L链霉素的PBS缓冲液漂洗2次， 以体积分数为75%的乙醇水溶液浸泡Imin~2min后，去除脐带外膜和血管；
[0048] 步骤2 :以人干细胞无血清培养液培养，培养条件为5%C02、37°C、湿度95% ;第 5~7天半量换培养基，继续培养12~14天后全量换液去掉组织块，收集细胞传代培养。
[0049] 本发明提供的细胞培养基质，包括胶原蛋白膜和培养液。本发明利用胶原蛋白 膜作为载体，配合有效的培养液，促进了hUC-MSCs向角膜上皮细胞的分化。实验表明，将 hUC-MSCs接种于胶原蛋白膜后以本发明所述的培养液诱导7天后hUC-MSCs分化率可达 32%。而不采用胶原蛋白膜为载体的诱导的分化率仅为15. 75%。说明采用胶原蛋白膜能 够显著提高hUC-MSCs向角膜细胞分化的效率。
【附图说明】
[0050] 图1示光镜下的hUC-MSCs的细胞形态（100X);
[0051] 图2示光镜下诱导7天后的细胞形态（100X)。
【具体实施方式】
[0052] 本发明提供了一种细胞培养基质及其应用与使用方法，本领域技术人员可以借鉴 本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技 术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较 佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文的方法 和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0053] 本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0054] 其中，胶原蛋白的制备方法为：
[0055] (1)、罗非鱼清洗去鳞取皮，去除附着鱼肉和鳍，获得罗非鱼皮，切成2cmX2cm小 块。放入〇?lmol/L的NaOH溶液中，料液比1:10 (w/v)连续搅拌（80rpm)，水温控制在4°C 以下，每隔4h更换一次碱液，重复4次，再用去离子水反复清洗至pH6. 5~7。
[0056](2)、将碱处理后的鱼皮放入4 %浓度的NaCl溶液中，料液比1:10 (w/v)，连续搅拌 (SOrpm)，水温控制在4°C以下，每隔4h更换一次盐液，重复4次，再用去离子水反复清洗， 将NaCl清洗干净。将盐洗后的鱼皮放入无水乙醇浸泡，料液比1:5,4h后，更换无水乙醇， 再用去离子水将乙醇反复清洗干净。
[0057](3)、将鱼皮捣碎放入0?5mol/L的乙酸溶液中，料液比l:20(w/v)，搅拌（60rpm)6h 后，用40目纱网过滤，去除残渣。取滤液用冷冻高速离心机离心，4°C，8000g，20min。取上清 液获得酸溶性分离胶原ASC(acid-solublecollagen)。将ASC胶液加入NaOH，将胶液调 pH至5. 5,再加入0. 3%的胃蛋白酶，在4°C条件下连续搅拌48h，再用NaOH调至pH值6. 5， 即获得胃蛋白酶水解胶原PSC(pepsine-solublecollagen)，在PSC溶液里加入NaCl至 终端浓度为4%，静置4h，然后低温4°C条件下离心10000g，30min，取沉淀的胶原。
[0058](4)、将盐析胶原加入纯水，料液比1:4,搅拌（SOrpm)，将胶原重新溶解，装入透析 袋中透析，透析袋截留分子量为100KD，透析外液为磷酸盐缓冲液（85% /15MNa2HPO4,15% 1/15MKH2P04,pH7. 5)，在4°C条件下透析3天，每12h换透析外液一次，将经透析纯化的胶 液用一 60°C冷冻干燥机冻干。制得纯胶原冻干粉。
[0059] 经高效液相色谱仪检测，本发明采用的胶原蛋白中不含有色氨酸和胱氨酸，甘氨 酸的质量分数为33. 4%，羟脯氨酸的质量分数为10. 03%，羟脯氨酸与脯氨酸之比为0. 77， 羟脯氨酸含量高于羟赖氨酸含量。
[0060] 经SDS-PAGE电泳测定，胶原蛋白膜中胶原蛋白的含量为98. 47%，所述胶原蛋白 的分子量为330. 3kDa、263. 64kDa、118. 47kDa、109. 64kDa。其中分子量为330. 3kDa的胶原 蛋白的质量分数为4. 84%;分子量为263. 64kDa的胶原蛋白的质量分数为48. 37%;分子量 为118. 47kDa的胶原蛋白的质量分数为35. 21% ;分子量为109. 64kDa的胶原蛋白的质量 分数为10.05% ;
[0061] 经FT- IR红外光谱测定胶原蛋白包括[a1]和[a2]肽链组成的三维螺旋结构， a、P螺旋，折叠及由3个氨基酸构成一个氢键闭合的螺旋环，并且未发现混乱结结构，说 明胶原结构完整。
[0062] 经变性温度测定，胶原ASC玻璃转化温度（Tg)为26. 80 °C，热溶解温度（Tm)为 42. 98°C;PSC玻璃转化温度（Tg)为28. 20°C，热溶解温度（Tm)为42. 21°C。
[0063] 经等电点测定，胶原PSC的等电点在6. 8~7. 01范围，ASC在6. 9~7. 03范围。
[0064] 大鼠I型胶原酶联免疫分析结果表明，用酶切除胶原蛋白端肽的酶溶性胶原 (PSC)，在大鼠血清I型胶原的含量比酸溶性胶原低46. 5%。
[0065] 经电镜扫描，胶原纤维的明暗交替排列，首尾相随，平行排列。胶原分子为右手螺 旋，3股肽链为左螺旋，左上角图呈现不同层胶原纤维的排列方向。
[0066] 胶原蛋白膜的制备方法为：
[0067] 将60mg~240mg胶原蛋白溶于20mL的醋酸溶液中，搅拌溶解，移入60mm的培养 皿中静置于4°C冰箱中至脱除气泡为止。向溶液中加入0.5g/L戊二醛，再置入4°C冰箱中 交联24h。将此培养皿放入50°C烘干箱中烘干48h后取出，56g/LNaOH溶液中浸泡30min， 取出薄膜，蒸馏水冲洗干净制得胶原蛋白膜。
[0068] 制备出的胶原蛋白膜色微黄，较透明，柔韧性好，可随意修剪成任何形状。因经 过戊二醛的交联，所以强度也有所加强。
[0069] 胶原蛋白膜在进行细胞培养或诱导分化前需以乙醇浸泡后再以培养基浸泡。具体 为：将胶原蛋白膜先泡入乙醇溶液中24h，再以培养液浸泡24h后用于细胞的接种。
[0070] 脐带间充质干细胞的分离培养方法为：
[0071] 将脐带（乙肝、丙肝、HIV、支原体、梅毒等血清学检查均为阴性）置于含有lOOU/mL 青霉素和lOOU/mL链霉素的PBS中漂洗2次，加入预冷的75%酒精，浸泡l-2min，期间不停 翻动脐带；加入PBS漂洗2次洗去酒精。用组织剪将脐带剪成2_左右的小段，每段用眼科 剪纵向开，用血管钳去除脐带内三根血管（两条动脉，一条静脉），同时去除脐带外膜；将分 离好的脐带用眼科剪剪成约1_3大小的组织块，取适量放入直径为IOcm的无菌培养皿中， 覆盖70%培养皿的底面积。加入LONZA人干细胞无血清培养液（LonzaUltra⑶LTURE?)， 5%C02、37°C、湿度为95%的CO2培养箱中培养。第5天~7天半量换培养基，继续培养12 天~14天左右全量换液去掉组织块同时收集细胞传代培养，获得hUC-MSCs细胞。
[0072]经电镜观察（如图1)，传递3~5代的hUC-MSCs生长旺盛，边界光滑，呈现巢状 生长，集落大多呈多角形或椭圆形，集落内细胞排列紧密，边界不清；细胞边界清，胞浆较丰 富，细胞核大，核仁大。
[0073] 取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，流式细胞术检测表面抗原CD105、 CD45、CD34、CD31、CD40、CD29、CD44、HLA-DR表达情况，Cell-Quest软件分析结果。每个样 本分析6000~8000个细胞。结果显示，第3代hUC-MSCs高表达CD105、CD44和CD29,低 表达或不表达HLA-DR、⑶31、⑶45、⑶40和⑶34等标记物，符合干细胞特性。
[0074] 本发明实施例中用于角膜上皮细胞鉴定的抗体为AEl和AE5,它们都是细胞角蛋 白抗体。AEl可以识别相对分子质量分别为56500、50000、48000和40000的酸性细胞角蛋 白，能与角膜上皮细胞的一种相对分子质量为48000的酸性角蛋白发生反应，与波形蛋 白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白等丝状蛋白无交叉反应。AE5能够与角膜上皮 细胞的角蛋白K3(相对分子质量为64000)特异性结合，与人、兔、牛的角膜上皮细胞有反 应，而与皮肤上皮细胞无交叉反应。细胞角蛋白K3是分化状态较高的角膜上皮细胞的标 志蛋白。因此，如果细胞AEl和AE5的免疫组化染色阳性时，那么这种细胞为角膜上皮细 胞。
[0075] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0076] 实施例1 :
[0077] 培养液：含lOOU/mL青霉素和lOOU/mL链霉素，体积分数为55% LONZA人干细 胞无血清培养基（LonzaUlt