一种用于体外替代测试的全层皮肤模型及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种含脂肪层的全层皮肤模型及其制备方法，可以用于替代活体动物(及人体)的体外测试领域。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体最外的一层结构，是人体最大的一个器官。除了承担保护身体、排汗、感觉冷热和压力的生理功能外，也是外界物理性(紫外线、微波等)、机械性(牵拉、摩擦等)、化学性(化妆品、药品，化学品等)刺激的主要作用器官。
[0003]传统化妆品、药品、原料筛选、生物制品、化学制品的皮肤安全性评价或功效性评价目前主要利用动物或人体皮肤作为检测模型。随着近年来世界各国对实验动物福利问题的重视，欧洲各国、美国相继颁布了动物福利法，旨在减轻或消除动物的疼痛，达到保护动物的目的。
[0004]欧洲、美国、日本等世界发达地区或国家已成立动物实验替代机构旨在积极推动替代方法进行更为系统而深入的研究，目前已顺利完成相关技术储备，并通过立法程序建立起相应的技术性贸易措施体系。
[0005]我国现也已有和国际接轨的相关法律法规，以体外替代试验方法取代传统的动物试验。GB/T16886-1《医疗器械生物学评价第I部分:评价与试验》提到:只要科学上证明能获得与动物试验同样的信息，建议优先采用体外模式。
[0006]在此背景下，以正常的人体皮肤生理结构和功能为基础，利用组织工程原理和技术构建的3D皮肤模型成为未来首选的生物学评价工具。
[0007]目前构建的3D皮肤模型主要由表皮或真皮层组成。但是利用体外替代模型进行生物学评价的含有脂肪层的3D皮肤模型还少有报道。
[0008]皮肤由上而下可以分为:表皮层、真皮层以及皮下组织。皮下组织(Subcutaneous)又称为“皮下脂肪组织”，位于真皮层下方，与真皮层无明显的界限，解剖学上称为浅筋膜，临床上称为蜂窝组织；其主要功能是吸收震动、阻隔热、提供能量与热量的来源、可以形成并储存脂肪、进行脂肪代谢。
[0009]因此，现有的3D皮肤模型与正常皮肤组织结构相比还存在以下几个缺点:首先，不含有皮下组织，即皮下脂肪层；其次，现有的3D皮肤模型大都是在外源支架(目前以胶原为主)基础上进行构建，因此进行生物监测时含有外源支架结构的3D皮肤模型不能反映同活体皮肤类似的检测数据。
[0010]2007年10月金岩等人申请了有关专利(中国专利申请号200710018911.7)，该发明包括皮下脂肪细胞、成纤维细胞、表皮细胞和生物支架材料，主要应用于烧烫伤、溃疡等皮肤缺损患者的临床治疗，不能作为生物学评价的替代模型。
[0011]JULIE FRADETTE在2008年发表的文章[1]中介绍了一种含有脂肪层的全层皮肤模型，此模型的真皮层以I型胶原作为支架材料，构建过程复杂，周期长，很难进行正常产业化，且在后期检测中，外源性的支架结构会对正常细胞间的信号传导产生影响，无法反应同活体皮肤类似的检测数据。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是克服现有技术提供的皮肤模型不能作为生物学评价的替代模型、构建过程复杂，分化周期长，真皮层易收缩、功能性不完整、很难进行正常产业化，且在后期检测中，外源性的支架结构会对正常细胞间的信号传导产生影响，无法反应同活体皮肤类似的检测数据的问题。
[0013]为此，本发明提供了一种用于体外替代测试的全层皮肤模型，具有三层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，真皮层和脂肪层；
所述表皮层由表皮细胞生发复层化组成；
所述真皮层由成纤维细胞及其胞外基质组成；
所述脂肪层由脂肪间充质干细胞经诱导而成的脂肪细胞及胞外基质组成。
[0014]上述表皮层的厚度为150?200Mm ；
上述真皮层的厚度为40.0?60.0Mm ；
上述脂肪层的厚度为10.0?20.0Mm。
一种用于体外替代测试的全层皮肤模型的制备方法，包括以下步骤:
步骤一、脂肪层的构建
1.1)、将P3?P8代的脂肪间充质干细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心5?8min ;在含体积比为5?10%胎牛血清FBS的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接种至Transwell小室，保持该Transwell小室内的液量为150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养；
1.2)、18?24h后弃去所述Transwell小室内外的a -MEM培养基，加入成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养5?7d，每隔2?3d换液；
1.3)、5?7d后，重复步骤1.1)，18?24h后更换所述Transwell小室内外培养液为成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37±1°C孵箱中培养2?4d，每隔18?24h更换所述Transwell小室内液体，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ I ；
所述成脂诱导液的组成:以a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS,吲哚美辛0.01?0.05mg/ml，IBMX0.1?0.5mg/ml，胰岛素0.01?
0.05 mg/:ml，地塞米松 0.1 ?0.8 μ g/ml ；
步骤二、真皮层的构建:
2.1)、P6?PlO代成纤维细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心5?8min ；在含有25?75 μ g/ml Vc以及体积比为5?10%的胎牛血清FBS的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接种至步骤一制备的脂肪层，保证所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养；
2.2)18?24h后，重复步骤2.1)，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养2?4d，每隔18?24h换液，保证所述Transwell小室内液量150?200 μ I ；
步骤三、表皮层的构建: 3.1)、待P4?P8代表皮细胞培养融合率达60?70%左右时，于800?1000 rpm/min条件下离心6?8min，用构建培养液SKcl重悬，以1.5?3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二制备的真皮层中；其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，于4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养，每18?24h换液一次；
3.2)、培养2?3d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，将步骤3.1)中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后在4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次；
3.3)、2?3d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次；
3.4)、2?3d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培养I?2d，每18?24h换液一次；
不同构建培养液所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM ；
所述构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，
0.1 ?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素 INSULIN，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3, 4 ?10 μ g/ml 的维甲酸；
所述构建培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加 0.25 ?0.5 mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰岛素INSULIN，15?45 μ g/ml的腺嘌呤，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加0.5?ImM的CaCl2,0.1?0.5 ng/ml的EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素 INSULIN，15?45 μ g/ml的腺嘌吟，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加I?
1.5mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的膜岛素 INSULIN，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3，4 ?10 μ g/ml 的维甲酸。
[0015]综上所述，本发明提供的含脂肪层全层皮肤(用于体外替代测试的全层皮肤)的制备方法模拟了人体皮肤的生长发育过程，制备周期短，方法简易，可控性强，并且构建全程不使用外源支架材料，通过细胞自分泌细胞外基质形成皮肤支架，维持皮肤各层细胞生长的微环境，制备所得的含脂肪层全层皮肤更接近于正常人体皮肤结构，并具备相应的功能性，在体外条件下其功能和活性维持时间长，能够满足相关皮肤生物学检测的需求，可用于皮肤相关的体外替代试验。
[0016]以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。
[0017]【附图说明】:
图1是含脂肪层全层皮肤的脂肪层光镜下脂肪细胞形成的脂滴图。
[0018]图2是脂肪层组织学图。
[0019]图3是含脂肪层全层皮肤构建完成后的组织学图。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
步骤一、脂肪层的构建
1、P3代的脂肪间充质干细胞消化后，于800rpm/min条件下离心8min。在含体积比为10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，每孔0.25Ε6密度接种至Transwell小室，保持小室内液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培养；
2、24h后更换培养液:弃去小室内外的a-MEM培养基，加入成脂诱导液，保持小室内液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培养5d，每隔2d换液；
3、5d(天的英文day的简写)后，重复步骤l，24h后更换小室内外培养液为成脂诱导液，保持小室内液量150 μ 1，5% C02、37°C孵箱中培养2d，每隔24h更换小室内液体，加液量同上。成脂诱导液组成:a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清(FBS)，Π引噪美辛 0.03mg/ml，IBMX 0.lmg/ml，胰岛素 0.01 mg/ml，地塞米松 0.7 μ g/ml。
[0021]