一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物细胞培养技术领域，具体涉及一种肝癌干细胞的无血清培养基及其培养方法。
【背景技术】
[0002]近年来肿瘤干细胞的理论研究已受到广泛关注，被认为是最主流的原因。Michor等认为干细胞是一类在原来的细胞中具有自我更新、无限增殖，多向分化的一部分极小群的细胞(Hwang H I, Lee T H, Jang Y J.Cell proliferat1n-1nducing protein 52/Mitofilin is a surface antigen on undifferentiated human dental pulp stemcells[J].Stem Cells Dev, 2015)。然而在肿瘤细胞中也存在着肿瘤干细胞(cancer stemcells, CSC)，并在成瘤潜能上具有强大的自我更新和无限增殖能力，也在肿瘤的发生、发展、转移及侵袭、复发中也同样起到至关重要的作用。
[0003]越来越多的人所认同肿瘤干细胞的存在，干细胞数量存在太少，不易分离，因此后续实验的开展比较困难。如何使其在体外有效的分离、培养，扩增，并以此为研究对象是我们思考的方向。在长期研究中，发现加入FGF和EGF的无血清培养液，使正常成体干细胞的体外扩增，并维持多向分化潜能。目前已经在乳腺癌、结肠癌、恶性神经系统肿瘤等实体瘤中分离培养得到了类似肿瘤干细胞的一群细胞。我们将以此为基础进行了肝癌干细胞的相关培养。
[0004]本发明采用直接无血清培养的方法，使得肝癌细胞可以成球并连续稳定传代，其用相关肝癌干细胞标志物的分选发现，从成球的肝癌细胞株中分离出较常规贴壁培养所得到的肝癌干样细胞量明显较多。
【发明内容】
[0005]为了解决以上技术问题，本发明提供一种肝癌干细胞的无血清培养基及其制备方法，用于肝癌细胞的培养，且该培养方法获得的肝癌干细胞具有自我更新能力、且富集。
[0006]一种肝癌干细胞的无血清培养基，以DMEM / F12+GlutaMAXTM-l培养基为基础，包括:人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液。
[0007]优选的，相对于DMEM / FU+GlutaMAXTM1基础培养基，人重组表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10的浓度为10_30ng/ml、胰岛素一号增长因子的浓度为10_30ng/ml、无血清补充营养成分的浓度为1_3%、肝素的浓度为40-60mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的浓度90_110U/ml。
[0008]所述的，DMEM / FU+GlutaMAXTM1基础培养基、人重组表皮生长因子、人重组碱性成纤维细胞生长因子-10、胰岛素一号增长因子、无血清补充营养成分、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液均可从市面公司购买得到。
[0009]优选的，EGF的最优浓度为20ng/ml、FGF-10的最优浓度为20ng/ml、IGF-1的最优质量浓度为20ng/ml、B27的最优质量浓度为2%、肝素的最优质量浓度为50mg/ml、青霉素+链霉素双抗溶液的最优浓度为100U/ml，浓度均相对于DMEM / F12+GlutaMAXTM 1培养基而言。
[0010]本发明还为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。提供一种肝癌干细胞的无血清培养基的培养方法，包括以下几个步骤:
步骤A:培养基制备:在无菌超净工作台中将重组表皮生长因子EGF、人重组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素一号增长因子，无血清补充营养成分B27、肝素、青霉素+链霉素双抗溶液添加至DMEM / FU+GlutaMAXTM1培养基中，吹打混匀；
步骤B:复苏人肝癌细胞系:将细胞从液氮罐中取出后，水浴箱振荡使其充分均匀受热后快速融化；在超净工作台中，加入含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基，和冻存管中的DMSO混合，离心弃掉上清；再用含质量浓度为10%FBS高糖DMEM完全培养基重悬细胞，吹打混匀，于透气培养瓶中培养；
步骤C:肝癌细胞用含含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代；吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗后，加入含质量浓度为0.25%胰蛋白酶+为0.0P/oEDTA消化液，倒置显微镜下观察，见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含质量浓度为10% FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，离心弃上清；PBS洗涤细胞后再离心；
步骤D:加入含添加生长因子的DMEM / F12+GlutaMAXTM 1培养基，吹打混匀，转入新培养瓶培养；
步骤E:当细胞球布满的密度为80%-90%时，吸取全部培养基和细胞离心，弃上清，PBS重悬后离心，加入含质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.0P/oEDTA消化液消化，吹打成单细胞，终止消化，离心，加入含生长因子的DMEM / F12+GlutaMAXTM 1培养基传代，重复前述操作进行传代培养。
[0011]优选的，所述步骤B和步骤D中，所需的培养环境:温度为37°C、CO2的体积浓度为5% 0
[0012]优选的，所述步骤E中，DMEM / F12+GlutaMAXTM 1培养基1: 2或者1: 3传代。
[0013]本发明带来了以下效果:1.本发明中的无血清培养基添加了三个特殊的生长因子并按相应比例配置；直接无血清培养，使肝癌细胞可以成球且成球率高，并可以连续稳定传代；2.本发明中生长因子可维持一小群细胞处于未分化状态；在肝癌干细胞无血清培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景；为肝癌干细胞的研究提供了丰富的实验材料。
【附图说明】
[0014]图1为肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L的贴壁培养效果图(显微镜200倍)
图2为肝癌细胞系MHCC-97H和MHCC-97L的无血清培养效果图
A.MHCC-97H无血清培养第3天(显微镜200倍)。
[0015]B.MHCC-97H无血清培养第8天(显微镜200倍)。
[0016]C.MHCC-97L无血清培养第3天(显微镜200倍)。
[0017]D.MHCC-97L无血清培养第8天(显微镜200倍)。
[0018]图3为肝癌细胞系MHCC97H贴壁培养和无血清培养细胞流式荧光标记⑶90表达量对比图。
[0019]A.MHCC97H同型对照组的表达量。
[0020]B.MHCC97H无血清培养流式荧光标记⑶90+表达量。
[0021]C.MHCC97H同型对照组的表达量。
[0022]D.MHCC97H贴壁培养流式荧光标记⑶90+表达量。
[0023]图4为肝癌细胞系MHCC97L贴壁培养和无血清培养细胞流式荧光标记⑶90表达量对比图。
[0024]A.MHCC97L同型对照组的表达量。
[0025]B.MHCC97L无血清培养流式荧光标记⑶90+表达量。
[0026]C.MHCC97L同型对照组的表达量。
[0027]D.MHCC97L贴壁培养流式荧光标记⑶90+表达量。
[0028]图5为肝癌细胞系MHCC97L贴壁培养和无血清培养细胞细胞周期检测对比图。
[0029]A.肝癌细胞系MHCC97H无血清培养细胞细胞周期图。
[0030]B.肝癌细胞系MHCC97H贴壁培养细胞细胞周期图。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明:
本发明的适用于肝癌干细胞的培养，其他肿瘤干细胞是否适用应根据实际实施应用，具体描述如下。
[0032]本发明中实施例中用到的重要仪器设备:流式细胞仪为BD公司本发明中实施例中用到的试剂如下:
1.DMEM / F12+GlutaMAXTM 1 培养基:Gibco 公司，
2.高糖DMEM培养基:Hyclone公司，
3.EGF、FGF-10、IGF-1 及 B27_supplement:Gibco 公司，
4.肝素:BD公司，
5.青霉素+链霉素双抗溶液=Gibco公司，
6.胎牛血清FBS:Gibco公司，
7.透气无菌培养瓶:Corning公司，
8.流式荧光分选抗体及其同型对照⑶90:BD公司，
9.0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液:Gibco公司，
10.细胞周期检测试剂盒:南京凯基生物科技发展有限公司，
11.Buffer: PBS (8.0g NaCl、0.2g KC1、0.2gKH2P04、l.44g Na2HP04.12H20、1000ml去离子水)。
[0033]实施例1:肝癌细胞系MHCC-97H干细胞培养
1.培养基制备:在无菌超净工作台中将EGF、FGF-10, IGF-1各2ug，B27为2ml，肝素5g，青霉素+链霉素双抗溶液1ml，添加至96.9ml的DMEM / F12+GlutaMAXTM_l培养基中，吹打混匀。
[0034]2.复苏人肝癌细胞系MHCC97H:将细胞从_80°C液氮罐中取出后，立即在37°C水浴箱中轻轻振荡约2分钟后，使其充分均匀受热后快速融化。在超净工作台中，加入5ml含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基(含青霉素+链霉素双抗溶液)轻轻吹打混匀中和DMSO，1500rpm离心5min，弃掉上清。再用含质量浓度为10%FBS的高糖DMEM完全培养基(含青霉素+链霉素双抗溶液)重悬细胞，吹打混匀，于在37°C、5% C02培养箱中用一次性75ml透气培养瓶中培养。
[0035]3.肝癌细胞系MHCC-97H用含含质量浓度为10%FBS的DMEM高糖培养基进行常规培养，贴壁长至80%-90%时传代。吸去培养瓶中的培养基，培养瓶中加入PBS清洗2-3遍后，加入5mL质量浓度为0.25%胰蛋白酶+0.01%EDTA消化液，并轻轻顺培养瓶横轴方向晃动，在37°C下消化，以便消化酶能充分接触和消化细胞。l_2min左右后于倒置显微镜下观察，可见贴壁细胞开始变圆、漂浮脱落即加入按消化酶体积和完全培养基体积1:3的体积的含有10% FBS的高糖DMEM的完全培养基终止消化，1500 rpm离心3min，弃上清。PBS洗涤细胞I遍，1000 rpm离心5min。
[0036]4.加入含添加生长因子的DMEM / F12+GlutaMAXTM 1培养基，吹打混匀，按1:2转入新培养瓶培养，培养条件为体积浓度为5% CO2,37 0C孵箱。
[0037]5.根据细胞的生长状态进行换液，细胞数量增长快，细胞聚集形成明显球状可3天换全液，如细胞数量增长较慢，细胞球不明显，可3天半量换液，7天换全液。一般5-7天均可见明显细胞球形成，当细胞球布满细胞瓶，约占80%-90%密度时，吸取全