(基因 公司市售产品）、CD3激发型单抗（基因公司市售产品）、香菇多糖（基因公司市售产品）、 血清和RPMI-1640培养基组成，其中，IFN-y含量为200U/ml，⑶3激发型单抗含量为IOng/ ml，IL-2含量为100U/ml，香菇多糖含量为0.0625mg/ml，血清含量为5% (体积百分数）； 所述细胞悬液中PBMC的密度为IXIO6个/ml;
[0072] 6)将细胞悬液接种到T75fIask中，在37°C、5 % (体积浓度）CO2条件下进行培养；
[0073] 7)每天观察生长状况，第5天向T75fIask中补加培养液，直至T75fIask中细胞悬 液总体积为50~75mL;所述培养液由IFN-y、⑶3激发型单抗、香菇多糖和RPMI-1640培养 基组成，其中，IFN-y含量为200U/ml，CD3激发型单抗含量为10ng/ml，IL-2含量为100U/ ml，香菇多糖含量为〇? 〇625mg/ml;
[0074] 8)将T75fIask中的细胞悬液转入T175fIask中，补加步骤7)使用的培养液；补 液后保证细胞密度在〇. 5XIO6~I. 5X10 6个/ml的范围内；
[0075] 9)每隔2天补加步骤7)使用的培养液，也可视细胞的生长情况确定培养液补加 的时间间隔，补液前保证细胞的密度不大于3XIO6Ail，补液后保证细胞密度为0. 5XIO6~ I. 5XIO6个/ml;
[0076] 10)培养到第14天对细胞进行收集。
[0077] 对比例
[0078] 1)抽取40ml外周血，把外周血转移至50ml离心管中，用1倍体积的生理盐水稀 释混勾，缓慢的加到Ficoll(挪威Axis-Shield公司，产品编号14547)中，3500rpm离心 20min；
[0079] 2)离心结束后，抽取离心管中的PBMC条带层，用生理盐水重悬，然后1500pm离心 IOmin；
[0080] 3)离心结束后，去除上清液，剩余物再次用生理盐水重悬，然后1500rpm离心 IOmin；
[0081] 4)离心结束后，去除上清液，得到I. 5XIO7个PBMC;
[0082] 5)使用培养液重悬上述获得的PBMC，得到细胞悬液；所述培养液由IFN-Y(基因 公司市售产品）、CD3激发型单抗（基因公司市售产品）和RPMI-1640培养基组成，其中， IFN-y含量为500U/ml，CD3激发型单抗含量为20ng/ml，IL-2含量为500U/ml;所述细胞 悬液中PBMC的密度为IXIO6个/ml;
[0083] 6)将细胞悬液接种到T75fIask中，在37°C、5 % (体积浓度）CO2条件下进行培养；
[0084] 7)每天观察生长状况，第5天向T75flask中补加步骤5)使用的培养液，直至 T75flask中细胞悬液总体积为50~75mL;
[0085] 8)将其转入T175fIask中，补加步骤5)使用的培养液；补液后保证细胞密度在 0. 5XIO6~I. 5X10 6个/ml的范围内；
[0086] 9)每隔2天补加步骤5)使用的培养液，也可视细胞的生长情况确定培养液补加 的时间间隔，补液前保证细胞的密度不大于3XIO6Ail，补液后保证细胞密度为0. 5XIO6~ 1. 5XIO6个/ml;
[0087] 10)培养到第14天对细胞进行收集。
[0088] 实施例4
[0089] CIK细胞的效果测试
[0090] 实施例1~3和对比例培养得到的CIK细胞进行细胞数、细胞活率、杀伤活力和细 胞表面抗原的检测；
[0091] 1)细胞冻存前后的活率检测
[0092] 将实施例1~3组和对照组的细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计 数，计算出细胞数和细胞活率，如下表1
[0093] 表1细胞数和细胞活率表
[0094]
[0095] 从上述表格可以看出实施例1~3组的细胞数远高于对比例，也就说明实施例的 扩增倍数高于对比例，细胞的活率也高于对比例，尤其是实施例2的结果最佳。说明，采用 本发明实施例提供的培养方法进行CIK细胞培养可以促进CIK细胞的增殖。
[0096] 2)细胞杀伤活力的检测
[0097]效靶比是效应细胞与靶细胞的比值，这里的检测方法主要是乳酸脱氢酶法，通过 此法进行的杀伤活性实验，简单描述其检测步骤如下：
[0098]a.靶细胞制备：取培养24~48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培 养液调整细胞浓度至IXIO5个/ml，备用。
[0099] b.效应细胞的制备：收集所需检测的CIK细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640 培养液调整细胞浓度至IXIO7个/ml。
[0100] c.效-靶细胞作用：取效应细胞和靶细胞各0.Iml(效应细胞（E) /靶细胞⑴= 100 : 1，个/个）加至40孔板的孔中，得到实验组，每份标本设3个复孔。同时设效应细胞 自然释放组、靶细胞自然释放对照组和靶细胞最大释放对照组（0.Iml靶细胞+0.Iml1% NP-40细胞裂解液），低速离心1000r/min，2min后，置37°C、5%CO2温箱中孵育2h。
[0101] d.酶促反应：取出培养物，吸取各孔上清0.Iml加于另一培养板孔中，置37°C预温 lOmin，每孔加入新鲜配制的乳酸脱氢酶（LDH)底物溶液0.lml，室温避光反应10~15min， 每孔加入lmol/L柠檬酸终止液30y1，以终止酶促反应。
[0102] e.结果计算：用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，计算CIK细胞杀伤 活力，CIK细胞杀伤活力（％ )=(实验-CIK细胞自发-K562自发）AK562最大-K562自 发）X100 %，其中，实验为实验组的OD值，CIK细胞自发为效应细胞自然释放组的OD值， K562自发为靶细胞自然释放对照组的OD值，K562最大为靶细胞最大释放对照组的OD值。 结果参照见表2。
[0103] 3)细胞表面抗原通过流式细胞仪进行检测，检测结果参照表2。
[0104] 表2细胞杀伤活力和表面抗原的检测结果
[0105]
[0106] 通过表2中的各项检测结果可以看出实施例组的培养方法得到的CIK细胞无论是 从杀伤活性上，还是细胞表面抗原数量上都优于对比例的培养方法，说明采用本发明实施 例提供的培养方法进行CIK细胞培养可以增强CIK细胞杀伤肿瘤的活性。
[0107] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种CIK细胞培养液，包括干扰素-Y、⑶3激发型单抗、白细胞介素-2、香菇多糖和 无血清基础培养基。2. 根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述香菇多糖在培养液中的含量为 0?05 ~0? 3mg/mL。3. 根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，还包括血清。4. 根据权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述血清在培养液中的体积百分含量 为5~20%。5. 根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述干扰素_ Y在培养液中的含量为 200~lOOOU/mL ;所述⑶3激发型单抗在培养液中的含量为10~80ng/mL ;所述白细胞介 素-2在培养液中的含量为100~600U/mL。6. -种CIK细胞的培养方法，包括以下步骤： a)、使用权利要求1~5任意一项所述的培养液培养外周血单个核细胞，获得CIK细 胞。7. 根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤a)具体包括以下步骤： al)、外周血单个核细胞在所述培养液中重悬，得到细胞悬液； a2)、将所述细胞悬液接种到细胞培养容器中进行培养，获得CIK细胞。8. 根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述细胞悬液中的外周血单个核细 胞密度为〇. 5 X IO6~I X 10 6个/mL。9. 根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为37 °C;所述培养的 CO2体积浓度为5% ;所述培养的时间为12~16天。10. -种香菇多糖在CIK细胞培养中的应用。
【专利摘要】本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种CIK细胞培养液及CIK细胞的培养方法和香菇多糖在CIK细胞培养中的应用。本申请提供的CIK细胞培养液包括干扰素-γ、CD3激发型单抗、白细胞介素-2、香菇多糖和无血清基础培养基。本申请在CIK细胞培养液中加入香菇多糖，使用这种培养液进行CIK细胞培养时，能够促进PBMC产生淋巴细胞活化因子和释放辅助性T细胞因子，促进CIK细胞的增殖，进而使培养得到的CIK细胞表现出大的扩增倍数、强的杀伤活性和高的细胞表面抗原含量。实验结果表明，采用本申请提供的培养液培养CIK细胞14天后，CIK细胞扩增倍数大于300倍，CIK细胞体外杀伤率(效靶比40:1)大于(80±2)％，CIK细胞表面抗原(CD3+和CD56+)数量大于48％。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105087486
【申请号】CN201510504254
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 李丽娟, 万桦
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月17日