rogenase，简称GAPDH)标准化mRNA的表达量，以 测量mRNA的相对表达量。最后以AACtK较方法（AACcomparativemethod)分析各 基因的表达情形。
[0081] 表8、SYBRGreen定量聚合酶连锁反应试剂组成分
[0088] 如图6A至6F结果所示，于本发明的最佳培养基中（包含或不包含胎牛血清）培养 一星期，小肠干细胞的Lgr5基因表达量，均高于刚分离出的小肠干细胞；而于本发明的最 佳培养基（含胎牛血清）中培养的小肠干细胞的Lgr5基因表达量，则较培养于高等DMEM/ F12者（含胎牛血清）多出一倍；另外，在本发明的最佳培养基（无胎牛血清）培养的小肠 干细胞的Lgr5基因表达量，又比培养于高等DMEM/F12者（无胎牛血清）多出二倍。于本 发明的最佳培养基（包含或不包含胎牛血清）培养的小肠干细胞的Bmil、PTEN及CD24基 因表达量，均分别较培养于高等DMEM/F12者（包含或不包含胎牛血清）为多。然而，于本 发明的最佳培养基（包含胎牛血清）中培养的小肠干细胞的Msil基因表达量，相较于培养 于高等DMEM/F12者（包含胎牛血清）轻微地减少，但在本发明的最佳培养基（无血清）及 高等DMEM/F12 (无血清）培养的小肠干细胞的Msil基因表达量则相近。另一方面，于本发 明的最佳培养基（包含或不包含胎牛血清）培养的小肠干细胞的CD44基因表达，均高于培 养于高等DMEM/F12者（包含或不包含胎牛血清）。综上，本测试结果显示于本发明的最佳 培养基（包含或不包含胎牛血清）中培养小肠腺窝细胞，可维持小肠干细胞的再生性及分 化能力。
[0089]实施例5以流式细胞仪分析小肠干细胞表面抗原标记
[0090] 本实施例以Lgr5、⑶24及⑶44抗体标记自类肠状物所分离的细胞，并以BD的C6 流式细胞仪分析。小肠干细胞培养至第7天时，将各孔中的类肠状物收集并以机械方法将 其消化分解成单一细胞。取密度为IXIO6的细胞，将该细胞以PBS清洗后，以2000rpm离心 5分钟，除去上清液后将沉淀物重新悬浮于500yIPBS。之后，加入10y1的Lgr5初级抗体 (Abgent，USA)并在4°C下避光反应90分钟。反应后，再将该样品以PBS清洗后，以2000rpm 离心5分钟，除去上清液，再将沉淀物重新悬浮于500yIPBS中。接着，加入4y1的萤光异 硫氰酸盐（Fluoresceinisothiocyanate，简称FITC)所结合的羊抗兔（FITC-conjugated goat-anti-rabbit)次级抗体（BDBiosciences,USA)，并在4°C下避光反应40分钟。再将该 样品以PBS清洗后以2000rpm离心5分钟，除去上清液后将沉淀物重新悬浮于500yIPBS， 并直接以BDC6流式细胞仪分析。在⑶24及⑶44标记的试验中，使用如上述标记方法进 行试验，但分别加入4iU⑶24及12iU⑶44并在4°C下避光反应30分钟。最后以流式细 胞仪进行样品的分析。
[0091] 如图7所示，相较于刚分离的小肠干细胞，于本发明的最佳培养基中（包含或不包 含胎牛血清）培养的小肠干细胞的Lgr5蛋白质表达量显著的增加。同样地，如图8所示，相 较于刚分离的小肠干细胞，于本发明的最佳培养基中（无胎牛血清）中培养的小肠干细胞 的CD24蛋白质表达量亦显著的增加。然而，如图9所示，于本发明的最佳培养基（无胎牛 血清）中培养的小肠干细胞的CD44的蛋白质表达量，相较于培养在高等DMEM/F12者（无 胎牛血清），只有些微地增加。因此，此结果确认本发明的最佳培养基（包含或不包含胎牛 血清）可维持小肠干细胞体外培养时的增生、再生性及分化能力。
[0092] 实施例6小肠干细胞在无血清环境中的培养及其细胞型态
[0093] 本实施例测试小肠干细胞在无血清环境中培养，可与于含血清环境中培养形成相 同的细胞型态。将小肠干细胞分别于高等DMEM/F12培养基（包含或不包含胎牛血清）、一 般DMEM/F12培养基（包含或不包含胎牛血清）及本发明的最佳培养基（包含或不包含胎 牛血清）培养7日后，观察其细胞型态。
[0094] 如图10所示，所有的小肠干细胞的类肠状物均形成一样的细胞型态，表示于本发 明的最佳培养基及无血清环境中培养的小肠干细胞，并不会形成不良的细胞型态。
[0095] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何该 领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此， 举凡所属技术领域中具有此项专业知识者，在未脱离本发明所揭示的精神与技术原理下所 完成的一切等效修饰或改变，仍应由权利要求书所涵盖。
【主权项】
1. 一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，包含： 基础培养液； 转铁蛋白； 乙醇胺，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0. 5mM至小于5mM ; 抗坏血酸、或其盐、或其酯； 谷胱甘肽或其盐；以及 亚硒酸钠。2. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包含胎牛血清或胎牛血清衍生物。3. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该基础培养液选自由DMEM培养基、 DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle' s培养基所组成组的至少一种。4. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该转铁蛋白于该培养基中的浓度范围 为 I. 8 X 10 3mM 至小于 I. 8 X 10 2mM。5. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该抗坏血酸、或其盐或其酯于该培养基 中的浓度范围为0. 05mM至小于0. 617mM。6. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该谷胱甘肽或其盐于该培养基中的浓 度范围为0. 05mM至小于0. 647mM。7. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，该亚硒酸钠于该培养基中的浓度范围 为5 X 10 4mM至小于6. 5 X 10 3禮。8. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞仍保持 其自我更新性及干细胞特性。9. 根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞对于 Msil、Bmil、Lgr5、PTEN、CD24 及 CD44 的一种或多种为阳性。10. -种体外培养小肠干细胞的方法，包含使用权利要求1所述的培养基培养小肠干 细胞。11. 权利要求10所述的方法，其特征在于，该培养基进一步包含胎牛血清或胎牛血清 衍生物。12. 权利要求10所述的方法，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞仍保持其自 我更新性及干细胞特性。13. 权利要求10所述的方法，其特征在于，经该培养基培养的小肠干细胞对于MsiU Bmil、Lgr5、PTEN、CD24及CD44的一种或多种为阳性。
【专利摘要】本发明提供了一种用于体外培养小肠干细胞的培养基，包含基础培养液；转铁蛋白；乙醇胺；抗坏血酸、或其盐、或其酯；谷胱甘肽或其盐；及亚硒酸钠，其中，乙醇胺于该培养基中的浓度范围为0.5mM至小于5mM。本发明进一步提供一种体外培养小肠干细胞的方法，该方法包含将所分离的小肠干细胞于本发明的培养基中培养。本发明提供的培养基可提供小肠干细胞更佳的生长环境，并维持其未分化的细胞型态及干性胞特性，且不含血清，对于临床上的应用更具潜力。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105087459
【申请号】CN201510208071
【发明人】陈芸, 姚少凌
【申请人】医疗财团法人徐元智先生医药基金会亚东纪念医院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年4月28日