ml，并按表2实验方案分别加入相应剂量的4种成分，混合制备成9组培养基。
[0033] 表1正交设计因素水平表
[0037] 2.将肝细胞分别接种于各组，在5% 0)2及37°C环境中传代培养，传代过程中使用 0.25%胰蛋白酶-EDTA进行消化后，按1:1体积比加入大豆胰蛋白酶抑制剂（lmg/ml)并 重悬，然后以1000 rpm离心5min，弃去上清，以各自培养基重悬后加入培养瓶中继续传代培 养，每24h更换培养基。待细胞生长稳定后，接种于6孔板或96孔板，继续培养8天，用于 后续实验。
[0038] 实施例二
[0039] 本发明的肝细胞无血清培养基对肝细胞的培养效果
[0040] 1.各项指标的检测方法
[0041] (1)细胞活力检测的方法：取对数期细胞制成2XIOVml的细胞悬液，接种于96孔 板（100y1/孔），在5 % 0)2及37°C环境中培养24h，每天取5复孔，每孔加入10yICCK-8试 剂，在上述环境中孵育1小时后，用酶标仪在450nm波长处测量吸光值，并绘制吸光值-时 间曲线，取每组吸光度中最大值。
[0042] (2)细胞功能检测的方法：在6孔板中每孔接种IXIO5细胞，并加入3ml培养基， 每24h更换培养基，在5% 0)2及37°C环境中培养，每天收集细胞培养上清液，使用ELISA法 测定白蛋白含量，使用酶标仪比色法测定AST、LDH及尿素含量。
[0043] ⑶Real-timeqPCR检测：取对数期细胞，加入Trizol提取总RNA，用分光光度计 分别测量260nm及280nm波长处吸光度，通过A260/A280来确定RNA纯度及浓度是否满足实 验要求，并在_20°C中保存备用。通过荧光定量PCR法比较RNA表达差异，以反映AFP，细胞 角蛋白CK18、CK19,尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-UGT)，谷胱甘肽巯基转移酶（GST)， 谷氨酰胺合成酶（GS)，葡萄糖-6-磷酸酶，ALB，CYP3A4,肝细胞核转录因子HNF-4a等基因 的表达情况，绘制融解曲线，记录循环阈值Ct。
[0044] (4)统计学分析：收集各项指标后，使用SPSS20. 0软件进行极差分析及方差分 析，得出最佳方案。
[0045] 2.本发明的肝细胞无血清培养基与完全培养基的对照试验
[0046] (1)按表3配制各组培养基。
[0047] 表3实验分组及培养基配方
[0048]
[0050] *地塞米松、丝胶蛋白、HGF、EGF剂量根据上述正交试验后确定
[0051] (2)A组和D组细胞活力对比
[0052] 参考图1，A组细胞活力从第1天开始逐渐上升，至第4天达到高峰，而D组（DMEM 高糖组）细胞活力第1天与A组相近，从第2天开始则明显下降，远低于A组（P= 0. 000)， 并逐渐呈下降趋势。
[0053] (3)A组和D组培养液上清液中白蛋白（ALB)含量对比
[0054] 参考图2,细胞培养全过程中，A组上清液中的ALB含量均明显高于D组（P= 0. 000)，且两组上清液中的ALB含量均随着时间逐渐减少。
[0055] (4)A组和D组培养液上清液中尿素含量对比
[0056] 参考图3,A组上清液中的尿素含量在第2天开始明显减少，并保持相对稳定，但 逐渐呈下降趋势；D组上清液中的尿素含量随着时间呈下降趋势，且明显低于A组（P= 0?000)〇
[0057] (5)A组和D组培养液上清液中谷草转氨酶（AST)含量对比
[0058] 参考图4,两组细胞培养上清液中谷草转氨酶（AST)含量均随着时间逐渐增加，A 组明显低于D组（P= 0. 000)。
[0059] ⑶结论
[0060] A组的细胞活力、白蛋白及尿素合成量均明显优于D组，而A组的IfepGL细胞损伤 明显轻于D组。
[0061] 综上所述，本发明肝细胞无血清培养基适合肝细胞的生长及功能发挥，可用于生 物型人工肝的制备。
[0062] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但并不仅仅受上述实施例的限制，其他的 任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的 置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种肝细胞无血清培养基，其特征在于，其包括以下组分： 基础培养基500mL ; 丝胶蛋白0.05~0.5%; 地塞米松0. 1~lOOOnmol/mL； 肝细胞生长因子5~20ng/mL ; 表皮生长因子10~50ng/mL ; 青链霉素l〇〇U/mL。2. 如权利要求1所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为 RPMI-1640、DMEM、MEM、M199、F-10、F-12、DMEM/F-121:l、McCoy' s5A、William' s E、ML-15 中的任意一种。3.如权利要求2所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM。4. 如权利要求1所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：还包括胰岛素-转铁蛋 白-亚硒酸钠合剂。5.如权利要求4所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：所述胰岛素-转铁蛋白-亚 硒酸钠合剂的浓度为1%。6. 如权利要求1所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：还包括亚油酸。7.如权利要求6所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：所述亚油酸的浓度为Ilng/ ITlLo8. 如权利要求1所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：还包括羟乙基哌嗪乙硫磺 酸。9.如权利要求8所述的肝细胞无血清培养基，其特征在于：所述羟乙基哌嗪乙硫磺酸 的浓度为10mm〇l/L。
【专利摘要】本发明公开一种肝细胞无血清培养基，其包括以下组分：基础培养基500mL；丝胶蛋白0.05～0.5％；地塞米松0.1～1000nmol/mL；肝细胞生长因子5～20ng/mL；表皮生长因子10～50ng/mL；青链霉素100U/mL。本发明肝细胞无血清培养基适合肝细胞的生长及功能发挥，可用于生物型人工肝的制备。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105087465
【申请号】CN201510531097
【发明人】黄耘, 高毅
【申请人】南方医科大学珠江医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月26日