一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量测序领域，具体涉及一种单染色分离方法、单染色体高通量测 序文库的构建方法及应用。
【背景技术】
[0002] 人类基因组分析工作已经从确定所有人的"平均"参考序列（reference sequence)快速进入个体基因组测序时代。目前单细胞已经成为科学家们关注的重点，但 是对于单个染色体的研究还是一个很空白的领域。人体内的每一个细胞里都含有两套基因 组，其中一套来自父亲，另外一套来自母亲，这就叫做单体型现象，而每一个单倍体基因组 (haploidgenome)中的变异都会对基因的表达、蛋白质的功能，以及疾病造成非常大的影 响。
[0003]目前对于单细胞测序都是较为困难的，从单细胞里分离到单个的染色体，并在皮 克范围内进行微量的建库，这都是目前行业的难点及关注点。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种单染色分离方法、单染色体高通量测序文库 的构建方法及应用。
[0005] 第一方面，本发明提供了一种单染色分离方法，包括如下步骤：
[0006] S01)模拟实验
[0007] 采用随机数产生方法建模，获得验证实验总共所需要的稀释容器的最佳数目，包 括如下步骤：
[0008]a)待分析物种染色体数记为X，并分别编号为Sn，n= 1~X，n和X为自然数；
[0009]b)在I-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个Sn各对 应X个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小 于X;重复步骤b)T次；
[0010] c)计算步骤b)T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录 为对应染色体的种类和数量；
[0011] d)将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及Pl~P3 四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC;2)将所有同源染色体 完全分开的实验的频率，记为Pl;3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2 ;4)完全 不含染色体的稀释容器的频率，记为P3 ;综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最 佳数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。
[0012] S02)进行验证实验
[0013] 获得待分析物种分裂中期至中后期的单细胞，取全部染色体，采用梯度稀释法将 全部染色体稀释到Q个稀释容器中，获得至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。
[0014] 优选地，所述步骤SOI)中的步骤a)中，待分析物种为人，X为46。
[0015] 优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，所述的将Z个数均等分布在N个稀释容器 中的步骤包括：将Z个数从大到小排列，每隔Z/N个数取一次数值对应一个稀释容器。比 如，Z为10,N为5,则每隔2个数取1次数值对应一个稀释容器：S卩，数字1和2分布到第 1个稀释容器中，数字3和4分布到第2个稀释容器中，数字5和6分布到第3个稀释容器 中，依次类推。
[0016] 优选地，所述步骤S01)中的步骤b)之前还包括：确定Z和T值。
[0017] 进一步优选地，确定Z和T值的步骤包括：
[0018] 统计步骤b)中如下PHC、Pl~P3四个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染 色体的数量，记为PHC;2)将所有同源染色体完全分开的实验的频率，记为Pl;3)只含有1 条染色体的稀释容器的频率，记为P2 ;4)完全不含染色体的稀释容器的频率，记为P3;取各 参数均趋于稳定时最小的Z'和T'值，即为合理的Z和T值。
[0019]T值即：步骤S01)中，共需要重复步骤b)(随机分管过程）多少次比较合理，T优 选为20000。Z值即：步骤S01)的步骤b)中，X被稀释多少倍（将X稀释在Z个数中）比 较合理。
[0020] 优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，Z为2n(n= 6~16)，优选为1024。
[0021] 优选地，所述步骤S01)中的步骤b)中，N为4-256中任一自然数（N优选为4的 倍数）。
[0022] 优选地，所述步骤S01)中的步骤d)中，综合四个参数，得出总共所需要的稀释容 器的最佳数目Q(优选为24)的标准为：P2尽可能大；且取Pl和P3尽可能小。
[0023] 优选地，所述步骤S02)中，梯度稀释法对染色体进行稀释的步骤包括：
[0024]1)将Q或者R进行因式分解，得Y=y*2n，其中，Y=R或Q，n为自然数，R=Q± 2k， k、R为自然数；
[0025] 2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细 胞悬液，总体积为V1;
[0026] 3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补 足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0027] 4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀 释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0028] 5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中， 至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。
[0029] 进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，y不能被2整除。
[0030] 进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，k为0~10的自然数。
[0031] 更进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，k为4~8的自然数。
[0032] 进一步优选地，所述步骤S02)中的步骤1)中，所述Y= 8、16、24和32中的至少 1种。
[0033] 第二方面，本发明提供了一种单染色体高通量测序文库的构建方法，包括如下步 骤：
[0034] 将第一方面所得的单染色体进行扩增，得到单染色体高通量测序文库。
[0035] 优选地，进一步对单染色体高通量测序文库进行高通量测序，并对测序结果进行 生物信息学分析，获得各稀释容器中的单染色体的种类和数量，以及所有单染色体的序列 fg息。
[0036] 进一步优选地，所述"对测序结果进行生物信息学分析"之前，还包括如下模拟实 验来确认后续生物信息学分析结果的可靠性：1.选取参考基因组（如hgl9);选定碎片长 度L(L= 50bp~150bp，优选为50bp) ;2?把1号染色体每Lbp(选为50bp)，取出来作为一 个read，制作成fastq文件，再用bowtie2,对比到hgl9基因组上；统计其所有reads在各 染色体上的分布；3.对其他所有染色体重复步骤2 ;4.对各染色体切割的结果显示：是否 不低于95%的reads都对比到原染色体上。
[0037] 第三方面，本发明提供了一种采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的 方法，包括如下步骤：
[0038] 1)将Q或者R进行因式分解，得Y=y*2n，其中，Y=R或Q，n为自然数，R=Q±2k， k、R为自然数；
[0039] 2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细 胞悬液，总体积为V1;
[0040] 3)将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补 足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0041] 4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀 释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0042] 5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中， 至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。
[0043] 优选地，所述步骤1)中，y不能被2整除。
[0044] 优选地，所述步骤1)中，k为0~10的自然数。
[0045] 优选地，所述步骤1)中，k为4~8的自然数。
[0046] 优选地，所述步骤1)中，所述Y= 8、16、24和32中的至少1种。
[0047] 第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的单染色分离方法、如第二方面所 述的单染色体高通量测序文库的构建方法或如第三方面所述的采用稀释法对染色体进行 分离获得单个的染色体的方法在单倍型测序中的应用。
[0048] 有益效果：
[0049] 本发明提供了的技术方案，先通过计算机模拟实验，获得最佳的稀释参数，然后通 过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得单染色体，再进行测序以及生物信息学分 析，从而可以判断出变异基因是来源于同源染色体中的父方还是母方。相比将同源染色体 作为一个混合样品进行测序，本发明采用稀释法分离获得单染色体，可用于单倍型测序，对 科研以及临床均有重要应用价值。值得注意的是，本发明提供的技术方案简单，且应用范围 广，不仅可用于分离细胞中的同源染色体，还可用于分离细胞中其他任何单个染色体（比 如，对于双倍体生物，本发明提供的方案可以用于分离同源染色体；对于单倍体生物，本发 明提供的方案可以用于分离单个的染色体），以获得单个染色体的序列信息。
【附图说