体外小肠干细胞培养基及培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种小肠干细胞的培养基，尤其关于一种用于体外培养小肠干细胞的 培养基及培养方法。
【背景技术】
[0002] 干细胞存在于许多哺乳类组织当中，具有自我更新（self-renewal)及分化 (differenciation)的能力。其中，肠组织主要由小肠及结肠所组成，小肠的内层在解剖 学上称作粘膜（mucosa)，该粘膜会朝着肠内腔的方向凸出呈长条状，又称为绒毛（villi)， 而腺窝（crypt)则位于绒毛附近，小肠干细胞（Intestinalstemcells，简称ISCs)存在 于小肠腺窝底端，其具有分化成短暂扩增细胞（transitamplifyingcell，简称TC细胞） 的能力，该细胞会更进一步分化为二种主要细胞类型，包括吸收（absorptive)系统及分泌 (secretory)系统。小肠干细胞是一种有潜力的干细胞，然而，小肠干细胞的分离及增殖常 面临缺乏生物标记及有效长期培养方法的困境，良好的培养系统需维持小肠干细胞的增生 及分化能力。先前研究描述了一种能长期培养并维持小肠干细胞特性的体外长期培养系 统，该系统使用市面上购得的已添加必要生长因子的高等DMEM/F12(advancedDMEM/F12) 培养基，用以将小肠干细胞培养在三维培养基中，该小肠干细胞会形成类器官（organoid) 的腺窝_绒毛球状结构。然而，发展体外培养小肠干细胞培养基对于临床上的应用及小肠 干细胞的体外增殖培养技术仍有迫切的需要。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，该培养基包含基础培养 液；转铁蛋白（transferrin);乙醇胺（ethanolamine);抗坏血酸、或其盐、或其酯；谷胱甘 肽或其盐（glutathione);及亚硒酸钠（sodiumselenite)，其中，乙醇胺于该培养基中的 浓度范围为0. 5mM至小于5mM。
[0004] 于本发明的一具体实施例中，该基础培养液选自由DMEM培养基、DMEM/F12培养 基、RPMI1640培养基及Eagle's培养基所组成组的至少一种。
[0005] 于本发明的一具体实施例中，转铁蛋白于该培养基中的浓度范围为1. 8X103mM 至小于 1. 8X10 2mM。
[0006] 于本发明的一具体实施例中，抗坏血酸、或其盐、或其酯于该培养基中的浓度范围 为 0? 05mM至小于 0? 617mM。
[0007] 于本发明的一具体实施例中，谷胱甘肽或其盐于该培养基中的浓度范围为0. 05mM 至小于0. 647mM。
[0008] 于本发明的一具体实施例中，亚硒酸钠于该培养基中的浓度范围为5X10 4mM至 小于6. 5X10 3禮。
[0009] 于本发明的一具体实施例中，经该培养基培养的小肠干细胞仍具有自我更新性及 干细胞特性（sternness) 〇
[0010] 于本发明的一具体实施例中，经该培养基培养的小肠干细胞对于Msil、Bmil、 Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一种或多种为阳性。
[0011] 本发明进一步提供一种体外培养小肠干细胞的方法，该方法包含使用本发明的培 养基以培养小肠干细胞。
【附图说明】
[0012] 图1为小肠干细胞体外培养的时程图，其显示以包含2%血清的高等DMEM/F12培 养基培养可使小肠干细胞长时间维持在尚未形成类肠状物（enteroid)的阶段，其中，图中 的数字表示培养的天数；
[0013] 图2显示不同生长因子对于体外培养小肠干细胞的影响，其中，小肠干细胞的初 始密度为5000个/12孔，培养7日后计算每孔中类肠状物形成的数量，该结果以3个实验 的平均值表示，且横杆表示其标准差；
[0014] 图3显示以部分析因设计（fractionalfactorialdesign，简称FFD)的筛选结 果，以1000个/24孔小肠干细胞的密度计算，该结果以3个实验的平均值表示，且横杆表示 其标准差，并与控制组（高等DMEM/F12培养基培养，其结果具有108个/孔小肠干细胞） 做比较；
[0015] 图4为依据"取得培养该小肠干细胞最适组成成分的组成浓度的最速上升途径" 所得出培养小肠干细胞的最适组成成分的组成浓度及其实验结果，其中，（A)、（B)、（C)是三 个不同的实验，小肠干细胞的初始密度为1000个/24孔，其结果与控制组（以高等DMEM/ F12培养基培养，其结果具有116个/孔小肠干细胞（平均值））做比较；
[0016] 图5为小肠干细胞在无血清培养环境下的生长情形，其中，小肠干细胞的初始密 度为1000个/24孔，该结果以3个实验的平均值表示，且横杆表示其标准差；
[0017]图6为以定量PCR测试小肠干细胞标志基因的相对表达量，收集在各培养基中 培养7日的小肠干细胞以进行基因表达分析；(A)在6种不同培养基中Lgr5基因的表达 量；(B)Bmil基因的表达量；(C)Msil基因的表达量；(D)PTEN基因的表达量；(E)CD24基因 的表达量；(F)CD44基因的表达量，将其结果与控制组（新分离的小肠干细胞）做比较，且 以小鼠的GAPDH作为内部控制组，又利用2AACT方法计算其倍数诱发值（fold-induction value)，且利用GAPDH标准化各该基因的表达情形；
[0018] 图7为以Lgr5抗体标示的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基 中培养7日后，以Lgr5抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞（图中标示为C 者），于（A)在高等DMEM/F12培养基（含胎牛血清），图中标示为Adv. -Lgr5者、（B)本发 明的最佳培养基（含胎牛血清），图中标示为M-Lgr5者及（C)本发明的最佳培养基（不含 胎牛血清）中，图中标示为SF-M-Lgr5者，该小肠干细胞的Lgr5表达量均上升；
[0019] 图8为CD24抗体的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基中培养7 日后，以CD24抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞（图中标示为C者），于（A) 在高等DMEM/F12培养基（不含胎牛血清），图中标示为Adv. -CD24者及（B)本发明的最佳 培养基（不含胎牛血清），图中标示为SF-M-CD24者；
[0020] 图9为CD44抗体的流式细胞仪分析图，其显示小肠干细胞在不同培养基中培养7 日后，以CD44抗体标记的萤光强度；相较于新分离的小肠干细胞（图中标示为C者），于（A) 在高等DMEM/F12培养基（不含胎牛血清），图中标示为Adv. -CD44者及（B)本发明的最佳 培养基（不含胎牛血清），图中标示为SF-M-CD44者；以及
[0021] 图10为在不同培养基配方（高等DMEM/F12培养基、一般DMEM/F12培养基及本发 明的最佳培养基）中以及包含或不包含胎牛血清环境下，小肠干细胞的类肠状物的细胞型 O
【具体实施方式】
[0022] 以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明 书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明亦可通过其它不同的实施方式加 以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所揭示 的精神下赋予不同的修饰与变更。
[0023] 本发明提供一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，其包括基础培养液、转铁蛋 白、乙醇胺、抗坏血酸盐、谷胱甘肽以及亚硒酸钠。该基础培养液为选自细胞培养相关技术 领域中常用者，例如DMEM培养基、DMEM