干细胞冻存液及干细胞冻存方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及干细胞冻存液及干细胞冻存方法。
【背景技术】
[0002] 牙周炎是累及四种牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的慢性感染性 疾病，往往引发牙周支持组织的炎性破坏。在35岁以后较为多见。常见病因为菌斑、牙石、 创伤性咬合、食物嵌塞、不良修复体、口呼吸等。牙周炎具有四大特征，即牙周袋形成、袋壁 的炎症、牙槽骨吸收、牙齿逐渐松动。严重的牙周炎会造成牙齿脱落，从而导致咀嚼功能低 下而引起消化不良及胃肠病，影响全身心的健康。
[0003] 治疗牙周炎的主要在于消除炎症，促进被破坏的牙周组织的再生，恢复牙齿的正 常功能。临床常采用的牙周炎治疗方法包括：牙周基础治疗（洁治、刮治、根面平整）、牙周 翻瓣术及牙周组织再生术。
[0004] 牙周基础治疗：洁治，也称洁牙，俗称洗牙，其是预防和治疗牙病的一种方法。即 用洁治器械清除龈上牙石、菌斑和牙面上附着的色素，并抛光牙面，是防止菌斑和牙石再沉 积，防治牙周病的措施。在洁治时还应该将龈沟内与龈上牙石相连的一部分龈下牙石也一 并清除掉。根据所用的器械不同，龈上洁治术分为手用器械洁治法和超声波洁牙机洁治法。 对于牙龈炎患者，每6~12个月作一次洁治，可有效地维护牙周健康。龈下刮治术，即根面 平整术，其是用手工的龈下刮治器械伸入牙周袋内去除附着于牙周袋内根面上和嵌入牙骨 质内的龈下牙石和菌斑，并刮除牙根表面受到毒素污染的病变牙骨质，从而形成光滑、清洁 的根面，使根面具有生物相容的表面，有利于牙周组织的附着和新生。根面平整术不应用于 健康牙周部位，以免导致牙周附着丧失。
[0005] 牙周翻瓣术：指采用不同的手术切口，将牙龈与下方的组织分离，形成牙龈组织 瓣，暴露病变区的根面和牙槽骨，提供清创入路和可视性。刮除病变组织和菌斑牙石后，将 牙龈瓣复位在合适的位置上并缝合，达到消除牙周袋或使牙周袋变浅的目的。
[0006] 牙周组织再生术：在已经缺失的牙槽骨区植入人工骨，并覆盖专用的生物引导膜， 使牙周膜上的细胞选择性地在根面上生长，从而达到牙周膜、牙槽骨和牙骨质的再生。通过 这种骨植和生物膜的技术，恢复已经破坏的牙槽骨、牙龈及其他的牙周组织，完成牙齿的重 新稳定。
[0007] 以上方法无法修复损伤的牙周附着及牙槽组织，不能满足目前临床上对口腔颂面 部组织缺损修复再生及功能、外形恢复的要求，其次牙周炎治疗通过抗生素来控制菌斑生 长，进行全身和局部的药物治疗。但抗生素副作用较多，病原微生物也会产生耐药性。
[0008] 牙髓干细胞（dentalpulpstemcells，DPSCs)是存在于牙齿牙髓组织中的一类 具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。牙髓干细胞具有多向分化 的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂 肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中 可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋 化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。
[0009] 目前，用于牙髓干细胞的细胞冻存液的配方为10%DMS0+90%FBS，该细胞冻存液 在保存或运输牙髓干细胞的过程中会对其产生一定损伤作用，使得牙髓干细胞活率未达到 理想水平，影响其治疗效果。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明提供了干细胞冻存液及干细胞冻存方法。该干细胞冻存液可显 著减少冻存液对细胞的损伤作用，从而可显著提高干细胞的活率；本发明选用无血清培养 基，避免了血清带来的潜在污染。。
[0011] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0012] 本发明提供了一种干细胞冻存液，包括DMS0、羟乙基淀粉和无血清培养基。
[0013] 作为优选，以体积百分含量计，DMSO占5%~15% ;以质量百分含量计，羟乙基淀 粉占1 %~3% ;余量为无血清培养基。
[0014] 优选地，以体积百分含量计，DMSO占10% ;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占1% ; 余量为无血清培养基。
[0015] 优选地，以体积百分含量计，DMSO占15% ;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占2% ; 余量为无血清培养基。
[0016] 优选地，以体积百分含量计，DMSO占5% ;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占3% ; 余量为无血清培养基。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，干细胞冻存液用于冻存牙髓干细胞。但本发明并 不限定于冻存牙髓干细胞，其它种类的干细胞也可用本发明提供的干细胞冻存液冻存。
[0018] 本发明还提供了一种干细胞冻存方法，采用本发明的干细胞冻存液冻存干细胞； 该干细胞冻存液包括DMS0、羟乙基淀粉和无血清培养基；作为优选，以体积百分含量计， DMSO占5%~15%;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占1%~3%;余量为无血清培养基；优 选地，以体积百分含量计，DMSO占10% ;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占1% ;余量为无 血清培养基；优选地，以体积百分含量计，DMSO占15% ;以质量百分含量计，羟乙基淀粉占 2% ;余量为无血清培养基；优选地，以体积百分含量计，DMSO占5% ;以质量百分含量计，羟 乙基淀粉占3% ;余量为无血清培养基；在本发明提供的一些实施例中，干细胞冻存液用于 冻存牙髓干细胞。
[0019] 作为优选，干细胞的密度为（0. 1~10)XIO6细胞/mL。
[0020] 优选地，干细胞的密度为IXIO6细胞/mL。
[0021] 作为优选，冻存的温度<-80°c。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，冻存的温度为_180°C。
[0023] 在本发明提供的一些实施例中，干细胞为牙髓干细胞。
[0024] 作为优选，干细胞为P3代干细胞。
[0025] 本发明提供了干细胞冻存液及干细胞冻存方法。该干细胞冻存液包括DMSOJSZ 基淀粉和无血清培养基。本发明至少具有如下优势之一：
[0026] 本发明提供的干细胞冻存液可显著减少冻存液对细胞的损伤作用，从而可显著提 高干细胞的活率；
[0027] 本发明选用无血清培养基，避免了血清带来的潜在污染。
【附图说明】
[0028] 图1示复苏后细胞活率柱状图；
[0029] 图2示流式细胞仪检测空白对照组细胞表面抗原表达情况；
[0030] 图3示流式细胞仪检测实验组细胞表面抗原表达情况。
【具体实施方式】
[0031] 本发明公开了干细胞冻存液及干细胞冻存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员 来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施 例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和 应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0032] 本发明提供的干细胞冻存液及干细胞冻存方法中所用试剂、仪器均可由市场购 得。
[0033] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0034] 实施例1~3牙髓干细胞的制备
[0035] (一）分离培养牙髓干细胞：
[0036] 经家属同意后，收集6岁-10岁儿童临床上因滞留而拔除的乳切牙，要求没有牙体 牙髓病变及坏死。拔除后立即放于4°C遇冷的装有含有双抗（100yg/mL青霉素、100yg/mL 链霉素）的PBS离心管中，24小时内取出使用。
[0037] 取出牙齿，利用含双抗的PBS溶液反复冲洗三次，将牙齿包在无菌纱布中用钳夹 裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部Imm的牙髓组织。根据牙髓 组织大小，用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm3,置于50mL离心管中。加入10倍体积的5g/ LI型胶原酶，封口后充分混合均匀，转移至恒温空气摇床中，37°C、200R消化20min，再用 2000rpm离心3min。丢弃上清。，用30mLPBS清洗沉淀，反复吹打离散细胞团块，通过70um 的细胞筛网过滤，以获得单个离散的细胞，1000 rpm离心5min。丢弃上清，沉淀用无血清培 养基重悬，以（0. 5~I. 5)X104/cm2接种至六孔板中，每孔加入2mL无血清培养基，再加入 表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两者终浓度为lOng/mL)，混匀细胞悬液，放 于37°C、湿度为95%的二氧化碳培养箱中培养。每3d换液1次，7-14d左右在显微镜下能 观察到克隆的形成，当细胞生长至80% -90%汇合时，0. 125%胰蛋白酶消化细胞，进行传 代培养。
[0038] (二）牙髓干细胞的扩增培养及冻存：
[0039] 当上述原代细胞的细胞汇合度达80% -90%后，用0.1%-0.25%胰蛋白酶消化， 以1000-1500rpm离心5min，按照（0.5-1. 5)XIO4细胞/cm2细胞密度传代，传代培养的培 养基为无血清培养基+表皮生长因子EGF与碱性成纤维生长因子bFGF(两