分，该设计 模型如表 3 所不，再通过SPSS(StatisticalPackagefortheSocialScience)执行收 集自部分析因设计法所获得的实验数据，以获得一阶回归模型（first-orderregression model)，该模式采用下列方程式：
[0049] 小肠干细胞（类肠状物/孔）=a〇+E aiXi
[0050] 其中，a及Cii为固定系数，且Xi为待试验的培养基成分的编码变因。该模型的 固定系数可提供建构该最速上升途径（thesteepestascentpath)的信息以获得用于培 养小肠干细胞的培养基的最适组成分浓度。详言之，该固定系数越大，其相对应的组成分有 越重要的影响，若出现负值，则表示其相对应的组成分具有抑制的效果。后续实验即以此回 归模型所显现的梯度为基础，以得出类肠状物数量最大化的方向进行。
[0051] 表3、利用2(6 2)部分析因设计的模型及实验结果
[0052]
[0057] 如图3及表4结果所示，该结果是以部分析因设计法得出的16种培养基组成模 式，相较于控制组（高等DMEM/F12培养基及+veGM)，发现转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸磷酸 酯、谷胱甘肽单钠及亚硒酸钠此5种成分，对于小肠干细胞的生长具有显著的影响，故以上 述五种成分作为培养该小肠干细胞的最适组成分。
[0058] 3?第三次筛选：
[0059] 以第二次筛选所获得的5种最适组成分进行最速上升途径，通过该途径以最少的 实验次数找出培养小肠干细胞组成分的最适浓度。
[0060] 如表5及图4所示，由步骤10的结果可知，培养基中转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸 磷酸酯、谷胱甘肽单钠以及亚硒酸钠的浓度在分别为I. 08X 10 2mM、5mM、0. 617mM、0. 647mM 及6. 5 X 10 3mM时，结果获得每孔形成90±33. 8个类肠状物（平均值），相较于控制组（以 高等DMEM/F12培养基培养）每孔形成116 ±41. 6个类肠状物（平均值），可知步骤10的 培养基对于类肠状物的形成数量并无助益。而在第5步骤时，以浓度分别为5. 4X 10 3mM、 I. 5mM、0. 185mM、0. 194mM及1. 95X 10 3mM的转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸磷酸酯、谷胱甘肽 单钠以及亚硒酸钠所构成的培养基培养小肠干细胞，其结果获得每孔形成146±50. 2个类 肠状物，相较于控制组（以高等DMEM/F12培养基培养）每孔形成116±41. 6个类肠状物。 以下将此组成成分及浓度的培养基称作"最佳培养基"。
[0061] 表5、根据最速上升途径所得出的培养基组成分浓度
[0062]
[0063] 4?第四次筛选：
[0064] 本步骤测定无胎牛血清培养环境下对于小肠干细胞生长的影响。如表6所示，设 计6种不同培养基以测定根据上述第三次筛选所得的最佳培养基，在无胎牛血清环境下， 对小肠干细胞的生长影响。本测试在24孔盘中进行。
[0065] 表6、用于培养小肠干细胞的无胎牛血清培养基
[0066]
[0067] 如图5所示，小肠干细胞在本发明的最佳培养基中（含胎牛血清）形成每孔 235±17. 6个类肠状物，其结果大于于控制组培养基（含胎牛血清的高等DMEM/F12培养 基）的每孔194±31. 7个类肠状物。此外，以本发明的最佳培养基（无胎牛血清）培养小 肠干细胞，其结果显示与高等DMEM/F12培养基（包含或不包含胎牛血清）的控制组具有类 似的生长模式。此结果表示本发明的最佳培养基在不包含胎牛血清的情况下，较其它种类 培养基（包含或不包含胎牛血清），可使小肠干细胞获得较佳的生长结果。
[0068] 实施例4经培养后的小肠干细胞标志的基因表达
[0069] 以实时定量逆转录酶-聚合酶链反应（real-timequantitativeRT-PCR)测试本 发明的最佳培养基（含或不含血清），是否可以在培养过程中维持小肠干细胞的自我更新 (self-renewal)及其分化能力。
[0070] 1.选择小肠干细胞标志基因：
[0071] 本实施例选用先前研究所揭示的小肠干细胞标志基因，其包括RNA结合蛋白武 藏同源物l(RNA_bindingproteinMusashihomolog1，简称Msil)、多梳型复合蛋白 Bmil(Polycomt)complexproteinBmil，简称Bmil)、富含白胺酸重复序列的G-蛋白偶联 受体 5 (Leucine-richrepeat-containingG-proteincoupledreceptor5,简称Lgr5)、 磷酸酯酶及张力蛋白同源物（Phosphataseandtensinhomolog，简称PTEN)、CD24及CD44 作为指针，观察经本发明的小肠干细胞培养基培养后，是否仍维持干细胞的特性。
[0072] 2.定量聚合酶连锁反应
[0073] (1)萃取小肠干细胞的RNA
[0074] 收取IXIO6小肠干细胞，利用变性剂-Trizol将细胞裂解，每一样品添加1ml，以 破坏细胞结构并溶解蛋白质，使该细胞中的核内蛋白与核酸分离，并使RNA分解酶失去活 性后，所得的细胞溶解液再以酸性的氯仿萃取，可有效将RNA分离到水层。将ImlTrizol溶 液（Ambion，USA)加入样品并利用吸管来回吸取数次（pipeting)使其均质化。在室温下静 置5分钟，使其完全与核蛋白复合体（nucleoproteincomplexes)分离。接着加入200iil 的氯仿（Mailinckrodt，USA)，以手震荡试管30次使其均匀混和后，静置于室温下3分钟。再 将该试管于13000rpm在4°C下离心30分钟，将上层的水层移至新的试管中并加入450y1 异丙醇（Sigma，USA)以沉淀RNA，并将该试管以漩涡搅拌器震荡后，在室温下放置10分钟。 之后于13000rpm下将该试管在4°C下离心30分钟，小心地取出上清液后，将所得RNA沉淀 物以Iml75% 乙醇-焦碳酸二乙酯水溶液（ethanol-diethylpyrocarbonatewater)(Bio Protech，Taiwan)清洗。再将该沉淀物以漩祸搅拌器震荡后，于13000rpm下，在4°C下离心 15分钟。小心地移除上清液后，将该沉淀物在室温下风干10分钟，干燥后，该沉淀物的颜色 将从白色转为无色。此时，加入20y1的焦碳酸二乙酯水溶液使RNA溶解。最后将该RNA 样品在50-60°C下加热10分钟后离心沉淀的。
[0075] (2)逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR)
[0076] 利用PrimeScript?RT试剂盒（TaKaRA,Japan)，其中该试剂如表7所示，进行逆转 录酶-聚合酶链反应，将上述所得的RNA转录成互补DNA(complementaryDNA，简称cDNA)。 将所得的cDNA稀释五倍以用于以下实验。
[0077] 表7、RT-PCR试剂组成分
[0078]
[0079] (3)SYBRGreen定量聚合酶链反应（QuantitativePCR)
[0080] 使用Primer3软件设计所需的引物（primer)，其引物如表10所示，再利用 KAPASYBR_?FASTqPCR试剂盒（KapaBiosystems，USA)，该试剂盒的试剂及qPCR反应条 件如表8及9所示，以进行实时聚合酶链反应（real-timePCR)，并以甘油醛-3-磷酸脱氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehyd