肝细胞无血清培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物细胞培养技术，尤其涉及一种肝细胞无血清培养基。
【背景技术】
[0002] 生物人工肝支持系统（BALSS)是以具有一定功能的肝细胞为依托的，能够在一定 程度上对人体发挥类似于肝脏功能的装置，一方面可以为可逆性肝功能损害患者提供短期 的支持，顺利过渡至肝功能恢复，另一方面可以对不可逆性肝功能衰竭患者在等候肝移植 期间给予支持，起到肝功能衰竭及肝移植之间的桥梁作用。肝细胞是BALSS的核心部分，因 此体外培养肝细胞并使其发挥原有的生理作用，成为了BALSS研究的重点。以往肝细胞多 使用人或动物血清进行培养，但由于其具有免疫排斥反应和致敏性，易受外源微生物污染 等缺点，并不适应于人体应用。
[0003] -般细胞培养需要在基础培养基中加入5-10%动物血清，基础培养基含有适量的 能量物质和微量元素等，而血清中含有细胞生长所必需的各种生长因子、激素及蛋白质等 成分。目前用于肝细胞培养的基础培养基主要包括町111 &111'8￡培养基，01^11，01^11/^12， RPMI-1640，M-199，ML-15等。传统含血清培养基的主要缺点在于1.由于种属特异性，异种 动物血清具有免疫排斥反应和致敏性；2.血清内容易携带朊病毒等，且易受病原微生物污 染；3.不同批次间可能存在差异，容易导致实验结果不可重复性；4.血清中某些蛋白成分 可能对实验结果产生影响。
[0004] 无血清培养基开发的思路关键在于，在基础培养基中添加适量的生长因子、激素、 微量元素、促粘附物质等，使无血清培养基的作用接近于含血清培养基。目前已商品化的肝 细胞无血清培养基较少，其中具有代表性的是H印atoZYME-SFM。HepatoZYME-SFM是目前肝 细胞无血清培养基中的代表之一，但不同的肝癌细胞系，对培养基内各成分的需求并不相 同，因此不同细胞系最适宜的培养基配方并不相同，HepatoZYME-SFM不具备广泛的通用性。
[0005] 丝胶蛋白（sericin)是从蚕丝中提取的蛋白质，含大量侧链带亲水基团的氨基酸 如丝氨酸、天冬氨酸等，分子量为10- 400kDa，易溶于水中，在蚕营茧时起着黏合作用。目 前丝胶蛋白已经被广泛应用于各种哺乳动物的细胞培养中，实验证实丝胶蛋白对多种体外 培养的细胞的增殖和粘附能力均有明显的促进作用DhNayakS[3]等的研究中，在2%海 藻酸盐溶液中加入0. 125%的丝胶蛋白，以此溶液将H印G2细胞按IX106/ml密度重悬，使 用注射栗将细胞悬液以不同速率挤出不同大小的微珠，将微珠收集于含有0. 2MCaC12溶液 的胶化浴中并静置15min，然后以0. 5 %壳聚糖溶液对微珠进行包裹30min，最后将微珠浸 入京尼平溶液（2.5mg/ml，37°C，4h)中进行交联，从而制成微囊。经此微囊化培养的细胞， 细胞活力及白蛋白、尿素合成功能均明显优于未加丝胶蛋白的对照组。
[0006] 丝胶蛋白-藻酸盐-壳聚糖微囊化培养的缺点也非常突出，主要在于制作工序较 复杂，不利于日常应用、广泛推广及肝细胞的产业化培养，且在包裹过程中溶液成分、渗透 压的剧烈变化，容易导致细胞不可逆性损伤。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是结合丝胶蛋白的优势，提供一种添加了适当浓度的丝胶蛋白的适 用于生物人工肝的肝细胞无血清培养基。
[0008] 为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：
[0009] -种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：
[0010] 基础培养基500mL;
[0011] 丝胶蛋白0. 05~0. 5% ;
[0012] 地塞米松 0? 1 ~lOOOnmol/mL；
[0013] 肝细胞生长因子5~20ng/mL;
[0014] 表皮生长因子10~50ng/mL;
[0015] 青链霉素 100U/mL。
[0016] 可选择地，所述基础培养基为RPMI-1640、DMEM、MEM、M199、F-10、F-12、DMEM/F-12 l:l、McCoy's5A、William'sE、ML-15中的任意一种。优选地，所述基础培养基为DMEM。
[0017] 更优地，还包括胰岛素-转铁蛋白_亚硒酸钠合剂。所述胰岛素_转铁蛋白-亚 硒酸钠合剂的浓度为1%。
[0018] 更优地，还包括亚油酸。所述亚油酸的浓度为llng/mL。
[0019] 优选地，还包括羟乙基哌嗪乙硫磺酸。所述羟乙基哌嗪乙硫磺酸的浓度为lOmmol/ L0
[0020] 与现有技术相比较，本发明具有如下优势：
[0021] (1)本发明的肝细胞无血清培养基，其改进了无血清培养基配方，使其更适合肝细 胞的生长及功能发挥。
[0022] (2)本发明的肝细胞无血清培养基，无需复杂的操作，即可对肝细胞进行无血清培 养。
[0023] (3)本发明的肝细胞无血清培养基，可直接用于生物型人工肝。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的肝细胞无血清培养基和DMEM高糖培养基对细胞活力的影响对比 结果图。
[0025] 图2为本发明的肝细胞无血清培养基和DMEM高糖培养基对细胞培养物上清液中 白蛋白含量的对比结果图。
[0026] 图3为本发明的肝细胞无血清培养基和DMEM高糖培养基对细胞培养物上清液中 尿素含量的对比结果图。
[0027] 图4为本发明的肝细胞无血清培养基和DMEM高糖培养基对细胞培养物上清液中 谷草转氨酶含量的对比结果图。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0029] 实施例一
[0030] 本发明的肝细胞无血清培养基的各组分的浓度筛选
[0031] 1.正交优化设计筛选培养基中各组分的浓度：
[0032] 正交试验方案：本研究包括丝胶蛋白（A)，地塞米松（B)，肝细胞生长因子 (HGF(C))及表皮生长因子（EGF(D)) 4个因素，每个因素选用3个水平（见表1)，因此选用 L9 (34)正交表，试验方案见表2。研究选用DEME高糖型为基础培养基，加入胰岛素5yg/ml， 转铁蛋白5yg/ml，亚硒酸钠lOyg/L，亚油酸llng/ml，HEPES10mmol/L，青链霉素100U/