一种cik细胞培养液及cik细胞的培养方法和香菇多糖在cik细胞培养中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种CIK细胞培养液及CIK细胞的培养方法 和香菇多糖在CIK细胞培养中的应用。
【背景技术】
[0002] 自体免疫细胞治疗是最成熟的肿瘤生物治疗技术，它是从患者自体外周血中分离 出单个核细胞，经过体外实验室激活、修饰、扩增后回输到患者体内，起到调节和增强患者 的免疫功能，并直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的作用。从上世纪80年代应用于临床肿 瘤治疗以来，自体免疫细胞治疗技术日趋成熟，越来越得到肿瘤患者与医生的认可。
[0003] 自体免疫细胞治疗按照方式不同，主要可分为主动免疫治疗和过继性免疫治疗两 种。其中，主动免疫治疗是采集患者的外周血，分离能够活化患者自身体内抗肿瘤细胞的因 子，然后在体外培养、修饰、增殖后回输到患者体内，这样就能迅速激发增强人体自身的抗 癌能力；过继性免疫治疗是分离患者自身体内本就存在的抗癌细胞，在体外活化，增殖后直 接输入患者体内对抗肿瘤。
[0004] 细胞因子诱导的杀伤（Cytokine-InducedKiller,CIK)细胞是一种用于过继性免 疫治疗的抗癌细胞。CIK细胞由于同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK 细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。 因此，应用CIK细胞被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。
[0005] 目前，常见的CIK细胞体外培养方法是在添加相应的细胞因子的无血清培养基中 培养外周血单个核细胞（PBMC)，在细胞因子的刺激下诱导PBMC成为CIK细胞。但采用这种 方法培养CIK细胞时，CIK细胞的增殖效果较差。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种CIK细胞培养液及CIK细胞的培养方法和 香菇多糖在CIK细胞培养中的应用，CIK细胞在本发明提供的培养液中的增殖效果较好。
[0007] 本发明提供了一种CIK细胞培养液，包括干扰素-y、⑶3激发型单抗、白细胞介 素-2、香菇多糖和无血清基础培养基。
[0008] 优选的，所述香菇多糖在培养液中的含量为0. 05~0. 3mg/mL。
[0009] 优选的，所述培养液还包括血清。
[0010] 优选的，所述血清在培养液中的体积百分含量为5~20%。
[0011] 优选的，所述干扰素-y在培养液中的含量为200~lOOOU/mL;所述⑶3激发型 单抗在培养液中的含量为10~80ng/mL;所述白细胞介素-2在培养液中的含量为100~ 600U/mL〇
[0012] 本发明提供了一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0013] a)、使用权利要求1~5任意一项所述的培养液培养外周血单个核细胞，获得CIK 细胞。
[0014] 优选的，所述步骤a)具体包括以下步骤：
[0015] al)、外周血单个核细胞在所述培养液中重悬，得到细胞悬液；
[0016] a2)、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养，获得CIK细胞。
[0017] 优选的，所述细胞悬液中的外周血单个核细胞密度为0. 5XIO6~IX10 6个/mL。
[0018] 优选的，所述培养的温度为37°C;所述培养的CO2体积浓度为5% ;所述培养的时 间为12~16天。
[0019] 本发明提供了一种香菇多糖在CIK细胞培养中的应用。
[0020] 与现有技术相比，本发明提供了一种CIK细胞培养液及CIK细胞的培养方法和香 菇多糖在CIK细胞培养中的应用。本发明提供的CIK细胞培养液包括干扰素-Y、CD3激发 型单抗、白细胞介素-2、香菇多糖和无血清基础培养基。本发明在CIK细胞培养液中加入香 菇多糖，使用这种培养液进行CIK细胞培养时，能够促进PBMC产生淋巴细胞活化因子和释 放辅助性T细胞因子，从而促进CIK细胞的增殖，进而使培养得到的CIK细胞表现出大的扩 增倍数、强的杀伤活性和高的细胞表面抗原含量。实验结果表明，采用本发明提供的培养液 培养CIK细胞14天后，CIK细胞扩增倍数大于300倍，CIK细胞体外杀伤率（效靶比40:1) 大于（80±2) %，CIK细胞表面抗原（CD3+和CD56+)数量大于48%。
【具体实施方式】
[0021] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0022] 本发明提供了一种CIK细胞培养液，包括干扰素-y、⑶3激发型单抗、白细胞介 素-2、香菇多糖和无血清基础培养基。
[0023] 在本发明中，所述干扰素-Y(IFN-Y)是一种水溶性二聚体细胞因子，具有抗病 毒、免疫调节及抗肿瘤特性。在本发明提供的一个实施例中，所述干扰素-Y在CIK细胞培 养液的含量为200~lOOOU/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述干扰素-y在CIK细 胞培养液的含量为400~800U/mL;本发明对所述干扰素-y的来源没有特别限定，采用市 售商品即可。在本发明中，所述干扰素-T的主要作用是通过与培养液中的其他组分协同 作用，从而促进CIK细胞的增殖，增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0024] 在本发明中，所述⑶3激发型单抗又称⑶3单抗，可与T淋巴细胞表面的⑶3分子 进行特异性结合。在本发明提供的一个实施例中，所述CD3激发型单抗在培养液中的含量 为10~80ng/mL;在本发明提供的另一个实施例中，所述CD3激发型单抗在培养液中的含 量为20~60ng/mL。本发明对所述CD3激发型单抗的来源没有特别限定，采用市售商品即 可。在本发明中，所述CD3激发型单抗的主要作用是通过与培养液中的其他组分协同作用， 从而促进CIK细胞的增殖，增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0025] 在本发明中，所述白细胞介素-2(IL-2)是由多种细胞产生并作用于多种细胞的 一类细胞因子，由于最初是由白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名。在本发 明提供的一个实施例中，所述白细胞介素-2在培养液中的含量为100~600U/mL;在本发 明提供的另一个实施例中，所述白细胞介素-2在培养液中的含量为200~500U/mL。本发 明对所述白细胞介素-2的来源没有特别限定，采用市售商品即可。在本发明中，所述白细 胞介素-2的主要作用是通过与培养液中的其他组分协同作用，从而促进CIK细胞的增殖， 增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0026] 在本发明中，所述香菇多糖是从香菇子实体中提取的有效活性成分，香菇多糖中 的活性成分是具有分支的(6-(1-3)-D-葡聚糖，其主链由(6-(1-3)-连接的葡萄糖基组成， 沿主链随机分布着由(6-(1-6)连接的葡萄糖基，呈梳状结构。在本发明提供的一个实施 例中，所述香菇多糖在培养液中的含量为〇. 05~0. 3mg/mL;在本发明提供的另一个实施例 中，所述香菇多糖在培养液中的含量为〇. 0625~0. 25mg/mL。本发明对所述香菇多糖的来 源没有特别限定，采用市售商品即可。在本发明中，所述香菇多糖的主要作用是促进CIK细 胞的增殖，增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0027] 在本发明中，所述无血清基础培养基是CIK细胞培养液的基础成分。在本发 明提供的一个实施例中，所选用的无血清基础培养基为RPMI(RoswellParkMemorial Institute)提供的RPMI-1640培养基。在本发明中，所述无血清基础培养基的作用是在细 胞培养过程中为培养的细胞提供必需的营养成分。
[0028] 在本发明提供的一个实施例中，所述CIK细胞培养液还包括血清。在本发明提供 的一个实施例中，所述血清为自体血清。在本发明提供的一个实施例中，所述血清在培养液 中的体积百分含量为5~20% ;在本发明提供的另一个实施例中，所述血清在培养液中的 体积百分含量为5~10%。在本发明中，所述血清的主要作用是在细胞培养过程中为细胞 生长和增殖提供营养，同时通过与培养液中的其他组分协同作用促进CIK细胞的增殖，增 强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0029] 本发明在CIK细胞培养液中加入香菇多糖，使用这种培养液进行CIK细胞培养时， 能够促进PBMC产生淋巴细胞活化因子和释放辅助性T细胞因子，从而促进CIK细胞的增 殖，进而使培养得到的CIK细胞表现出大的扩增倍数、强的杀伤活性和高的细胞表面抗原 含量。同时，本发明通过优化CIK细胞培养液的配方，通过培养液中各组分的协同作用，进 一步促进CIK细胞的增殖，增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。实验结果表明，采用本发明提供 的培养液培养CIK细胞14天后，CIK细胞扩增倍数大于300倍，CIK细胞体外杀伤率（效靶 比40:1)大于（80±2)%，CIK细胞表面抗原（⑶3+和⑶56+)数量大于48%。
[0030] 本发明提供了一种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0031] a)、使用上述技术方案所述的培养液培养外周血单个核细胞，获得CIK细胞。
[0032] 在本发明提供的培养方法中，通过使用所述培养液培养外周血单个核细胞，获得 CIK细胞，该过程具体包括以下步骤：
[0033] al)、外周血单个核细胞在所述培养液中重悬，得