无血清干细胞培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清干细胞培养基及其应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在细胞培养中必须提供某些痕量营养物 质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。因此采用的基础培养基常常要添加血 清，如马血清或胎牛血清；因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物， 它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本 身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端， 无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异 源体排斥和冲突。
[0003] 尤其是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标 准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出 多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品 分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服血清培养基的缺陷，提供一种无血清干细胞培养基及 其应用。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因 子，所述补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的 松。
[0007] 本发明还提出将上述无血清培养基进行干细胞培养方面的应用。
[0008] 采用本发明的上述无血清干细胞培养基，针对干细胞自身容易生出多种完全不同 的细胞表型和多种完全不同的细胞分化趋势的情形，采用上述各功能成分稳定和保持其分 化水平，并且将其中的生长因子尽量控制保持在单一的水平；并且可以避免现有技术血清 蛋白培养基存在的血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；并避免血 清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用。并且其自身成分相对明确、质量一致 且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。同时，在上述几 种特定搭配维持干细胞增殖和性状程度后，可通过延长细胞的GI期或迫使细胞处于GO期 而较长时间的维持细胞高密度培养，能更好地保持其干细胞特性。
【附图说明】
[0009] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0010] 图1为本发明采用血清培养基培养干细胞至第4天时显微镜观察结果；
[0011] 图2为本发明无血清培养基培养干细胞至第4天时显微镜观察结果；
[0012] 图3为本发明采用血清培养基培养干细胞至第14天时显微镜观察结果；
[0013] 图4为本发明无血清培养基培养干细胞至第14天时显微镜观察结果。
【具体实施方式】
[0014] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0015] 本发明实例提出一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基，和添加在基础培养 基中的补充因子，补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和 氢化可的松。
[0016] 本发明的无血清培养基针对干细胞培养中自身容易生出多种完全不同的细胞表 型和多种完全不同的细胞分化趋势的情形，采用上述各功能成分稳定和保持其分化水平， 并且将其中的生长因子尽量控制保持在单一的水平，并且可以避免现有技术血清蛋白培养 基存在的血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性。
[0017] 通常在干细胞的血清培养中，血清中具有较多天然成分，自身可以中和细胞毒素 保护细胞，而无血清培养基首先需要解除毒素物质对干细胞的伤害；干细胞培养的过程中， 过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，可由培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗 坏血酸盐等产生，引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和DNA损伤而导致细胞死 亡。本发明上述亚硒酸钠，其中含有的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧 化酶的作用过程，可以促进氢过氧化物代谢，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。
[0018] 另一方面，转铁蛋白的添加之后，其与哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体 结合，形成的受体与转铁蛋白复合物是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁 蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。
[0019] 牛血清白蛋白是无血清培养基的主要添加生长因子，它可以通过与维生素、脂类、 激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中的活性；并且 牛血清白蛋白比较大，可增加培养基的粘度，调节渗透压，并保护细胞免受机械损伤等作 用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用，因此加入牛血清白蛋白，以达到保 护和稳定细胞生长的作用。
[0020] 胰岛素本身的是血糖调节激素，专用至培养基中之后，能促进细胞利用葡萄糖和 氨基酸的效率，从而提升RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是比较重要的细胞存 活因子。
[0021] 相对于胰岛素，氢化可的松也是激素，是一种糖皮质激素，具有免疫抑制作用、抗 毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等；用在细胞培养基中，首先可以免疫抑制和抗毒 作用，可以避免细胞进一步自身抗毒和免疫反应，从而降低了细胞自身产生性状变异和分 化的情形。并且，其激素本身的功能是可促进表皮细胞的生长，促进细胞培养过程中生长和 增殖的速度。
[0022] 最后在无血清培养基中还添加纤粘连蛋白，干细胞多是来自于中胚层细胞，必须 贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中要添加促贴壁和扩展因子，同时又不诱导细胞 产生纤维化贴壁的诱导，所以采用添加纤粘连蛋白进行。纤粘连蛋白其本身是一种细胞外 基质，通过细胞外基质改变细胞表面的粘附性促使其贴壁；并且纤粘连蛋白还是重要的分 裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，遏制干细胞发生多向性的分化。
[0023] 本发明的无血清培养基，其针对干细胞自身来自于中胚层、且细胞易发生分化的 特性，采用有限数量的特定成分和功能的添加剂保证干细胞的基本生长要求，以避免干细 胞受到多种复杂的蛋白和多重细胞因子诱导出现多种性状和分化趋势的问题。同时，通过 胰岛素和氢化可的松的细胞激素联合蛋白和无机盐，补充在基础培养中，使无血清培养基 能满足促进干细胞生长和增殖效率的同时，并维持干细胞的分化程度和性状稳定。
[0024] 进一步，在上述实施方式中，激素类型的成分胰岛素和氢化可的松在本发明中需 要控制其添加的量的范围要比较窄，因为这两种是生长激素类的功能物质，其本身是一些 特定功能细胞代谢的产物，如果大量添加那么会导致干细胞向相应类型的细胞进行诱导和 分化，所以这一种情形中控制其量使其满足促进生长而避免诱导的发生，添加在基础培养 基中之后，调节胰岛素的浓度9~11yg/ml、氢化可的松调整为10 5~10 6mol/L的浓度。
[0025] 并且，其中转铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，基于本发明中作为结核性供铁 和调节的功能，转铁蛋白浓度的80~100yg/ml;在经过试验和观察后，转铁蛋白这一成分 还可以搭配"柠檬酸铁、二甲肿酸铁、葡糖酸铁"这几种机结合性的铁盐，功能状态的铁可以 辅助补充形成的结合复合体的来源。
[0026] 而亚硒酸钠作为微量元素的补充，基本上控制其代谢能满足消除氧自由基的和氧 化物酶的浓度即可，基本上达到8~lOmg/ml大致上就已经能满足培养基的要求了。
[0027] 而牛血清白蛋白的添加不能过于大量，虽然其是无血清培养基的主要添加生长因 子，但是首先本身是大蛋白，对培养液的粘性影响比加大，大量添加的话容易加深培养基的 粘滞力，不利于养料和流动和细胞的增殖扩散；并且其大量蛋白大量添加，会影响细胞的各 项代谢；所以基本上按照干细胞的代谢环境要求，经过反复的实验和研究之后控制〇. 8~ I. 2mg/ml的终浓度即可。而相对于牛血清蛋白，纤粘连蛋白基本上控制30~40ng/ml即 可。
[0028] 同时，在满足上述功能成分之后，基于本发明干细胞培养的要求，不需要在额外添 加其他的生长因子成分和促进成分，以避免不同的生长促进导致干细胞发身边多样性的性 状产生趋势。
[0029] 基于针对干细胞培养的效果要求，本发明的上述基础培养基优选采用頂EM培养 基；頂EM培养基是合成的基础培养基，相比加多了几种氨基酸的量，其他的成分相比低了 一些。虽然维持细胞代谢能力、并保证细胞不死的能力不如DEME等培养基，但是其自身基 本上不促进增殖，不如其他的DEME等培养基，用于本发明中正好可以避免与添加的补充因 子产生多向性的增殖诱导。
[0030] 同时，在实施的过程中为了避免干细胞体外培养中的其他杂菌污染，在上述无血 清培养基中还可以添加双抗，即80~lOOU/ml的青霉素及80~lOOmg/ml的链霉素。
[0031 ] 本发明在上述无血清干细胞培养基的基础上，还提出上述无血清干细胞培养基在 干细胞体外培养或者是定向