一种细胞培养基质及其应用与使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种细胞培养基质及其应用与使用方法。
【背景技术】
[0002] 健全的角膜上皮细胞是角膜抵御外界各种有害因素损伤的重要条件，结构与功能 健全的角膜缘干细胞是角膜上皮细胞再生的主要来源。多种致病因素，如：眼外伤、手术创 伤、炎症、药物毒性均可造成角膜缘损伤，造成角膜缘干细胞功能障碍，导致上皮细胞缺失， 从而导致增加角膜感染、穿孔、新生血管化的危险。因此，通过体外培养获得大量用于角膜 修复的上皮细胞这一难题亟待解决。临床研究表明，通过体外培养自体角膜缘干细胞作为 角膜上皮修复的种子细胞取得了良好疗效。但是，自体角膜缘干细胞体外连续培养所要求 的培养液成分复杂，细胞不稳定易分化，细胞不能持续扩增，细胞表型发生改变，所以每次 移植都要在患者或其家属的正常角膜上取下部分角膜缘组织进行体外培养，操作繁琐，且 给患者带来二次痛苦，并且有研究者发现当取供眼角膜缘组织大于三分之二时，将造成健 眼的眼表疾病和视力不可逆的下降，使得大多数患者难以接受。因此，非常有必要寻找新的 自体和异体移植的细胞来源。
[0003] 脐带间充质干细胞（hUC-MSCs)具有的低污染、来源充足、增殖旺盛等优点，并且， 脐带间充质干细胞不受任何伦理及法理限制，因而吸引了众多的研究者。但是，体外诱导 hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化十分困难。
[0004] 细胞固定化技术可较好地保护细胞，提高细胞对机械和化学环境所造成压力的耐 受性，实现细胞高密度培养，提高目的产物产率。用膜作为固定化的载体具有系统稳定、 操作简便、经济廉价等优点。对动物细胞培养来说，膜载体的生物毒性、生物相容性对细胞 本身的作用是不容忽视的问题，因为这直接影响到细胞的生长、增殖、代谢及最终蛋白的分 泌；从操作工艺角度考虑，载体材料的耐热性也是不得不考虑的问题；另外，载体的价格及 使用成本，对载体的最终使用具有决定性意义。
[0005] 因此，利用有机膜材料，建立体外诱导hUC-MSCs向角膜上皮细胞分化的有效方法 十分必要。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养基质及其应用与使用 方法。本发明提供的细胞培养基质能够用于脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化，且能 够具有较高的分化率。
[0007] 本发明提供的细胞培养基质，包括胶原蛋白膜和培养液；
[0008] 其中，培养液包括基础培养基、表皮生长因子和胰岛素。
[0009] 本发明将胶原蛋白作为膜载体，具有良好的生物相容性，其能够使细胞在相对稳 定的环境中生长和分化。实验表明，采用胶原蛋白膜为载体诱导hUC-MSCs向角膜细胞分化 的效率可达32%，而未采用胶原蛋白膜为载体进行诱导的对比例分化效率仅为9. 54%。说 明采用胶原蛋白膜能够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。
[0010] 并且，本发明提供的培养液中添加了表皮生长因子和胰岛素。其中，表皮生长因子 (EGF)能够促进表皮细胞的分裂，胰岛素能够促进细胞对葡萄糖、氨基酸的代谢，提高细胞 的生长状态。本发明在基础培养液中添加表皮生长因子和胰岛素，从而提高hUC-MSCs向角 膜上皮细胞分化的百分率。实验表明，添加表皮生长因子和胰岛素的实验组hUC-MSCs向角 膜上皮细胞的分化率可达32%。说明通过添加EGF和胰岛素能够显著提高hUC-MSCs向角 膜细胞分化的效率。
[0011] 在本发明的实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的浓度为3g/L~12g/L。
[0012] 在一些实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的浓度为9g/L。
[0013] 在本发明的实施例中，胶原蛋白膜中胶原蛋白的含量为98. 47%，所述胶原蛋白的 分子量为 330. 3kDa、263. 64kDa、118. 47kDa、109. 64kDa。
[0014] 其中分子量为330. 3kDa的胶原蛋白的质量分数为4. 84%;分子量为263. 64kDa的 胶原蛋白的质量分数为48. 37% ;分子量为118. 47kDa的胶原蛋白的质量分数为35. 21% ; 分子量为109. 64kDa的胶原蛋白的质量分数为10. 05% ;
[0015] 本发明采用的胶原蛋白膜可为自制也可经商业途径购得，本发明对此不作限定， 其实施皆在本发明的保护范围之内。
[0016] 本发明采用的胶原蛋白为I型胶原。
[0017] 在本发明的实施例中，胶原蛋白为鱼胶原蛋白。
[0018] 鱼来源胶原蛋白取材方便，材料廉价。并且，鱼类不存在牛、羊、猪等哺乳动物具有 的疯牛病、口蹄疫等人畜共患疾病的风险，安全性高。
[0019] 本发明采用的胶原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨酸的质量分数为33. 4%， 羟脯氨酸的质量分数为10. 03%，羟脯氨酸与脯氨酸之比为0. 77,羟脯氨酸含量高于羟赖 氨酸含量。
[0020] 本发明实施例中，胶原蛋白的制备方法包括：
[0021] 步骤1 :鱼皮经碱处理、盐洗、无水乙醇浸泡、酸处理后滤除残渣，获得滤液；
[0022] 步骤2 :将滤液离心弃沉淀后以胃蛋白酶酶解，经盐析、透析、冻干制得胶原蛋白； 透析截留分子量为l〇〇kDa。
[0023] 本发明实施例中，胶原蛋白膜的制备方法包括：以醋酸为溶剂，将胶原蛋白与戊二 醛交联后烘干，经碱处理后以水冲洗，获得胶原蛋白膜。
[0024] 胶原蛋白膜在进行细胞培养或诱导分化前需以乙醇浸泡后再以培养基浸泡。
[0025] 在本发明的实施例中，表皮生长因子与胰岛素的质量比为（5~25):(5000~ 25000)〇
[0026] 作为优选，表皮生长因子与胰岛素的质量比为2:3000~3:2000。
[0027] 优选的，表皮生长因子与胰岛素的质量比为1:1000。
[0028] 在本发明的实施例中，表皮生长因子的含量为5ng/mL~25yg/mL;胰岛素的含量 为 5ng/mL~25yg/mL〇
[0029] 作为优选，表皮生长因子的含量为5ng/mL;胰岛素的含量为5yg/mL。
[0030] 作为优选，表皮生长因子的含量为lOng/mL;胰岛素的含量为10yg/mL。
[0031] 作为优选，表皮生长因子的含量为lOng/mL;胰岛素的含量为15yg/mL。
[0032] 作为优选，表皮生长因子的含量为15ng/mL;胰岛素的含量为10yg/mL。
[0033] 作为优选，表皮生长因子的含量为25ng/mL;胰岛素的含量为25yg/mL。
[0034] 在本发明的实施例中，基础培养液为人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培 养基，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为（50~60) : (44~50)。
[0035] 作为优选，人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基的体积比为55:45。
[0036] 本发明所用的人干细胞无血清培养基和角朊细胞无血清培养基可为自制也可为 购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。其中，人干细胞无血 清培养基适宜培养干细胞，本发明采用的人干细胞无血清培养基为LonzaUltra⑶LTURE?。 角朊细胞无血清培养基适宜培养上皮细胞，本发明采用的角朊细胞无血清培养基为KSFM 培养液。本发明采用的基础培养液皆不含有异源血清，降低了动物源血清给人体带来的风 险。
[0037] 在本发明的实施例中，本发明提供的培养基中还包括青霉素和链霉素。
[0038] 在一些实施例中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为100U/mL。
[0039] 本发明提供的培养基质在诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化中的应用。
[0040] 本发明还提供了诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法，包括：以胶 原蛋白膜为载体接种脐带间充质干细胞，经孵育后以培养液诱导；培养液包括基础培养基、 表皮生长因子和胰岛素。
[0041] 在一些实施例中，接种的hUC-MSCs细胞为第3~第5代细胞。
[0042] 在一些实施例中，接种的密度为3XIO5个/ml。
[0043] 在一些实施例中，孵育的时间为2h，条件为5%C02、37°C、湿度95%。
[0044] 在一些实施例中，培养液诱导的条件为5%C02、37°C、湿度95%，每2~3天全量 更换培养液，共诱导7天。
[0045] 在一些实施例中，脐带间充质干细胞的原代分离方法为组织块培养法；
[0046] 具体的，hUC-MSCs的原代分离方法包括以下步骤：
[0047] 步骤1 :将脐带用含有lOOU/mL青霉素和lOOU/m