的单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去 多余抗体，用上流式细胞仪检测，结果下表。
[0103] 结果显示:如上表所示，CIK细胞培养前期(0-7天)CD4+⑶25+Treg细胞增殖速度很 快，CD3+CD56+、CD3+CD8+增殖速度相对缓慢，DC、CIK混合培养添加 CTLA-4mAb 100ng/mL、 ro-lmAb 100ng/mL封闭负调节细胞后CD4+CD25+百分比迅速下降为0,而CD3+CD56+、CD3+ ⑶8+增殖速度增快，所占百分比逐渐增大。而经过7天的培养，DC细胞占较大比例，且有较高 的成熟度。
【主权项】
1. 一种脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，以脐血为原始材料，其特征为，包括如下步 骤：（1)从脐血中分离出脐血单个核细胞，重悬于GT-T551H3培养基中静置培养；（2)从步骤 (1)中制得的培养液中吸出悬浮细胞;贴壁细胞加入含有rhGM-CSF和rhIL-4的GT-T551H3培 养基，静置培养;第3天半量换GT-T551H3培养基，并补加 rhGM-CSF和rhIL-4;第5天加入肿瘤 特异性抗原刺激;第6天加入rhTNF-a，继续培养到第7天，得到DC细胞；（3)吸出的悬浮细胞 放入⑶3mAb包被过的培养瓶中静置培养，并在培养基中补加 IFN-γ及经灭活过的自体血 浆;第2天补GT-T551H3培养基，同时添加 IL-2和经灭活过的自体血浆;第3天补GT-T551H3培 养基，同时添加儿-2和％经灭活过的自体血浆;第4天补GT-T551H3培养基，同时添加 IL-2和 经灭活过的自体血浆，培养至第7天，得到CIK细胞；（4)将DC细胞和CIK细胞混合，将混合后 的细胞转移至培养袋中，补GT-T551H3培养基，同时添加 IL-2、经灭活过的自体血浆、CTLA-4mAb和PD-lmAb，静置培养5-7天，得到DC-CIK细胞；（5)第14天将培养好的DC-CIK细胞离心 收集，并用氯化钠溶液洗涤，再向收集好的细胞中加入人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定 容，得到产品。2. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于：步骤（1)中， GT-T551H3培养基中，脐血单个核细胞的细胞浓度为(1-2) X 106个/mL，静置培养2小时。3. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于:步骤(2)中，贝占 壁细胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的GT-T551H3培养基15mL，静置培养； 第3天半量换GT-T551H3培养基，并补加 rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL;第5天加入肿 瘤特异性抗原50ug/mL刺激;第6天加入rhTNF-a500U/mL，继续培养到第7天。4. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于:步骤(3)中，悬 浮细胞放入5ug/ml的CD3mAb包被过的培养瓶中静置培养，并在培养基中补加 IFN-γ 1000U/ ml及1 %经过56°灭活过的自体血浆;第2天补GT-T551H3培养基20ml，同时添加 IL-2 1000U/ mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆;第3天补GT-T551H3培养基20ml，同时添加 IL-2 1000U/ mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆；第4天补GT-T551H3培养基至240ml，同时添加 IL-2 1000U/mL和1 %经过56°灭活过的自体血浆，培养至第7天。5. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于:步骤(4)中，将 DC细胞和CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，补GT-T551H3培养基至 1000ml，同时添加 IL-2 500U/mL，1 %经过56° 灭活过的自体血浆，<：11^-411^1310〇1^/11^、？〇-lmAb 100ng/mL，静置培养 5-7 天。6. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于:步骤(5)中，用 0.9wt %氯化钠溶液洗涤收集的DC-CIK细胞2次，然后向DC-CIK细胞中加入体积百分比为 20%的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。7. 根据权利要求1所述的脐血淋巴细胞DC-DIK的培养方法，其特征在于:所述静置培养 的条件为在温度为37°C、C02体积百分比为含量为5%、相对饱和湿度为100%的C0 2培养箱中 培养。
【文档编号】C12N5/0783GK105969727SQ201510999660
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2015年12月29日
【发明人】张慧慧, 王芝辉, 武建明, 张剑慧, 谭毅
【申请人】山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司