干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及干细胞无血清培养基及干细胞的培养方 法。
【背景技术】
[0002] 目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是 胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它 对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它 也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大 量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯 化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的 临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用动物血清培养干细胞存在一 定的毒性作用及病原体污染等缺陷，提供一种无毒性且无污染的干细胞无血清培养基。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种干细胞无血清培养基，包括基 础培养基，还包括胰岛素、谷氨酰胺、含铁的食品添加剂、和亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。
[0005] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、 柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中一种或多种。
[0006] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，所述干细胞无血清培养基中，胰岛素的 浓度为1-15yg/ml、谷氨酰胺的浓度为l-5mmol/l、含铁的食品添加剂的浓度为20-200ng/ ml、亚硒酸钠的浓度为20-50nmol/l、孕酮的浓度为5-30mmol/l和丁二胺的浓度为 10-100ymol/1〇
[0007] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，还包括还包括HEPES和青霉素。
[0008] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，所述HEPES的浓度为2-20mmol/l，青霉 素的浓度为l〇-l〇〇mg/ml。
[0009] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，还包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑制 剂、亚油酸和链霉素。
[0010] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，所述葡萄糖的质量分数为0. 1-1%， NaHCOj^浓度为l-10mm〇l/l，大豆胰酶抑制剂的质量分数为0. 05-0. 2%，亚油酸的浓度为 10-100ymol/1，链霉素的浓度为 10-100mg/ml。
[0011] 在本发明提供的干细胞无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。
[0012] 本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：
[0013] 获取干细胞，采用上述的干细胞无血清培养基进行体外培养。
[0014] 实施本发明提供的干细胞无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益 效果：1、采用干细胞无血清培养基能够避免现有技术中血清批次间的质量差异，提高细胞 培养和试验结果的重复性；2、可避免现有技术存在血清所带来的外源性污染及血清组分的 细胞毒性作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明 确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；5、 能够延长细胞的GI期或迫使细胞处于GO期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可 能的生产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。
【具体实施方式】
[0015] 为解决现有技术中采用含有动物血清的培养基培养干细胞血清组分存在易产生 毒性作用，并携带有病原体且细胞分离纯化困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种干 细胞无血清培养基，通过在培养基中加入能够替代血清的补充因子，从而实现了无污染培 养干细胞，提高细胞产品生产稳定性的目的。
[0016] 本发明提供的干细胞无血清培养基，包括基础培养基、胰岛素、谷氨酰胺、含铁的 食品添加剂、亚硒酸钠、孕酮和丁二胺。
[0017]其中，基础培养基中的葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来 源，优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基，该DMEM/F12培养基中含有极其丰富和复杂的 细胞生长所需的营养物质，能够支持多种类型细胞在无血清的培养基中生长。
[0018]胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑 制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子；优选地，干细胞无血清培养基中，胰岛素的浓度 为 1-15yg/ml〇
[0019]谷氨酰胺脱掉氨基后，可作为培养细胞的能量来源，并参与蛋白质的合成和核酸 代谢，促进细胞的生长增殖；优选地，谷氨酰胺的浓度为l-5mmol/l。
[0020] 微量元素铁是细胞生长增殖所必需的，含铁的食品添加剂可以为转铁蛋白、柠檬 酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种；优选地，含铁的食品添加剂为转铁蛋白，因 为大多数哺乳动物细胞上均存在特定的转铁蛋白受体，转铁蛋白受体与转铁蛋白复合物结 合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能 与其他微量元素如钒等结合，为细胞生长增殖提供必需的微量元素。优选地，干细胞无血清 培养基中，含铁的食品添加剂的浓度为20-200ng/ml。
[0021] 进一步地，在细胞培养过程中，基础培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸 盐等会产生大量的过氧化氢，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，会引起细胞膜 上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而导致细胞死亡。因此，在本发明提供的 干细胞无血清培养基中加入适量的亚硒酸钠，亚硒酸钠中的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧 化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，从而能够消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害； 优选地，该干细胞无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20nmol/l。
[0022] 孕酮能够刺激细胞的增殖，且能够促进细胞迀移，避免细胞贴壁生长造成的细胞 部分无法接触到培养基的问题；优选地，孕酮的浓度为5-30mmol/l。
[0023] 丁二胺作为细胞培养中的微量元素和低分子量营养因子，是细胞膜合成所需的 脂质和细胞生长所需的水溶性脂质，能够促进细胞的生长增殖；优选地，丁二胺的浓度为 10-100Umol/1〇
[0024] 综上所述，本发明提供的干细胞无血清培养基不仅可避免血清培养基培养细胞所 造成的病原体污染，以及细胞分离纯化等问题，而且能够促进细胞的生长增殖。
[0025] 进一步地，本发明提供的干细胞无血清培养基还包括青霉素，以及HEPES(中 文名：轻乙基哌嗪乙硫横酸，2_[4_ (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl]ethanesulfonic acid，），这些物质对于细胞的生长增殖均具有积极地促进辅助作用。
[0026] 其中，HEPES能够补偿培养基中无血清造成的缓冲能力下降，以维持细胞生长所需 的酸碱度，优选地，ffiPES的浓度为2-20mmol/l;青霉素能够阻碍细菌的细胞壁合成，导致 细胞泄漏死亡，从而抑制细菌的生长，优选地，青霉素的浓度为10-lOOmg/ml。
[0027] 进一步地，本发明提供的干细胞无血清培养基还包括葡萄糖、NaHCO3、大豆胰酶抑 制剂、亚油酸和链霉素。其中，葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来 源，优选地，葡萄糖的质量分数为〇.1-1%。NaHCO3用于当细胞置于培养箱中培养时，调节 培养基的PH值至7. 2-7. 4,优选地，NaHCOj^浓度为l-10mmol/l。大豆胰酶抑制剂在细胞 传代过程中能够终止胰蛋白酶消化细胞，达到保护细胞的目的，优选地，大豆胰酶抑制剂的 质量分数为〇.05-0. 2%。亚油酸作为细胞培养中的微量元素和低分子量营养因子，是细胞 膜合成所需的脂质和细胞生长所需的水溶性脂质，促进细胞生长；优选地，亚油酸的浓度为 10-100ymol/1。链霉素能够作用于细菌的核糖体，阻碍蛋白翻译，从而抑制细菌生长；自然 环境下，不考虑人为产生的抗药性，对青霉素不敏感的绝大多数微生物对链霉素敏感，反 之亦然；因此，本发明中将青霉素和链霉素搭配使用能够控制几乎全部常见的细菌；优选 地，链霉素的浓度为l〇-l〇〇mg/ml。
[0028] 此外，许多细胞必须贴壁才能生长，而干细胞无血清培养基中，由于缺乏血清中的 各种粘附贴壁因子，细胞往往以悬浮形式生长，而不利于细胞增殖。因此，通过在干细胞无 血清培养基中加入促贴壁物质来弥补这一缺陷，促贴壁物质一般为细胞外基质，可以是纤 粘连蛋白或层粘连蛋白等，同时，促贴壁物质还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的 分化因子，对许多细胞的繁殖和分化起重要作用。优选地，促贴壁物质为纤连蛋白，主要促 进中胚层细胞的贴壁与分化；干细胞无血清培养基中，纤粘连蛋白或或层粘连蛋白的浓度 为0. 1-2yg/ml，具体可根据不同细胞的贴壁性，选择性添加。
[0029] 本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，在本实施例中，以间充质干细胞为例， 当然本发明的无血清培养基也可应用于其他类型的干细胞，本实施例间充质干细胞的培养 方法包括如下步骤：
[0030] 1)获取间充质干细胞；
[0031] 2)采用本发明提供的干细胞无血清培养基进行体外扩增培养。
[0032] 其中，步骤1)获取间充质干细胞的过程为：
[0033] 取人骸关节或下肢骨骨髓标本，肝素抗凝，按1:2的比例加在密度为I. 073g/ml 的peroll分离液上2300rpm离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000 rpm离心 l〇min，洗涤3次，弃上清液。所得原代间充质干细胞在光学显微镜下计数，调整至IXIO7个 /培养瓶（25ml)密度用DMEM/F12培养基进行培养。
[0034] 可以理解的是，以上仅为本发明提供的其中一种获取间充质干细胞的途径，现有 技术中，间充质干细胞的获取方式同样适用于本发明。