鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学领域，具体涉及鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法。
【背景技术】
[0002]组织工程研究包含了种子细胞、支架材料和受体动物模型三个方面，其中受体动物模型可以给设计的组织工程产品提供体内验证的平台，其血管再生率、细胞增殖和分化等通常是评价组织工程产品的重要指标。因此，如何获取一个操作可靠、经济实惠并符合某一特殊要求的检测平台，是做组织工程研究的重点。
[0003]组织工程血管化平台主要是研究组织工程产品在体内血管化的效果，目前的实验研究中有使用哺乳动物皮下血管网、肠系膜血管网或硬脑膜血管网进行研究，但这些研究平台存在制作困难，成本高和无法静止观察等问题。并且动物实验过程中，由于动物保护组织和伦理学要求，使得实验动物利用日益困难，且应用活体动物存在实验观察和操作上存在困难。
【发明内容】
[0004]针对上述技术问题，本发明提供一种取材方便、成本低廉、便于操作的血管再生研究模型。
[0005]具体的技术方案为:
[0006]鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，包括以下步骤:
[0007](I)受精鸡蛋的孵化
[0008]具有谱系的种鸡受精卵，用75%酒精消毒后置于孵化箱孵化，孵化条件为温度37°C、湿度>70% ;孵化72-96h后取出再次消毒；
[0009](2)培养体系的制作
[0010]制作壳外培养体系或者壳内培养体系；
[0011]壳外培养体系，在鸡蛋长轴的垂直方向上，切割直线，不切透蛋壳，然后将孵化后的鸡胚打入U形底的无菌培养皿或培养碟，胚体向上，覆盖无菌培养皿盖；
[0012]壳内培养体系，树立鸡蛋10分钟，大头朝上，延鸡蛋气室掀开鸡蛋蛋壳，去除蛋膜，暴露鸡胚胚体，用透明胶覆盖鸡蛋气室掀开部分；
[0013](3)模型再孵化
[0014]制作好的培养体系置于37°C、湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化72-96h，等到尿囊膜发育成熟、有大量毛细血管时，用于组织工程产品植入；
[0015](4)组织工程产品的植入
[0016]组织工程产品消毒后，用9%生理盐水预处理作为植入体；寻找尿囊膜上粗大的血管，在血管旁边放置植入体得到模型，从新覆盖培养皿盖或透明胶；
[0017](5)模型再孵化
[0018]模型置于37°C，湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化，孵化时间根据不同的组织工程产品血管化所需时间决定，孵化完成后取出标本用于研究。
[0019]鸡胚尿囊膜在医学中的应用使用时间较长，在早期研究中通常作为病毒培养的体内器官，进行病毒生物学研究，近年来的药理实验研究中，有利用鸡胚尿囊膜进行药动药代学研究，获取了大量的实验数据。随着组织工程实验研究的发展，大量的具有商业转化价值的各类组织工程产品被研发出来，但是都需要一个很好的血管化评价平台。本发明提供的鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，就是基于这个平台的需要，对鸡胚尿囊膜模型进行改进，得到可用于组织工程产品血管化验证的实验平台。
[0020]本发明提供的鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，利用鸡胚壳内或壳外培养，在鸡胚尿囊膜形成期，利用尿囊模型血管建立组织工程研究所需的受体血管网，在植入组织工程支架材料，或相关种植细胞的培养条件下，观察尿囊膜中支架材料的血管生长状态、显微组织结构，为进一步的血管再生研究提供一个研究模型。使用的鸡胚尿囊膜模型其血管生长迅速，满足植入体血管生长需要；处于静止状态，便于实验观察；最为重要的是不具备免疫原性，可以完成各类来源的生物支架或活体细胞的植入，同时取材方便，成本低廉，同时便于操作，并且不存在动物实验伦理学限制。
【具体实施方式】
[0021]结合实施例说明本发明的具体技术方案。
[0022]实施例1
[0023]鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，包括以下步骤:
[0024](I)受精鸡蛋的孵化
[0025]具有谱系的种鸡受精卵，用75%酒精消毒后置于孵化箱孵化，孵化条件为温度37°C、湿度>70% ;孵化72-96h后取出再次消毒；
[0026](2)培养体系的制作
[0027]壳外培养体系，在鸡蛋长轴的垂直方向上，切割直线，不切透蛋壳，然后将孵化后的鸡胚打入U形底的无菌培养皿或培养碟，胚体向上，覆盖无菌培养皿盖；
[0028](3)模型再孵化
[0029]制作好的培养体系置于37°C、湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化72_96h，等到尿囊膜发育成熟、有大量毛细血管时，用于组织工程产品植入；
[0030](4)组织工程产品的植入
[0031]组织工程产品消毒后，用9%生理盐水预处理作为植入体；寻找尿囊膜上粗大的血管，在血管旁边放置植入体得到模型，从新覆盖培养皿盖；
[0032](5)模型再孵化
[0033]模型置于37°C，湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化，孵化时间根据不同的组织工程产品血管化所需时间决定，孵化完成后取出标本用于研究。
[0034]实施例2
[0035]鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，包括以下步骤:
[0036](I)受精鸡蛋的孵化
[0037]具有谱系的种鸡受精卵，用75%酒精消毒后置于孵化箱孵化，孵化条件为温度37°C、湿度>70% ;孵化72-96h后取出再次消毒；
[0038](2)培养体系的制作
[0039]壳内培养体系，树立鸡蛋10分钟，大头朝上，延鸡蛋气室掀开鸡蛋蛋壳，去除蛋膜，暴露鸡胚胚体，用透明胶覆盖鸡蛋气室掀开部分；
[0040](3)模型再孵化
[0041]制作好的培养体系置于37°C、湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化72-96h，等到尿囊膜发育成熟、有大量毛细血管时，用于组织工程产品植入；
[0042](4)组织工程产品的植入
[0043]组织工程产品消毒后，用9%生理盐水预处理作为植入体；寻找尿囊膜上粗大的血管，在血管旁边放置植入体得到模型，从新覆盖透明胶；
[0044](5)模型再孵化
[0045]模型置于37°C，湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化，孵化时间根据不同的组织工程产品血管化所需时间决定，孵化完成后取出标本用于研究。
【主权项】
1.鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)受精鸡蛋的孵化 具有谱系的种鸡受精卵，用75%酒精消毒后置于孵化箱孵化，孵化条件为温度37°C、湿度>70% ;孵化72-96h后取出再次消毒； (2)培养体系的制作 制作壳外培养体系或者壳内培养体系； 壳外培养体系，在鸡蛋长轴的垂直方向上，切割直线，不切透蛋壳，然后将孵化后的鸡胚打入U形底的无菌培养皿或培养碟，胚体向上，覆盖无菌培养皿盖； 壳内培养体系，树立鸡蛋10分钟，大头朝上，延鸡蛋气室掀开鸡蛋蛋壳，去除蛋膜，暴露鸡胚胚体，用透明胶覆盖鸡蛋气室掀开部分； (3)模型再孵化 制作好的培养体系置于37°C、湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化72-96h，等到尿囊膜发育成熟、有大量毛细血管时，用于组织工程产品植入； (4)组织工程产品的植入 组织工程产品消毒后，用9%生理盐水预处理作为植入体；寻找尿囊膜上粗大的血管，在血管旁边放置植入体得到模型，从新覆盖培养皿盖或透明胶； (5)模型再孵化 模型置于37°C，湿度>70%条件的生化孵箱中，继续孵化，孵化时间根据不同的组织工程产品血管化所需时间决定，孵化完成后取出标本用于研究。
【专利摘要】本发明属于生命科学领域，具体涉及鸡胚尿囊膜制备组织工程血管化模型的方法，受精鸡蛋的孵化后，制作壳外培养体系或者壳内培养体系，再孵化等到尿囊膜发育成熟、有大量毛细血管时，在血管旁边放置植入体再孵化。该方法使用的鸡胚尿囊膜模型其血管生长迅速，满足植入体血管生长需要；处于静止状态，便于实验观察；最为重要的是不具备免疫原性，可以完成各类来源的生物支架或活体细胞的植入，同时取材方便，成本低廉，同时便于操作，并且不存在动物实验伦理学限制。
【IPC分类】C12N5/073
【公开号】CN105087471
【申请号】CN201510568370
【发明人】李焰
【申请人】中国人民解放军成都军区总医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月8日