无血清培养基及干细胞的培养方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及无血清培养基及干细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是 胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它 对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它 也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大 量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯 化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的 临床应用构成威胁，对用于规模化培养干细胞增加了难度。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用动物血清培养细胞存在一定 的毒性作用及病原体污染等缺陷，提供一种无毒性且无污染的无血清培养基。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种无血清培养基，包括基础培养 基，还包括胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因 子和青链霉素。
[0005] 在本发明提供的无血清培养基中，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸 铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。
[0006] 在本发明提供的无血清培养基中，所述无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为 5-20yg/ml、含铁的食品添加剂的浓度为2-10yg/ml、胰岛素的浓度为2-10yg/ml、纤粘 连蛋白或层粘连蛋白的浓度为0. 1-2yg/ml、胰高血糖素的浓度为I-IOyg/ml、肝细胞生 长因子的浓度为10_30ng/ml，以及青链霉素的浓度为20-200U/ml。
[0007] 在本发明提供的无血清培养基中，还包括表皮生长因子和HEPES。
[0008] 在本发明提供的无血清培养基中，所述表皮生长因子的浓度为10_30ng/ml和 HEPES的浓度为 5-20mmol/l。
[0009] 在本发明提供的无血清培养基中，还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三者中 的一种。
[0010] 在本发明提供的无血清培养基中，所述氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞 米松的浓度为0.l_2nmol/ml，或，雌激素的浓度为l-10nmol/l。
[0011] 在本发明提供的无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
[0012] 本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：
[0013] 获取干细胞，采用上述的无血清培养基进行体外培养。
[0014] 实施本发明提供的无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益效果： 1、采用无血清培养基能够避免现有技术存在血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验 结果的重复性；2、可避免现有技术存在的血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性 作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明确、质量 一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；5、能够延 长细胞的GI期或迫使细胞处于GO期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生 产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。
【具体实施方式】
[0015] 为解决现有技术中采用含有动物血清的培养基培养干细胞血清组分存在易产生 毒性作用，并携带有病原体且细胞分离纯化困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种无 血清培养基，通过在培养基中加入能够替代血清的补充因子，从而实现了无污染培养干细 胞，提尚细胞广品生广稳定性的目的。
[0016] 本发明提供的一种无血清培养基，包括基础培养基、胰岛素、含铁的食品添加剂、 亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。
[0017] 其中，基础培养基中的葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来 源，优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基，该DMEM/F12培养基中含有极其丰富和复杂的 细胞生长所需的营养物质，能够支持多种类型细胞在无血清的培养基中生长。
[0018] 胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成， 抑制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子；优选地，无血清培养基中，胰岛素的浓度为 2-10yg/ml〇
[0019] 微量元素铁是细胞生长增殖所必需的，含铁的食品添加剂可以为转铁蛋白、柠檬 酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种；优选地，含铁的食品添加剂为转铁蛋白，因 为大多数哺乳动物细胞上均存在特定的转铁蛋白受体，转铁蛋白受体与转铁蛋白复合物结 合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能 与其他微量元素如钒等结合，为细胞生长增殖提供必需的微量元素。优选地，无血清培养基 中，含铁的食品添加剂的浓度为2-10yg/ml。
[0020] 进一步地，在细胞培养过程中，基础培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸 盐等会产生大量的过氧化氢，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，会引起细胞膜 上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而导致细胞死亡。因此，在本发明提供的 无血清培养基中加入适量的亚硒酸钠，亚硒酸钠中的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶 和过氧化物歧化酶的作用过程，从而能够消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害；优选地， 该无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20yg/ml。
[0021] 此外，许多动物细胞必须贴壁才能生长，而无血清培养基中，由于缺乏血清中的各 种粘附贴壁因子，细胞往往以悬浮形式生长，而不利于细胞增殖。因此，通过在无血清培养 基中加入促贴壁物质来弥补这一缺陷，促贴壁物质一般为细胞外基质，可以是纤粘连蛋白 或层粘连蛋白等，同时，促贴壁物质还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子， 对许多细胞的繁殖和分化起重要作用。优选地，促贴壁物质为纤连蛋白，主要促进中胚层细 胞的贴壁与分化；无血清培养基中，纤粘连蛋白或层粘连蛋白的浓度为〇. 1-2yg/ml。
[0022] 胰高血糖素能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增值与功能表达；优 选地，胰高血糖素的浓度为1-10yg/ml。
[0023] 肝细胞生长因子能够刺激细胞的增殖分化；优选地，肝细胞生长因子的浓度为 l〇-30ng/ml〇
[0024] 青链霉素通过与细菌的核糖体相结合，从而抑制细菌内蛋白质的合成而导致细菌 死亡，可预防细菌的生长，且青链霉素的毒性作用较小，可忽略对细胞生长增殖的影响；优 选地，青链霉素的浓度为20_200U/ml。
[0025] 综上所述，本发明提供的无血清培养基不仅可避免血清培养基培养细胞所造成的 病原体污染，以及细胞分离纯化等问题，而且能够促进细胞的生长增殖。
[0026] 进一步地，本发明提供的无血清培养基还包括表皮生长因子等多肽类生长因子， 以及HEPES(中文名：轻乙基哌嗪乙硫磺酸，2-[4-(2_Hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonicacid，），这些物质对于细胞的生长增殖均具有积极地促进作用。其中，多 肽类生长因子能够刺激细胞的增殖分化；HEPES能够补偿无血清造成的缓冲能力下降，以 维持细胞生长所需的酸碱度；优选地，表皮生长因子的浓度为10_30ng/ml、HEPES的浓度为 5_20mmol/l〇
[0027] 进一步地，本发明提供的无血清培养基还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三 者中的一种，能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增值，促进细胞功能表达。优 选地，氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0.l-2nmol/ml，或，雌激素 的浓度为l-10nm〇l/l。
[0028] 本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，在本实施例中，干细胞为间充质干细 胞，当然本发明的无血清培养基也可应用于其他类型的干细胞，本实施例间充质干细胞的 培养方法包括如下步骤：
[0029] 1)获取间充质干细胞；
[0030] 2)采用本发明提供的无血清培养基进行体外扩增培养。
[0031] 其中，步骤1)获取间充质干细胞的过程为：
[0032] 取人骸关节或下肢骨骨髓标本，肝素抗凝，按1:2的比例加在密度为I. 073g/ml 的peroll分离液上2300rpm离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000 rpm离心 lOmin，洗涤3次，弃上清液。所得原代间充质干细胞在光学显微镜下计数，调整至IXIO7个 /培养瓶（25ml)密度用DMEM/F12培养基进行培养。
[0033] 可以理解的是，以上仅为本发明提供的其中一种获取间充质干细胞的途径，现有 技术中，间充质干细胞的获取方式同样适用于本发明。
[0034] 步骤2)具体过程为：
[0035] 当步骤1)中的细胞生长到几乎完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2~3 次，倾去PBS液，加入0? 25%的胰蛋白酶（内含0? 02%EDTA乙二胺四乙酸）消化，加入量以 使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培