/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle's培养基等。
[0024] 本发明自公知高等DMEM/F12培养基中所包含的9种生长因子（例如：抗坏血酸 磷酸酯、AlbuMAXII、人转铁蛋白、重组胰岛素全链、谷胱甘肽单钠、偏钒酸铵、氯化锰、亚硒 酸钠及乙醇胺）筛选出培养小肠干细胞的最适成分，该最适成分包括转铁蛋白、乙醇胺、抗 坏血酸盐、谷胱甘肽及亚硒酸钠，之后，再以部分析因设计法及SPSS软件得出各最适成分 的浓度，以得出"最佳培养基"，该最佳培养基包含基础培养液、转铁蛋白、乙醇胺、抗坏血酸 盐、谷胱甘肽以及亚硒酸钠。该基础培养液选自培养细胞相关技术领域中常用者，例如自由 DMEM培养基、DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基及Eagle's培养基等。
[0025] 于本发明的一具体实施例中，通过显微镜观察及小肠干细胞标志基因的表达，显 示出以公知的高等DMEM/F12 (含有胎牛血清）培养基培养的小肠干细胞，可以保持该小肠 干细胞在未分化阶段的类肠状物形态，并维持其干细胞的分子生物学特性，而以最佳培养 基培养者（不含胎牛血清），可得到更多的类肠状物，且其小肠干细胞标志基因的表达量亦 上升，表示本发明的最佳培养基可提供小肠干细胞更佳的生长环境，并维持其未分化的细 胞型态及干性胞特性，且不含血清，对于临床上的应用更具潜力。
[0026] 本发明说明书中所提及的"抗坏血酸、或其盐、或其酯"意指包含抗坏血酸、抗坏血 酸盐（例如：钠盐、镁盐、钙盐等）及抗坏血酸酯。其中，该抗坏血酸、或其盐、或其酯最佳选 自抗坏血酸磷酸酯。
[0027] 本发明说明书中所提及的"谷胱甘肽或其盐"意指包含谷胱甘肽及谷胱甘肽盐 (例如：钠盐、镁盐、钙盐等）。其中，该谷胱甘肽盐最佳选自谷胱甘肽单钠。
[0028] 实施例
[0029] 实施例1小肠干细胞的分离及体外培养
[0030] 将重量大约50至60克（g)、3周大的C57BL/6JNarl小鼠（NLAC台湾）牺牲后取 出其小肠并以冷磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，简称PBS)(Hyclone,美国 (USA))冲洗，将该小肠切成5毫米（mm)的片状物并纵向展开后移入含有3毫摩尔（mM)乙 二胺四乙酸（61：11716116(11&111；[116七61：抑&。61：；[。&(^(1，简称￡01六）（3181]1&，1]3六）及2%庆大霉素 (gentamicin) (GIBCO,USA)的PBS中，以定轨摇床（orbitalshaker)在 4°C下振动 30 分钟。 再手持振动30秒后，将该小肠组织片状物移入冷PBS中，再以定轨摇床振动5分钟。接着 将该小肠组织于漩涡搅拌器（vortex)上振动以使该小肠组织中的小肠干细胞因震荡而释 入于溶液中，再通过70微米（ym)过滤器过滤，将该过滤液在4°C下以200g离心10分钟后 获得小肠干细胞沉淀物。
[0031] 以高等DMEM/F12培养基（GIBCO,USA)将该小肠干细胞沉淀物重新悬浮， 将5000个初始小肠干细胞种入含有层连结蛋白（laminin)的基质胶（matrigel)(BD Biosciences，USA)的 12孔盘中，并以补充有2mML-谷胱甘肽（L-glutamine) (Sigma，USA)、 100单位/毫升（units/mL)的盘尼西林（Gibco,USA)、100毫克/毫升（yg/mL)的链霉素 (Gibco,USA)及2%胎牛血清（Fetalbovineserum，简称FBS) (Hyclone,USA)的高等DMEM/ F12培养基覆盖，另外再加入50纳克/毫升（ng/ml的上皮生长因子（Epidermalgrowth factor，简称EGF)(R&Dsystems，USA)、500ng/ml的R-反应蛋白（spondin)、100ng/ml的 头蛋白（Noggin)(PeproTechECLtd,USA)、ltiMJag-I胜妝（Anaspec，USA)、2.5ng/ml Wnt3a(Sigma,USA)及IOyMY-27632 (Sigma,USA)进行体外培养。该小肠干细胞均培养7 至14天，每3天更换培养液。
[0032] 统计分析
[0033] 各数据以T检验（Student'st-test)分析，并以p值〈0. 05认定为具有统计学显 著性。
[0034] 实施例2小肠干细胞在体外（invitro)的生长情形
[0035] 本实施例以高等DMEM/F12培养基及2 %胎牛血清于体外培养小肠干细胞，并观察 其生长情形。将小肠干细胞种入培养基后，该小肠干细胞会快速的从常态小肠腺窝构造转 变成球体结构（spheroidstructure)的肠球体（enterosphere);继续培养时，该肠球体 转变成充满凋亡细胞（apoptoticcells)的类肠状物；该类肠状物具有绒毛区域（villus domain)及不断继续出芽的腺窝区域（cryptdomain)。
[0036] 如图1所示，使用包含2%胎牛血清的高等DMEM/F12培养基可持续培养小肠干细 胞30至45天，直到形成类肠状物的结构。本实施例的结果显示，经由上述实施例1所分离 的小肠干细胞确实具有干细胞活性，而且该小肠干细胞功能在以高等DMEM/F12培养基及 2%胎牛血清的体外培养基中可以持续维持没有丧失。
[0037] 实施例3培养小肠干细胞的培养基最适成分分析
[0038] 1?第一次筛选：
[0039] 本步骤测试12种不同的培养基，其详细组成分及浓度如表1及表2所示，以测试 在分别除去9种生长因子的高等DMEM/F12培养基培养时，该小肠干细胞生长的影响。将实 施例1分离所得的小肠干细胞种入各种不同培养基中，培养7天后计算各孔盘中类肠状物 形成的数量。
[0040] 表1、包含在高等DMEM/F12培养基中但不涵盖于一般DMEM/F12培养基的9种生长 因子
[0041]
状物形成的数量为每孔306±5. 7个，而培养基在缺乏转铁蛋白、偏钒酸铵及乙醇胺时，其 类肠状物形成数量明显减少至分别为每孔232±2. 6、207±27. 8及199±51. 5个；而培养 基在缺乏抗坏血酸酯、谷胱甘肽单钠及亚硒酸钠的实验组中，其结果显示该培养基在缺乏 抗坏血酸、谷胱甘肽及亚硒酸钠时，其类肠状物形成数量减少至分别为每孔273. 7±3. 2、 269. 0±3. 6及241. 3±75. 4个，对于类肠状物的形成数量上显示影响较小；而当培养基在 缺乏AlbuMXII、重组胰岛素全链及氯化锰的实验组中，其类肠状物形成数量分别为每孔 261. 3±49. 0、275. 0±18.O及265. 7±12. 5个，其结果显示对于类肠状物的形成数量上仅 有轻微的影响，虽然经由图2结果可知，在缺乏AlbuMAXII及氯化锰这两组中的数据，平均 值较缺乏抗坏血酸及谷胱甘肽低，但是其标准差也较大，统计的后发现其差别不具显著意 义，所以不选择AlbuMAXII及氯化锰这两个因子进行第二次的筛选。因此，经第一次筛选 的结果获得6种具有影响类肠状物形成的生长因子，即转铁蛋白、偏钒酸铵、乙醇胺、抗坏 血酸、谷胱甘肽钠及亚硒酸钠。
[0047] 2?第二次筛选
[0048] 将上述第一次筛选所获得6种影响类肠状物形成的生长因子，在减少部分实验 组数为目的下，经由一般常见的工程实验设计技术及应用软件（例如：designexpert software)计算下，获得2(6 2)部分析因设计法设计培养小肠干细胞的最适组成