无血清培养基的制作方法

无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于间充质干细胞生长的无血清培养基，所述培养基包含FGF、TGF?β和脂蛋白。
【专利说明】
无血清培养基
技术领域
[0001] 本发明设及一种无需使用血清作为培养基组分的干细胞生长培养基、利用该培养 基的方法W及使用该培养基生产的细胞。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(MSC)是多潜能细胞，它可W分化成多种细胞类型，包括:成骨细胞 (骨细胞）、软骨细胞(软骨的细胞)和脂肪细胞(脂细胞）。运种能力已对活体动物的特定细 胞和组织W及他们在组织培养中生长的相应部分证实。
[0003] MSC是基于细胞的药物发现W及对许多人类疾病的潜在治疗的宝贵资源。MSC治疗 包括移植物抗宿主病、多发性硬化症、克罗恩病、1型糖尿病、骨折和骨关节炎等疾病的潜力 目前正在临床试验中。
[0004] 据估计，MSC仅占骨髓单核细胞总数的0.001-0.01 % ;因此，运类群需要广泛的体 外细胞培养扩大W获得足够的数量用于基础生物或临床应用。目前临床应用中使用大约1 亿个细胞的剂量。
[0005] 再生医学和细胞疗法的目前发展表明，在未来几年里，在细胞加工技术方面会有 一个巨大的增长。运将设及成体和胚胎干细胞，W及用于治疗目的的体细胞。此外，干细胞 诱导性多能干细胞在药物筛选应用中使用的增加将大幅增加对细胞加工技术的需求。
[0006] 分离和培养运些MSC大部分依赖于动物制品的使用，特别是胎牛血清(FBS)。
[0007] 干细胞需要特定的生长条件。目前，骨髓来源的MSC在含血清培养基中分离、培养 和分化。
[000引几乎所有的在实验室培养中生长的哺乳动物细胞都需要在生长培养基中存在 FBS，它提供了细胞附着和增殖所必需的激素和生长因子。运包括目前正在研究的用于治疗 用途的人类细胞，如成体干细胞、胚胎干细胞W及其他体细胞。FBS是从肉类加工行业得到 的胎牛血中获得的，它通常按照体积百分比浓度10%加入到生长培养基中。因此，干细胞的 供给依赖于让它们生长的合适培养基的获得。
[0009] 该技术已成功地应用几十年了，FBS是最常用的生长培养基的补充剂，因为胎血中 存在蛋白质的复合混合物W及高水平的生长刺激因子。然而，在使用FBS时也存在相关问 题，其中一些如下：
[0010] 1.疾病传播到细胞疗法接受者的风险；
[0011] 2.疾病传播到加工技术人员和医务人员的风险；
[001 ^ 3.产品的不确定性和季节性供应；
[0013] 4.需要在-20°C下冷冻保存；
[0014] 5.批次与批次之间的显著变化；
[001引6.因需求增加，预期主要供应链的问题。
[0016] FBS在用于人类治疗的细胞生产中使用，主要相关问题是传染性物质传播到接受 者的风险。此外，还有一个相当大的风险，与处理运些材料的加工技术人员和医务人员相 关。运种风险在最近几年变得非常严重，因为传染性牛海绵状脑病(BSE)俗称疯牛病的出 现，W及人类获得变异型克雅氏病(vCJD)的相关风险。迄今为止，BSE已在欧洲、北美和世界 其他许多地方的牛中被检测到。几乎所有现在批准用于人类治疗的细胞生长中的FBS，都来 自澳大利亚和新西兰，运些地方仍然是没有B沈的。
[0017] BSE在世界各地的牛群中的出现，也导致重大的供应问题，预计会对未来的细胞疗 法可用性造成严重影响。目前，运种有限供应的血清一般是足够实验室和研究使用的。然 而，运些实验室和研究用途中的某些是针对生产将要进行中型或大型规模生产的商业产 品。目前没有批准用于一般性使用的干细胞技术申请。因此，可W设想，当一个干细胞技术 被释放为一般性使用时，血清的供应将根本不能满足运种需求。
[0018] 事实上，可W预见的是，当细胞治疗产品被批准仅仅用于两个主要的适应症时，整 个全球被批准的供应，即没有BSE的FBS，将会在制造的一年内消耗完。因此，当细胞疗法获 得监管部口的批准和使用时，将会出现显著而前所未有的对于无 FBS的生长培养基的需求。 显然，干细胞生长培养基的供应将会成为干细胞技术的应用的限制因素。
[0019] 此外，FBS是一种异质混合物，运导致血清批次之间缺乏再现性与性能。血清中包 含许多不明或非量化的组分，因此不能被"定义"，也不能被再合成制造。因此，批次与批次 之间变化的血清组合物，用于实验或其他用途的细胞培养时，使得标准化困难。同时，MSC是 贴壁细胞群，目前运种附着到组织培养塑料上的能力大部分依赖于FBS。
[0020] 事实上，由于FBS中的很多组分影响细胞附着、增殖和分化，控制运些参数，或相对 于运些参数研究细胞具体要求，可W排除血清的使用。此外，血清的某些组分会抑制特定细 胞类型的增殖，并在一定程度上可能抵消其增殖作用，导致次优的生长。
[0021] 运种FBS的异质性引起生长特性的变化导致血清批次间缺乏重现性，导致基于细 胞的产品和治疗面临制造和增长的问题。在良好制造协议(GMP)下制造的产品尤其如此，它 是W使用一致的(并因此是可靠的)初始材料为先决条件。
[0022] 此外，从治疗和管理的角度来看，FBS的存在是不理想的，因为运可能导致动物病 原体的转移。虽然血清被批准用于医疗用途，它可能含有影响实验结果的病毒，或当培养的 细胞意图用于植入人体时提供一个潜在的健康危害。此外，从监管的角度来看，在临床设置 中使用的动物源性产品是不可取的，不仅是因为有传染性病原体传播的的风险，而且还有 引起免疫应答的潜在性。
[0023] 因此，为繁殖和/或产生干细胞，存在对无需添加血清的生长培养基的需求。任何 运种新的生长培养基，最好是相对简单，而且易于大量生产。
[0024] 因此，人们已经做出努力，W消除培养基中的FBS，和开发一种能够在活体外（ex vivo)扩增MSC的明确的无血清培养基。
[0025] W02011/111787公开了一种细胞制剂，其包含能维持免疫抑制能力的间充质干细 胞，由无血清或低血清培养基生产得到。其描述了一种包含间充质干细胞的细胞制剂的制 备方法，包括:一增殖步骤，其中间充质干细胞在包含。6。、？〇6。^6。-0、服。、66。、至少一种 憐脂和至少一种脂肪酸的培养基中进行增殖;和一筛选步骤，其中，增殖步骤后的间充质干 细胞经筛选，得到维持或改善免疫抑制能力的间充质干细胞。
[00%] W098/104681公开了一种明确的无血清细胞培养基，它包含补充混合物、组分混合 物、维生素混合物、无机盐混合物和氨基酸混合物。运种明确的培养基被公开用于培养成纤 维细胞，尤其是软骨细胞。该发明还公开了一种使用肿瘤生长因子e(TGF-e)增强软骨细胞 的分化W及提高软骨特异性基质的合成的方法，W及使用TGF-0和膜岛素样生长因子(IGF) 的组合来增强软骨细胞分化的方法。
[0027] 对于MSC的其他培养基也曾被提出。W0 2005/113751公开了MSC在无血清培养基中 的扩增；运种培养基是非常复杂的，除其它组分外，有些可W包含bFGF和TGF-e"US2010/ 0279412也公开了一种无血清培养基，其可包含。6。、了6。、66。、憐脂酸、憐脂酷胆碱和维生素 CoQiase et al ,Stem Cell Research&Therapy 2010,1:8公开了一种用于人类MSC的无血 清培养基，它包含bFGF、TGF-化和PDGF。
[0028] 本发明的目在于提供一种用于干细胞生长的培养基及方法，其作为上述的至少一 个替代，并优选解决或至少改善一个或多个现有技术确认的问题。特定的实施例的目的在 于提供一种用于MSC生长的培养基，无需补充血清，因此容易获得而且相对便宜。

【发明内容】

[0029] 因此，本发明提供了用于一种用于培养干细胞的无血清培养基，包括：
[0030] (a)成纤维细胞生长因子(FGF);
[0031] (b)转化生长因子e(TGF-e);和
[0032] (C)脂蛋白。
[0033] 本发明的一个优点是，它能生产一种完全没有FBS的培养基，即无血清生长培养 基，其适合干细胞的增殖和组织培养，尤其是间充质细胞，尤其是人类细胞和组织。
[0034] 此外，本发明的培养基适合于直接增殖从骨髓中分离的细胞，即，运些分离的细胞 可W直接放置在本发明的培养基中进行培养，不需要首先在含有血清的培养基中进行解育 或增殖。
[0035] 本发明培养基的另一个优点在于，细胞在在缺氧条件下培养可显示优越的生长动 力学。
[0036] 使用本发明培养基去生产细胞的进一步的优点在于:与现有技术中基于血清的培 养基相比，本发明培养基的使用可增加细胞的产量。与W前使用的条件下相比，本发明的培 养基能使制造商获得高得多的产量的细胞(至少十倍W上）。因此，每剂量的生产成本降低 了约90%。因此，除了增强本发明培养基中细胞的生长特性，该培养基还有望提高从事生产 临床试验和用途的基于MSC的产品的临床制造企业的竞争力。目前，在符合GMP的条件下，临 床使用所需的大量MSC的生产成本，是企业发展再生医学疗法的主要问题之一。
[0037] 此外，运种确定的培养基可W完全在符合GMP的标准下大规模生产，适用于人类细 胞生长的使用。因而本发明的无血清培养基，在体外细胞培养的研究过程中，允许较大的重 现性。
[0038] 因此，本发明培养基的一些进一步优点在于：
[0039] -制造商不再受FBS供应不确定性的制约；
[0040] -疾病传播的风险去除，因为所有原材料可来源于GMP供应商；
[0041] -克服了基于血清的生长培养基出现的批次间不同的问题;此外，由于无血清培养 基具有确定的组成，无需制造商或研究者进行血清"批次试验"。
[0042] 无血清培养基的使用因此为细胞疗法从实验到临床使用的监管提供了重要的保 障。当单一的临床剂量的生产成本昂贵得让人望而却步是因为每次生产的细胞产量可怜的 时候，无血清培养基也大大降低了大规模生产MSC的成本，特别是GMP条件下培养的细胞用 于治疗用途。
[0043] 该培养基还可包含表皮生长因子化GF)，合适浓度为Ing/ml到lOOng/ml，优选为 2ng/ml到50ng/ml，或化g/ml到25ng/ml;在一个具体的例子中，EGF在培养基中的浓度为大 约lOng/ml。该培养基还可包含纤连蛋白，浓度合适地为化g/na到lOOiig/ml，优选为化g/ml 到2化g/ml。
[0044] 在本发明的培养基中包含EGF和纤连蛋白的优点在于，使用时，直接取自骨髓的样 本在运样的培养基产生每集落形成单位(CFU)最多的细胞。
[0045] 脂蛋白是复合颗粒，它在体内运输胆固醇、憐脂和甘油=醋。脂蛋白包括，从最大 到最小（最不密集到最密集），乳糜微粒(ULDL)、极低密度脂蛋白（VLDL)、中间密度脂蛋白 (IDL)、低密度脂蛋白化DL)和高密度脂蛋白化DL)。运些都是本领域中公认的和理解的术 语，在文献中广泛使用，无需进一步定义。
[0046] 低密度脂蛋白化DL)此后设及的是一类有大小不等范围的脂蛋白颗粒，其直径从 约15nm或约18nm到约30nm，或到约25nm(基于激光的方法可用于此测量）。LDL颗粒通常包含 一单一的载脂蛋白B-100分子(Apo B-100)，和非常接近80至100个额外的辅助蛋白。每个 LDL通常具有高度疏水的核屯、，该核屯、由被称为亚油酸的多不饱和脂肪酸和数百至数千(约 1500通常被作为一个平均水平）的醋化和非醋化胆固醇分子组成。运个核屯、也可W携带不 同数量的甘油S醋和其他脂肪，被憐脂和未醋化的胆固醇的外壳W及单拷贝的载脂蛋白B- 100包围。一些特定的LDL颗粒直径为约22nm，质量约300万道尔顿，虽然通常术语LDL是行业 公知的，包括落入上述明确的参数内的颗粒。在典型的人体内，由于LDL颗粒含有可变的和 不断变化数量的脂肪酸分子，所W有一个LDL颗粒的质量和大小的分布。
[0047] 极低密度脂蛋白（VLDL) -般含有Apo 6-100、4口〇(：1、4口〇6、胆固醇，胆固醇醋和甘 油S醋。当它在血液中循环时，VLDL可接收其它组分，运和其他的变化可及时将化化转换到 其他脂蛋白形式。再次，术语化化为行业所公知，通常化化颗粒的直径从约30nm到约80nm。 在体内，VLDL往往运输内源性产物，相反，乳糜微粒往往运输外源性产物。
[004引中间密度脂蛋白（I化)颗粒往往包含除了单一拷贝的Apo B-100外，还包含多个拷 贝的受体配体ApoE，直径一般约25皿至35皿。最后，高密度脂蛋白化化)颗粒具有最高的密 度和最小的尺寸，直径一般是从约7nm或8nm到约11 nm或12nm。
[0049] 该培养基可W包括一种或多种或所有W下脂蛋白：
[0050] 高密度脂蛋白化DL);
[0051] 低密度脂蛋白（LDL);
[0052] 中间密度脂蛋白（1化）；
[0053] 极低密度脂蛋白（VLDL);和 [0化4]乳糜微粒。
[0055] 本发明优选的实施例中，培养基包括LDL或化化。在使用下面的实施例进一步详细 描述时，包含LDL的培养基和包含VLDL的培养基使得细胞更好地生长，并促进具有所需形态 的细胞生长。
[0056] 优选地，培养基包括LDL，其可W包括W下的一个或多个：
[0化7] 大而轻LDLab LDL)颗粒，
[005引小而密LDL(sd LDL)颗粒，和/或
[0059] 脂蛋白（a)(Lp(a))。
[0060] 据认为，脂蛋白是必不可少的，因为它提供胆固醇和憐脂，运些物质不能容易地通 过任何其他方法提供。脂蛋白的适合水平为化g/ml或W上、化g/ml或W上、扣g/ml或W上， 并分别可高达l〇〇μg/ml、80μg/ml或60μg/ml。具体实施例中，浓度为约化g/m巧日约40μg/ml。
[0061] 在下面给出的更详细的实施例中，数目增加的成纤维细胞集落形成单位-(CFU-f) 是在包含VLDL或LDL的培养基中获得的。当化化或LDL存在时，包括该CFU-f的细胞本身的形 态也得到了改善。当培养基中含有HDL时，C即-f包括密集的细胞簇，其中发生了一些分枝 (outgrowth)。当在包含胎牛血清的培养基中分离时，运对观察到的CFU-f是非典型的。相 反，使用包含化化或LDL的培养基获得的CRJ-f具有分散的形态，其更加类似于与MSC相关的 典型CFU-f形态。
[0062] 此外，下面本发明的进一步实施例更详细的描述中，我们评估是否：1)在无血清培 养基中加入纤连蛋白排除了预包被附着因子的需要，和2)或用无血清培养基配方从骨髓中 分离和增殖MSC，是否必需纤连蛋白。本发明的培养基存在或缺乏纤连蛋白时，无论是CRJ-f 数量还是后续增殖率，培养的MSC没有观察到可见差异。运表明，对于(如从骨髓)分离或增 殖MSC，无血清培养基配方无需附着因子。
[0063] 培养基的FGF组分可W包括W下的一种或多种：FGFl，FGF2(bFGF)，FGF3，FGF4， FGF5，FGF6，FGF7，FGF8，FGF9，FGF10，FGF11，GF12，FGF13，FGF14，FGF15，FGF16，FGF17， 尸6尸18，尸6尸19，尸6尸20，尸6尸21，尸6尸22和尸6尸23;优选的是尸6尸1，尸6尸2(6尸6尸），尸6尸3，尸6尸4，尸6尸5， FGF6，FGF7，FGF8，FGF9和FGF10中的一种或多种;更优选的是，培养基包含FGF2 (bFGF)。优选 地，FGF存在的浓度是0.5ng/ml或W上，Ing/ml或W上，高达50ng/ml，高达30ng/ml，高达 20ng/ml，或高达lOng/ml，或运些范围的任意组合。浓度从Ing/ml到20ng/ml是特别合适的。 在具体的实施例中，约5ng/ml的浓度被成功使用。培养基的TG邱组分可W包括TG邱-1，TGF 0-2和TG邱-3中的一种或多种，优选的是TG邱-1。优选的，TG邱存在的浓度是0.5ng/ml或W 上，Ing/ml或W上，高达50ng/ml，高达30ng/ml，高达20ng/ml，高达lOng/ml，或运些范围的 任意组合。浓度从Ing/ml到20ng/ml是特别合适的。在具体实例中，约5ng/ml的浓度被成功 使用。
[0064] 无血清培养基也可W包含或是基于一基础培养基(也是无血清），旨在提供必需的 矿物质、盐和维生素。基础培养基在本行业领域是公知的，一种运样的培养基是最低必需 Eagle-a-修饰培养基（MEM-a)。其它此类基础培养基可从STEMCE化技术公司（STEMC化L Technologies SAI?L,France)和StemCelIs有限公司（StemCelIs , Inc,USA)，W及其他的本 行业技术所熟知的公司获得，适用于本发明的无血清培养基。
[0065] 所述培养基还可W适当地包含其它组分如地塞米松、人血清白蛋白和/或膜岛素- 转铁蛋白-砸（ITS)。一种具体的培养基在MEM-a中包含1 % 口S，1 OnM的地塞米松，50mg/ml的 人血清白蛋白。该培养基可W基于或包含其它基础培养基。此外，培养基可W不包含其他生 长因子或包含进一步的生长因子。
[0066] 除了本文其它地方描述的用途，该培养基还可W用于从供体(特别是人类供体)分 离细胞。所述培养基还可W用于将在含有血清的条件下分离或生长的细胞转换到无血清条 件下。因此，例如，细胞(如人细胞)可w使用任何培养基或条件进行分离，然后按照包括在 本发明培养基存在下培养细胞的步骤，转换为在无血清条件下生长。
[0067] 本发明还提供了一种在本发明培养基中培养干细胞的方法，该方法包括在该培养 基中解育干细胞。使用该方法培养的细胞可W是一种或多种间质干细胞(MSC)。有利的是， 本发明的培养基中生长的MSC保留了成骨、成软骨、成脂肪和/或血管生成的潜力。在本发明 的培养基存在和/或培养在其中的细胞，特别是MSC，可具有有利的免疫抑制性质。
[0068] 因此，本发明还提供了在本发明的培养基中培养的干细胞，优选干细胞是间充质 干细胞，更优选细胞是成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞和/或血管生成细胞。
[0069] 同样，本发明还提供了一群上述定义的成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞和/或血 管生成细胞。
[0070] 本发明还提供一种本发明培养基中的干细胞，例如用作药物。本发明还提供了一 种本发明培养基中的干细胞，用于筛选应用，例如药物筛选。
[0071] 提供本发明培养基中的干细胞用于药物的一个好处是，从干细胞的初始分离到植 入从分离的干细胞培养的干细胞，需要单一的生长培养基。换言之，分离或植入步骤无需分 开的培养基。运大大简化了生产和使用干细胞或干细胞系的过程。此外，采用单一的全目的 无血清培养基代替多种通常是基于血清的培养基，运样减少了运些培养基带来的感染风 险。
[0072] 优选的，本发明的培养基中的干细胞用于形成下列组织中的一种或多种：
[0073] (a)骨组织；
[0074] (b)血管组织；
[00巧](C)软骨组织;和/或
[0076] (d)脂肪组织。
[0077] 有利的是，无血清培养的MSC在体内向骨组织的分化优于对照实验中培养在含血 清培养基中的MSC。
[0078] 本发明现在参考W下具体实施例和随附的附图进行说明，其中：
[0079] 图1显示了在10%FBS中分离的MSC在有bFGF存在的无血清条件下重附着，在涂布 (plating)lS小时后的相对附着程度。组织培养瓶预包被有纤连蛋白（FN;黑色）、透明质酸 化A;蓝色）、玻连蛋白（VN;红色）或层粘连蛋白（LN;绿色），使细胞在无血清条件下附着。对 照包括无细胞外基质化CM)附着因子存在下的无血清涂布和10%FBS(灰色）。结果代表3个 生物学重复，n = 2;
[0080] 图2显示了在10%FBS中分离并在有bFGF存在的无血清条件下重附着的MSC相对于 无血清条件下的生长。组织培养瓶中预包被有FN(黑色）、HA(蓝色）、VN(红色）或LN(绿），使 细胞在无血清条件下附着。5天后获取细胞数。对照包括无 ECM附着因子存在下的无血清涂 布和10%FBS(灰色）。结果代表了 3个生物学重复，n = 2;
[0081] 图3显示了在10%FBS中分离的MSC，在含FGF2的无血清条件下重附着，在3代(P)过 程中的附着程度。将MSC附着在有EGF(红色）的存在下的组织培养瓶上，或预包被有FN(紫 色）的组织培养塑料制品上，或有EGF存在下的纤连蛋白包被的塑料上(绿色）并每3天进行 传代。对照包括不存在ECM附着因子的无血清涂布(蓝色)和10%FBS(黑色）。结果代表3个生 物学重复，n = 2;
[0082] 图4显示了在10%FBS中分离的MSC，在无血清条件下，重附着在预包被有的组织 培养瓶2天的生长。然后将细胞在有生长因子的存在下进行培养，每5天进行传代。对照包括 无生长因子的无血清涂布和10%FBS。结果代表3个生物学重复，n = 2;
[0083] 图5显示了在10%FBS中分离的MSC，在无血清条件下，重附着在预包被FN的组织培 养瓶中2天的生长。细胞随后在存在有PGE2、胆固醇或脂蛋白的包含FGF2巧ng/ml)的无血清 培养基中培养5天。对照包括无生长因子存在下的无血清涂布和10%FBS(A)。然后将细胞在 脂蛋白的存在下培养，每5天进行传代，传代3次，对照包括无脂蛋白存在下的无血清涂布 (B)。结果代表3个生物学重复，n = 2;
[0084] 图6显示了实施例的结果，其中，在含FGF2的无血清(SF)培养基中，MSC从骨髓分离 到预包被有纤连蛋白（FN)、玻连蛋白（VN)或透明质酸化A)的塑料制品上，，W确定无血清 MSC分离的合适的细胞外基质。集落形成单位(CFU;图6A)的数量W及细胞数量（图6B)是在 原代培养结束时确定的。接种另一骨髓在预先包被有不同浓度纤连蛋白的组织培养塑料制 品上，W确定所需纤连蛋白的最佳浓度。C即的数量（图6C)和细胞产量（图6D)是在原代培养 结束时确定的。对照包括10%FBS的存在下或没有包被的组织培养塑料制品上的MSC分离；
[0085] 图7显示了实施例的结果，其中，MSC从骨髓分离到预包被有纤连蛋白的组织培养 塑料制品上和/或有EGF存在下的组织培养塑料制品上。集落形成单位的数量（图7A)和细胞 的数量（图7B)在原代培养结束时确定。对照包括在10 %FBS存在下或在没有包被的组织培 养塑料制品上的MSC分离；
[0086] 图8显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，MSC被分离在预包被有纤连蛋 白（6ug/ml)的组织培养塑料制品上，所述无血清培养基包含的生长因子如表1给出。每一代 结束时细胞用膜蛋白酶消化，并接种于包被有纤连蛋白的塑料制品上；对照细胞接种于 10 % FBS中的组织培养塑料制品上；
[0087] 图9显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，MSC被分离到预包被有纤连蛋 白（6ug/ml)的组织培养塑料制品上，所述无血清培养基包含的生长因子如表3给出。每一代 结束时细胞用膜蛋白酶消化，并接种于包被有纤连蛋白的塑料制品上；对照细胞接种于 10 % FBS中的组织培养塑料制品上；
[008引图10显示了实施例的结果，其中，在无血清培养基中，分离的MSC在第3、6、9代结束 时的表面特性，所述无血清培养基使用表3给出的条件7和8。在10%FBS中培养的MSC被用作 对照；
[0089] 图11显示了实施例的结果，其中，在第3代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC 的分化特征。对照为在10%FBS培养基中培养的MSCdMSC经历形成脂肪细胞的能力由油红0 阳性液泡(a)来确定，茜素红染色W及阳性巧试验确定MSC经历成骨作用的能力化），成软骨 作用的能力是由甲苯胺蓝染色和GAG蛋白定量确定(C);结果代表4个生物学重复；
[0090] 图12显示了，在第7代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC的分化特征。对照为 在10%FBS培养基中培养的MSCdMSC经历形成脂肪细胞的能力由油红0阳性液泡来确定(曰）， 茜素红染色W及阳性巧试验确定MSC经历成骨作用的能力（b)，成软骨作用由GAG蛋白的定 量确定(C);结果代表3个生物学重复；
[0091] 图13显示了，在第3代开始时，在无血清培养基中，分离的MSC的血管生成分化特 征。对照为在10 % FBS培养基中培养的MSC;将MSC与人厮静脉内皮细胞化UVEC)共培养，并量 化所形成的小管的数量；结果表示为一百分比，其中单独的HUVEC形成的小管数设置为 100 %。结果代表4个生物学重复，n = 4;
[0092] 图14显示了在无血清培养基中，培养的MSC向骨组织的体内分化；
[0093] 图15显示了在无血清培养基中，培养的MSC向骨组织的体内分化；
[0094] 图16显示了在缺氧和常氧条件下，使用无血清培养基和含血清培养基，培养的MSC 的生长动力学和细胞形态学。图16A显示了MSC的生长动力学；图16B显示了所培养的MSC的 细胞形态;图16C显示了来自4个不同的骨髓样本的细胞预测产量；
[00M]图17显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清培养基，培养的 MSC的成骨分化。培养11天。平均值± SD，n = 4供体。比例尺:500um。**: P《0.05;
[0096] 图18显示了，在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养 的MSC的成脂分化。平均值± SD，n = 4供体，比例尺:500um，*: P《0.5;
[0097] 图19显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养 的MSC的成软骨分化。培养18天。平均值± SD，比例尺:500皿，n = 3供体；
[0098] 图20显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清培养基，培养的 MSC的促血管生成的能力。平均值+ SD，比例尺:200皿，n = 4供体；
[0099] 图21显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养 的MSC的免疫原性程度。平均值± SD。n = 3MSC供体VS1MLR供体。统计:t检验;*冲<0.05; W及
[0100] 图22显示了在缺氧和常氧的条件下，无血清培养基相对于含血清的培养基，培养 的MSC的表面细胞标志物表型。平均值± SD，n = 3供体(P3)。
【具体实施方式】
[0101] 实施例1
[0102] 图1显示了一个初步实验的结果，其中，4种附着因子支持在10%血清存在下分离 的MSC在无血清环境中附着的能力在18h后检查；所述因子为：透明质酸（HA)、纤连蛋白 (FN)、玻连蛋白（VN)、层粘连蛋白化N)和表皮生长因子化GF)。在碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF2，FGF2)存在下附着的MSC的增殖在6天后也进行评估。结果表明，在无血清环境下1她 后，玻连蛋白（〇.5μg/ml)支持MSC附着最佳（图1);然而，6天后，纤连蛋白（6μg/ml)显示出类 似玻连蛋白（0.5iig/ml)的MSC产量（图2) dEGF(1 Ong/ml)也在传代过程后增加 MSC的附着（图 3)。
[0103] 无血清培养基配方是基于描述培养牙髓干细胞的低血清细胞培养的文献(Tarle et al. ,2010)选定的。基本培养基由W下组成：ITS(1%，BD)、抗坏血酸（10mM，Sigma A1化ich)、地塞米松（10nM，Sigma A1化ich)、人血清白蛋白（50mg/ml，Sigma A1化ich)、青 霉素/链霉素溶液（l%，Gibco)和MEM-a(G化CO)。接着检验一系列的生长因子对MSC增殖的 影响。在无血清基础培养基中，MSC被附着在包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上4她。
[0104] 抗坏血酸是维生素 C源。MEM-a是最低必需培养基配方和缓冲液；其也提供，特别 是，氨基酸，并且是一养分。地塞米松是类固醇和雌激素样因子，服A是蛋白源，W及口S提供 膜岛素、转铁蛋白（铁源)和砸酸。
[01化]基础培养基组成如下：
[0106]
[0107] 传代3次后，在第5、10和15天检测。6。2/。6。巧邮6。7(1、5和1〇11旨/1111)、？06。曰曰/ PDGFab和PDG即b(1、5和lOng/ml)对MSC的增殖的影响。图4显示了FGF2(5ng/ml)、FGF4(5ng/ ml)和PDG化b (1 Ong/ml)在无血清培养基中如何提高MSC的增殖。
[0108] 为了进一步提高MSC的活力和增殖，在无血清基础培养基中加入脂蛋白。在血清存 在下分离的MSC，在含FGF2的无血清培养基中，接种于涂有纤连蛋白的组织培养塑料制品 上。起初，筛选一系列因子W支持膜蛋白酶消化后的MSC活力;检测前列腺素 E2 (PGE2; 50ug/ ml)、胆固醇（30ug/ml)和脂蛋白（4ug/ml)对MSC在含FGF2 (5ng/ml)的无血清培养基中的增 殖的影响。低密度脂蛋白（40ug/ml ;Sigma-Al化ich)显示出提高MSC增殖的作用，而PGE2和 胆固醇具有抑制作用（图5a)。在传代3次后，脂蛋白提高在含有FGF2的无血清培养基中的 MSC增殖(图化），并因此被加入到无血清培养基配方中。
[0109] 起初，从巧中骨髓分离MSC来确定合适的附着基质。玻连蛋白、透明质酸和纤连蛋白 被筛选;在第1代结束时，纤连蛋白产生较多的集落形成单位（图6A)和最多的细胞数量（图 6B)。接着，进一步的骨髓供体被筛选，W确定最佳纤连蛋白浓度;6ug/ml被选定为最适浓度 (图6C和抓）。
[0110] 为检测EGF在MSC分离和附着中的作用，5个骨髓被测试。在有FGF2(5ng/ml)存在 下，MSC被分离在有EGF存在的包被有纤连蛋白的塑料制品上，或在有EGF存在的组织塑料制 品上。结果表明，在骨髓供体之间存在变化，然而，得出的结论是，在此特定情况下，MSC的附 着需要纤连蛋白（图7A和7B)。
[0111] 为评估生长因子对MSC的增殖的影响，将4个骨髓样本接种于如表1所示的无血清 基础培养基中包被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上。
[0112] 表1.添加到无血清基础培养基中的生长因子
[0113]

[0114] 第1次传代后，MSC产量在不同条件问显示无差异;但是，第3代W后，条件1-6下累 积群体倍增数广泛地下降。在所有条件中，条件7、8和9显示出平稳地增长（图8,骨髓1、2和 3)。运些培养下的细胞产量见表2(注意，因此，表2中的培养基1和2分别对应表1中的培养基 巧口8)。
[0115] 表2.图8实验中预测的每ml细胞产量
[0116]
[0117] 此外，无血清培养基显示出在促进来自5个供体的MSC的分离和增殖方面优于FBS， 生长维持到第10代。此外，与生长在FBS中的培养物比较，在无血清培养基中MSC产量在3代 末时是其十倍，在6代末时是其100倍之多。
[0118] 为进一步评价MSC增殖，接种一额外的骨髓于如表3所示的无血清基础培养基中包 被有纤连蛋白的组织培养塑料制品上。
[0119] 表3.添加到无血清基础培养基的生长因子

[0121] 第1代后，MSC的产量在各条件之间没有明显的差异;但是，第2代后，条件5和6的累 积群体倍增数下降。条件7、8、9、10和11在群体倍增数上稳步增加;然后，相对于条件7和8来 说，PDG化b的添加(条件10和11)并没有增加 MSC的产量(图9)。
[0122] MSC表面表型的表征是通过使用一面板的抗体去检测阳性和阴性标记来进行，运 种分析是在第3、6和9代的末期进行。图10说明，与在10%FBS中培养的MSC相对比，无血清培 养基(条件7和8)中培养的MSC，在标准面板的表面标记物表达上没有区别。此外，MSC的标记 物CD90、CD73或CD105在第3、6和9代时仍然为阳性。然而，与血清培养的细胞相比，无血清条 件7和8下培养的MSC具有较高的CD146表达，而且运在传代中得到保留。
[01 Z3]为了进一步研究MSC表型，在第3代开始时，接种MSC于成脂肪、成骨和成软骨试验 中。图11显示了不同MSC培养物形成脂肪细胞（图11a)、骨细胞（图1化）、软骨细胞（图11c)的 能力没有差异。
[0124] 为研究MSC表型的稳定性，在第7代开始时，再次接种MSC于成脂肪、成骨和成软骨 试验中。图12显示MSC在后续传代后保留了其分化的能力，而且不同培养物形成脂肪细胞 (图12a)、骨细胞(图12b)或软骨细胞(图12c)的能力没有差别。
[0125] 为研究不同的MSC培养物的血管生成潜力，在第3代开始时，将MSC与人厮静脉血管 内皮细胞化UVEC)在基质胶上共培养。4小时后，对形成的小管的数量进行定量。为进一步评 估MSC培养物分泌血管生成因子的情况，将来自2日龄的MSC培养物的MSC培养基加入到类似 的基质胶上的HUVEC。
[0126] 图13表明，与在10%FBS中培养的MSC相比，在含bFGF和TG邱-1的无血清培养基中 培养的MSC(无论有或没有EGF)形成较多的小管。此外，来自运些培养物的培养基也支持小 管形成，因此说明运些无血清培养物有血管生成因子的释放。
[0127] 图14和图15显示，在无血清培养基中培养的MSC在体内向骨组织分化。所产生的骨 组织要优于对照实验中含血清培养基中的MSC产生的骨组织。
[0128] 为了研究缺氧条件下MSC的培养是否增加细胞产量和/或维持骨髓来源的无血清 MSC的特征，对无血清培养基的完整鉴定包括W下研究:生长动力学、细胞形态学、=系分化 潜能、表面表型、促血管生成潜力和免疫学性质。运些实验的结果如图16所示，结果表明，与 对照含血清培养基培养的细胞相比，缺氧培养的无血清培养基的细胞具有更优的生长动力 学，同时也产生了更大的细胞产量。
[0129] 实施例2 [0。0] 目的和方法
[0131]实施W下的操作W评估包含各种脂蛋白的本发明培养基对骨髓来源的MSC的增 殖、分化、细胞形态学W及表面标记物表型的影响；W及评估对附着因子即纤连蛋白用于无 血清培养基的需求。
[0。。培养基的制备
[0133]对脂蛋白的研究，制备的无血清(SF)培养基包括:无脂蛋白（No lipo)、极低密度 脂蛋白（VLDL)、低密度脂蛋白化DL)和高密度脂蛋白化DL)。其他存在的脂蛋白是乳糜微粒 和中间密度脂蛋白，它们不在本研究评估之列，因为它们目前无法在市面上获得。
[0。4] MSC 培养
[0135] 基于在SF培养基中的塑料附着，分离MSC:按照40xl06人骨髓单核细胞/T-175进行 涂布，并于37°(：，5%〇)2,21%化的条件下培养。当细胞一旦达到80-90%汇合时进行传代培 养。在第3代(P3)末期时，评估MSC的生长动力学、=系分化和表面标记物表型。为了研究脂 蛋白，SF培养基被改良为包含80ng/mL的各种脂蛋白中的一种，并将运些细胞接种于T175培 养瓶中，所述培养瓶中已预包被有纤连蛋白。对于描述的纤连蛋白的研究，使用包含LDL的 标准SF培养基(标准配方），将细胞接种于T175培养瓶中，所述培养瓶没有纤连蛋白、预包被 有纤连蛋白或者纤连蛋白添加到培养基本身。
[0136] 为了传代SF细胞，对培养基充气，加入5ml的化ypLE于每一个T175培养瓶中。培养 瓶在室溫下解育lOmin，在显微镜下观察细胞分离。一旦细胞分离，加入5ml的培养基，将细 胞悬液转移至50mL离屯、管中，400xg离屯、5min。细胞生长到第3代(P3)时，将其用于S系分化 研究或用于评估和流式细胞分析。
[0137] 细胞样本的流式细胞分析如下所述。封闭液是在50mL管中，将ImL的小鼠血清加入 至lj49mL的D-PBS中制备得到。FACS缓冲液是2 %服A溶液，用D-PBS制备得到的。
[0。引 MSC染色
[0139] 吸取IxlO5细胞（10(hiU到置于冰上的96孔板的8个孔的每个孔中，W及每种抗体 一个孔，不染色细胞一个孔。接着将板在4°C、400g条件下离屯、4min。小屯、吸取悬浮液W免影 响细胞团，每孔中加入50ul的封闭液，然后吹打溶液让细胞团重悬。将样本在封闭液中解育 化。封闭后，和前面一样将板离屯、，重悬于50化的包含合适抗体的FACS缓冲液中。样品与抗 体在4 °C的黑暗中解育45min。与抗体解育后，样品用FACS缓冲液洗涂S次，最后重悬于20化 L的FACS缓冲液中，并转移到FACS管中。SYT0X红色死活细胞染料按照1:10000的最终稀释比 例也添加到样品中，10分钟后利用抓FACS化nto II评估标志物的表达。
[0140]
[0141] 进行C即-f检测，将骨髓单核细胞(MNC)按照lxl06MNC/10cm 2的密度一式S份接种 于6孔板中。在第10天时，细胞用预冷的95%甲醇固定和2%结晶紫染色lOmin。然后，用PBS 洗涂样品并成像。皿li且包含密集的CFU-f，而VLDL和LDL组包含分散的集落。
[0142] 从骨髓中分离出MSC，并直接置于SF培养基中预包被有纤连蛋白的组织培养塑料 审IJ品上，所述SF培养基含或不含各种上述列出来的脂蛋白。观察到在含化化和U)L的组中 CFU-f数量增加(是皿L的约3-5倍）。
[0143] 对MSC的标志物CD105、CD73和CD90进行评估，并标准化至相同浓度下使用的他们 的同型对照。观察到运些标志物的相当表达。此外，对CD146、CD271和W8B2进行评估。运些标 志物都是之前被证明是保留在SF培养的MSC中，并在血清存在下丢失或大幅度减少。运些标 志物的表达在供体之间变化很大，但MSC在暴露于不同的脂蛋白或在缺乏他们的情况下，没 有观察到变化。
[0144] 从骨髓中分离出MSC，直接涂布在组织培养塑料制品上，所述组织培养塑料制品没 有预包被纤连蛋白、烧瓶预包被有纤连蛋白，或纤连蛋白添加到的培养基配方自身当中。系 统中有或没有纤连蛋白的存在，无论其是包含在培养基中或作为一个单独的预包被步骤， CRJ-f的形成能力没有观察到区别。
[0145] ^
[0146] 进行上述工作是为比较无血清中不同的特定脂蛋白，和评估纤连蛋白作为附着因 子的需求。
[0147] 在含HDL的SF培养基存在下的CFU-f形成密集细胞簇的CFU-f，细胞分枝 (outgrowth)稀疏。相反，在包含化化的SF培养基或包含LDL的SF培养基中，分离的MSC形成 的CFU-f具有分散的集落，其中细胞主要作为单个细胞被看见。VLDL和LDL参与在动脉中将 脂肪运送到细胞，运可W表明为什么运些组的细胞形成更加分散、看起来更加健康的CRJ- f。然而，在P3时，细胞全部有彼此相似的细胞形态，运可能表明，对于脂蛋白的一个需求可 能仅仅是发生在MSC的初始分离中（在此情况下，从骨髓分离）。包含有化化或LDL的组中 CFU-f数量增加。在每代结束时应用运些CRJ-f数量和细胞产量来计算生长曲线。在脂蛋白 组间没有观察到供体内差异，生长动力学方面，多个MSC供体的供体间差异一致。
[0148] 为了进一步研究脂蛋白对MSC的影响，进行=系分化试验。成软骨作用通过测量硫 酸化糖胺聚糖水平对DNA含量标准化的水平进行评估。基于运些结果，所有组之间没有观察 到统计学差异。同样的，评估细胞的成骨潜力。细胞在标准的成骨培养基中培养10天，成骨 作用通过测量巧水平作为形成的矿化基质的指标进行评估。在运些组内没有观察到统计学 差异。成脂肪作用是通过测量脂肪形成进行评估，当用油红0染色时，脂肪形成会染成红色。 与成骨作用和成软骨作用的情况一样，用各种脂蛋白培养的MSC的成脂肪潜力没有统计学 差异。除了他们的=系潜力，MSC的特点是它们共表达CD90、CD105和CD73。在运之外，我们观 察到，SF培养的MSC维持CD27UCD146和W8B2的表达，运些标记物是体内MSC的指示，其通常 在体外培养早期或过程中丢失或显著减少。所有脂蛋白处理的细胞保持表达95% W上的 MSC标志物CD105、CD73和CD90。所有组中也保持了 CD27UCD146和W8B2的表达，但在高度可 变的水平。然而，值得注意的是，由于各种脂蛋白的存在，运些标记物没有供体内差异。
[0149] 基于上述结果，脂蛋白似乎对MSC的表面标志物表达、生长动力学或=系分化潜力 没有影响。然而，脂蛋白的存在似乎对从骨髓中初始分离MSC是重要的。在含有皿L的SF培养 基中建立的集落紧凑，看起来拥挤，而不能维持正常的CFU-f形态。此外，当在化化或LDL中 分离时，获得的CFU-f的产量增加。基于上述数据，VLDL和LDL似乎比皿L更适合在无血清培 养基中使用。
[0150] 运项工作的最终目的是确定，在专口的无血清培养基中的MSC培养物的分离和建 立中，纤连蛋白是否是必需的。添加纤连蛋白到无血清培养基也用来与培养表面预包被附 着因子的标准做法做对比。运是通过看细胞的CRJ-f数量和细胞生长动力学进行评估的，所 述细胞从骨髓分离，直接置于没有纤连蛋白的组织培养塑料制品上、置于预包被有纤连蛋 白的组织培养塑料制品上，和最后置于本身加入纤连蛋白的培养基中。从骨髓分离的标准 化至MNC计数的CFU-f数量没有观察到差异。同样，在有或无纤连蛋白存在下，MSC培养物的 生长动力学都没有受到影响，说明本发明无血清培养基中附着因子对于MSC的分离或增殖 不是必须的。
[0151] 因此，本发明提供了一种用于干细胞生长的培养基，所述培养基不使用血清作为 培养基的组分;本发明还提供了利用该培养基的方法和使用该培养基产生的细胞。
【主权项】
1. 一种培养间充质干细胞的无血清培养基，其包括： (a) 成纤维细胞生长因子(FGF); (b) 转化生长因子β (TGF-β);和 (c) 脂蛋白。2. 根据权利要求1所述的培养基，其中该培养基中的脂蛋白浓度为lμg/ml~lOOμg/ml。3. 根据权利要求1-2任一项所述的培养基，其中该培养基的脂蛋白组分包括下述一种 或多种： (a) 高密度脂蛋白（HDL); (b) 低密度脂蛋白（LDL); (c) 中间密度脂蛋白（IDL);及 (d) 极低密度脂蛋白（VLDL)。4. 根据权利要求3所述的培养基，其包括LDL。5. 根据权利要求4所述的培养基，其中LDL包括下述一种或多种或全部： (a) 大而轻LDL(lb LDL)颗粒； (b) 小而密LDL(sd LDL)颗粒;和 (c) 脂蛋白（a)(Lp(a))。6. 根据权利要求4或5所述的培养基，其包括直径为15nm~30nm的LDL颗粒。7. 根据权利要求3所述的培养基，其包括VLDL。8. 根据权利要求7所述的培养基，其包括直径为30nm-80nm的VLDL颗粒。9. 根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基的FGF组分为FGF2(bFGF)， 可选地浓度为lng/ml至10ng/ml。10. 根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基的TGFM&分为TGFiM，可 选地浓度为lng/ml至20ng/ml。11. 根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基还包括或基于一基础培 养基。12. 根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基还包括地塞米松、人血清 白蛋白和/或胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS)。13. 根据前面的权利要求任一项所述的培养基，其中该培养基不包含其他的生长因子。14. 一种培养间充质干细胞例如人间充质干细胞的方法，包括在权利要求1-13任一项 所述的培养基中孵育干细胞。15. -种组合物，其在(b)权利要求1-13任一项所述的培养基中，包含(a)人类干细胞。16. 根据权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞为间充质干细胞、成骨细胞、成软 骨细胞、成脂肪细胞或血管生成细胞。17. 权利要求1-13任一项所述的培养基中的干细胞，其用在医学上。18. 权利要求1-13任一项所述的培养基中的干细胞，其用在骨组织、血管组织、软骨组 织或脂肪组织的形成中。
【文档编号】C12N5/00GK106062179SQ201580008299
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月16日
【发明人】F·P·巴里, E·J·穆尼, J·M·墨菲, G·M·肖, S·P·盖纳德
【申请人】爱尔兰国立高威大学