明】
[0050]图1为本发明确定每次实验模拟多少次随机分管过程比较合理的分析结果；
[0051] 图2为本发明确定容器中共有多少个球比较合理的分析结果；
[0052]图3为本发明实施例提供的第一模拟实验的分析结果；
[0053] 图4为本发明第二模拟实验四号染色体切割的结果；
[0054]图5本发明实施例提供的采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体的方法 示意图；
[0055]图6为本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0056]图7为本发明实施例提供的生物信息学分析结果。
[0057] 下面结合具体方案对本发明提供的技术方案做进一步阐述。
[0058] 本发明提供了的技术方案，是通过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得 单染色体；包括计算机模拟实验和验证实验（wetlab)。
[0059] 本发明所述的"单个细胞"包括但不限于具有同源染色体的细胞，还可以是其他细 胞种类（比如，减数分裂中仅具有单倍体的生殖细胞）。
[0060] 本发明所述的"获得单染色体"，包括但不限于将同源染色体分离，获得单个的父 方或母方染色体；还包括获得"单个的染色体"。
[0061] 本发明所述的"单个的染色体"是指1条染色体，值得注意的是，含有2条姐妹染 色单体的染色体包括在本发明所述的"单个的染色体"之内。
[0062] 本发明采用Perl编程的软件通过一次计算机模拟实验（记为第一模拟实验），获 得总共所需要的稀释容器的最佳数目；软件编程的设计思路如下（为方便理解，下述具体 步骤均给出具体数值，可以理解的是，本领域技术人员可以根据具体需要对各数值进行调 整）：
[0063] 一、由生物问题建立数学模型：
[0064] 把每个染色体视作小球，把同样体积的水分子视作一个小球。先假设容器内一共 有1024个小球（分别编号1-1024)。其中48个小球是染色体，其他的是水分子。那么染色 体被分到不同的试管中的过程，就可以视为小球被分到不同的试管中的过程。
[0065]二、设计：
[0066] 1.在1-1024中随机数产生48个数，48个数分别依次对应为1-48号染色体，1个 数对应1条染色体编号。（1024减去这48个数后，余下的球是水分子；这一步过程就相当 于是在试管中混匀染色体的过程）
[0067] 2.把1024个球，按照编号顺序从小到大或从大到小均分到8个试管中（比如 1-128分在第一个试管中，129-256分在第二个试管中，依次类推）。（因为第一步是随机产 生的数，这里就可以按照顺序，不用再随机了。）
[0068] 3.统计这一次模拟中：1)有多少对同源染色体（PHC)在一个试管里面；2)是否所 有同源染色体都被分在不同试管；3)有多少试管只含有一条染色体；4)有多少试管不含染 色体。
[0069] 4.重复上面的模拟100次，统计：1)PHC的平均值；2)统计把同源染色体完全分开 的实验的频率，记为Pl;3)统计只含有一条染色体的试管出现的频率，记为P2 ;4)统计不 含有任何染色体的试管出现的频率，记为P3。
[0070] 三、具体实验方法及结论：
[0071] 1.确定每次实验模拟多少次随机分管过程比较合理
[0072]a)保持1024个球和分成16管不变，改变实验设计中第4步，"重复1000次"的参 数。从100次，变化到1000次，间隔为100次；从500次，变化到50000次，间隔为500次。
[0073]b)统计实验设计中4个参数的值，画图，看在多少次之后，四个值都稳定下来，即 变化范围非常小。
[0074]c)结论是，在重复次数到20000次后，四个值的变化范围就很小了，结果见图1。所 以后面两组实验中，重复次数都取20000次。
[0075] 2.确定容器中共有多少个球比较合理
[0076]a)理论上，水分子体积是远大于染色体体积的，但是受计算机计算能力限制，没有 必要设置类似于1〇〇万个球里面，48个球是染色体。所以要探究一下大概设置多少个之后， 四个值就趋于平稳了。
[0077]b)保持20000次重复实验，分成16管不变，改变1024这个数值。每次取值为2n 取做模拟，n从6做到16,即从64个球做到了 65536个球。
[0078]c)统计实验设计中4个参数的值，画图，看在多少次之后，四个值都稳定下来。
[0079]d)结论是，在球数达到1024后，四个值的变化范围就很小了。结果见图2。
[0080] 3.用上面确定的参数，改变试管数，确定最优试管数目
[0081]a)保持球数为1024,重复20000次实验不变，改变试管数。从4变到256,每次间 隔为4。
[0082]b)统计实验设计中4个参数的值，画图，确定最优试管数。
[0083]c)结果见图3。可以看到，在达到24管时，含有同源染色体的试管数已经降到1 以下，且再增加试管数是，对PHC和Pl而言，带来的增益较小；P2在24管时，达到最大值； P3在24管时，具体值是14. 7%，不是很高。故得结论理论最优值为24。
[0084] 在本发明第一模拟实验的基础上，本发明进一步提供了如下验证实验：
[0085] 本发明验证实验中，我们采用稀释方法对处于分裂期（有丝分裂中期或中后期； 或减数分裂I中期~减II中后期）单细胞的染色体进行分离，获得至少一个仅具有单染 色体（优选为仅有1条单染色体）的稀释容器，完成同源染色体的分离，获得单染色体；其 中，稀释所用容器的数量为第一模拟实验所得最佳稀释容器数或包括最佳稀释容器数在内 的几组较佳数值。
[0086]比如，若第一模拟实验所得的最佳稀释容器数记为Q个（优选为24)，其中，Q为不 大于N的自然数；则验证实验中用来稀释染色体的容器数共Q个，或者为R中的至少一种， 其中，R为Q±2k，k为0~10的自然数（优选地，k为4~8的自然数）。
[0087] 在本发明一验证实验中，稀释所用容器的数量优选为8、16、24和32中的至少1 种。
[0088] 在本发明一验证实验中，所述分裂期单细胞优选为有丝分裂中期至中后期、或者 减数分裂I中期至减II至中后期的细胞。这些时期中，细胞的染色体形态清晰，有利于观 察和计数，便于分离。
[0089] 在本发明一验证实验中，所述分裂期单细胞包括但不限于采用秋水仙素处理所制 得；也可以采用本领域内其他常用的、与秋水仙素相同用途的试剂进行处理制得。
[0090] 本发明一验证实验中，所述"稀释容器"包括但不限于PCR管或其他常规实验室EP 管，体积规格包括但不限于100ul、0. 5mL、lmL、2mL。
[0091] 本发明一验证实验中，"采用稀释容器对染色体进行分离"的步骤包括：
[0092] 1)将Q或者R进行因式分解，得Y=y*2n，其中，Y=R或Q，n为自然数，y不能被 2整除；
[0093] 2)取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细 胞悬液，总体积为V1;
[0094] 3)将步骤1)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补 足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0095] 4)将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀 释容器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V1，并混匀；
[0096] 5)重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中， 至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。
[0097] 本发明一验证实验中，进行稀释时，原装稀释容器不丢弃，而是进入下一轮稀释， 这样不会造成染色体丢失。比如，对A容器中的细胞悬液（总体积为V2)进行稀释，则取B1 容器，取A中细胞悬液的一半（0. 5V2)加入B1*，然后分别在六和1中加入0. 5乂2的细胞悬 液，并将A标记为B2。以此方法，对队和B2进行后一轮稀释。
[0098] 本发明验证实验中，步骤1)中所述的"将Q或者R进行因式分解"是指将Q或者R 分解到不能再被2整除，比如当Q或R为8、16、24或32时，进行因式分解有8 = 2*2*2、16 =2*2*2*2、24 = 3*2*2*2、32 = 2*2*2*2*2 ;进行稀释时，不能被2整除的最小数（即y，比 如，在Q或R= 24中，y= 3)，即为进行第一次稀释后所得的稀释容器的数量。
[0099] 本发明的验证实验中，染色体分离完成后，获得的仅含有单染色体的稀释容器进 一步可用于构建单染色体高通量测序文库：通过采用常规的染色体扩增方法（比如WGA4、 WGA3)分别扩增各稀释容器中单染色体，即可得到单染色体高通量测序文库；单染色体高 通量测序文库经过测序、生物信息学分析，即可获得同源染色体中各单染色体的信息。由于 父方与母方的同源染色体被分开，故本发明技术方案能获得每一个单倍体基因组（haploid genome)中的变异信息。
[0100] 目前，高通量测序的主要平台代表有罗氏公司（Roche)的454测序仪（RochGS FLX