养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩， 细胞间隙增大后，加入本发明提供的无血清培养基，终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒 置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1:2~1:3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37°C、 5%C02、95%湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代，每2-3 天换液一次。
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合本发明提供的不 同无血清培养基培养间充质干细胞的实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此 处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037] 实施例1
[0038] 在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：
[0039] DMEM/F12 培养基：500mL;
[0040] 胰岛素：10yg/ml;
[0041] 转铁蛋白：10μg/ml;
[0042] 柠檬酸铁：10μg/ml
[0043] 亚硒酸钠：20μg/ml;
[0044] 纤粘连蛋白：2yg/ml;
[0045] 胰高血糖素：3yg/ml;
[0046] 肝细胞生长因子：10ng/ml;
[0047] 青链霉素：50U/ml。
[0048] 实施例2
[0049] 在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：
[0050] DMEM/F12 培养基：500mL;
[0051] 胰岛素：6yg/ml;
[0052] 转铁蛋白：7yg/ml;
[0053] 亚硒酸钠：15yg/ml;
[0054] 表皮生长因子：15ng/ml;
[0055] 肝细胞生长因子：15ng/ml;
[0056] 纤粘连蛋白：1. 5yg/ml;
[0057] 胰高血糖素：5yg/ml;
[0058] HEPES：15mmol/L；
[0059] 青链霉素：120U/ml。
[0060] 实施例3
[0061 ] 在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：
[0062] DMEM/F12 培养基：500mL;
[0063] 胰岛素：5yg/ml;
[0064] 转铁蛋白：5yg/ml;
[0065] 亚硒酸钠：10yg/ml;
[0066] 表皮生长因子：20ng/ml;
[0067] 肝细胞生长因子：20ng/ml;
[0068] 纤粘连蛋白：1yg/ml;
[0069] 胰高血糖素：4yg/ml;
[0070] HEPES:IOmmo1/1 ;
[0071] 青链霉素：100U/ml;
[0072] 地塞米松：lnmol/ml。
[0073] 为进一步验证本发明提供的无血清培养基具有突出的显著性效果，以下通过具体 实验进一步详细说明。
[0074] 检测对象：
[0075] 实验组1-3 :分别对应利用本发明实施例1-3提供的无血清培养基按照上述步骤 2)的方法步骤培养所获得的细胞；
[0076] 对照组：采用含有10% (WT)的胎牛血清、lOmmol/1HEPES、100U/ml青链霉素的 DMEM高糖培养基代替本发明中的无血清培养基培养所获得的细胞；其中，还包括采用NaOH 溶液调节培养基PH值至7. 2-7. 4的步骤。
[0077] 一、检测实验一
[0078]MTT法检测细胞活性
[0079] 取5块96孔板，每块96孔板以5XIO3/孔的密度将实验组和对照组培养获得的 第3代细胞各接种于5个孔板中，对照组每孔加入含10% (WT)胎牛血清的低糖DMEM液 200y1，实验组1-3每孔分别加入与实施例1-3中对应的无血清培养基200y1，在另外没 有细胞的孔中分别只加入含10% (WT)胎牛血清的低糖DMEM培养基和本发明提供的无血清 培养基各200yL作为空白对照，各5孔，置于37°C，5%CO2培养箱中培养，实验孔和对照孔 每三天换液一次。
[0080] 此后每天同一时间，随机抽取一板，测定光吸收（OD)值。测量时每孔加入20yL 的5mg/mlMTT溶液，继续在37 °C，5 %CO2培养箱中培养6小时后，小心吸弃孔内液体，每孔 内加入150yL的DMSO(二甲基亚砜）。将96孔板放置在酶联免疫检测仪上震荡20分钟， 采用双波长测定法，酶联免疫测定仪设定检测波长492nm，参比波长630nm，测定OD值，根据 测得的OD值来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。
[0081]表 1 :
[0082]
[0083] 检测结果：由表1中的数据可知，实验组1-3的OD值均大于对照组，由此可知，通 过本发明提供的无血清培养基所获得的间充质干细胞数量较多，且活细胞数量较多，活性 较高。
[0084] 检测实验二、细胞周期检测
[0085] 分别取实验组和对照组培养第14天所获得的细胞，经流式细胞术分析G0/G1期、 G2/M期细胞百分比，分别各取5组标本进行检测分析。
[0086]表 2 :
[0087]
[0088] 检测结果：由表2可知，实验组1-3中，G1^G1期和G2/M期细胞百分比均大于对照 组；由此可知，实验组1-3通过无血清培养基所获得的活细胞数量多于对照组通过血清培 养基所获得的活细胞数量，且实验组G1^G1期细胞百分比远大于G2/M期，由此说明，本发明 提供的无血清培养基能够延长细胞的G1^G1期而较长时间的维持细胞高密度的培养，在相 应诱导剂的刺激作用下，有利于间充质干细胞转化成更多的目的产物。
[0089] 综上所述，本发明提供的无血清培养基，通过在基础培养基中加入补充因子代替 血清，不仅可避免血清所带来的外源性污染以及血清组分的细胞毒性作用，而且能够避免 不明血清组分对细胞培养及试验研究的影响；除此之外，无血清培养基成分比较明确、质量 一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性，提高细胞培养和试验结果的重复性，并且易于纯 化细胞产品；另外，本发明提供的无血清培养还有利于延长细胞的6。/匕期，在细胞诱导剂 的刺激作用下，有利于分化出较多的目的产物。
[0090] 以上结合本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种无血清培养基，包括基础培养基，其特征在于：还包括胰岛素、含铁的食品添加 剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。2. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述含铁的食品添加剂包括转 铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。3. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基中，亚硒酸钠 的浓度为5-20 y g/ml、含铁的食品添加剂的浓度为2-10 y g/ml、胰岛素的浓度为2-10 y g/ ml、纤粘连蛋白的浓度为0. 1-2 y g/ml、胰高血糖素的浓度为1-10 y g/ml、肝细胞生长因子 的浓度为10_30ng/ml以及青链霉素的浓度为20-200U/ml。4. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，还包括表皮生长因子和HEPES。5. 根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于，所述表皮生长因子的浓度为 10-30ng/ml，以及 HEPES 的浓度为 5-20mmol/l。6. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，还包括氢化可的松、地塞米松和 雌激素三者中的一种。7. 根据权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于，所述氢化可的松的浓度为 6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0. l-2nmol/ml，或，雌激素的浓度为l-10nmol/l。8. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培 养基。9. 一种干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取干细胞，采用如权利要求1-8任一项所述的无血清培养基进行体外培养。
【专利摘要】本发明涉及一种无血清培养基，包括基础培养基，胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素等。同时，本发明还公开了一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用本发明提供的无血清培养基进行体外培养。通过本发明提供的无血清培养基所获得的细胞，不仅可避免血清培养基所携带的病原体污染造成纯化细胞困难的问题，而且能够提高细胞生产的稳定性、提高细胞增殖量，以及增强细胞活性。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105087481
【申请号】CN201510519825
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月21日