分钟。连接产物纯化
[0167] 8)磁珠（Beckman,AmpureXP)或柱纯化（Qiagen,QIAquickPCRPurification Kit)文库加index及扩增（具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书）PCR体 系：
[0168] 2XphusionMasterMix(NewEnglandBiolabs#M0531S) 25ul
[0169]PlIul
[0170] IndexIul
[0171] 连接产物 23ul
[0172] 用以上混合物进行以下PCR反应
[0175] 9)扩增产物纯化
[0176] 用QiagenPCRProductionPurificationKit进行纯化获得单染色体高通量测 序文库；采用Miseq测序仪进行高通量测序。
[0177] 10)对高通量测序结果进行生物信息学分析
[0178] 采用Bowtie2对测序序列进行比对分析，以hgl9为参考，获取sam文件；
[0179] 对各个PCR管对应的sam文件进行分析，数出各管中各染色体出现的数量；
[0180] 将各染色体出现的数值除以其长度，再乘以100,〇〇〇, 〇〇〇,获得标准化数值；
[0181] 将各管中各染色体出现数值的标准化数值采用柱状图表现出来；并分析获得各管 中染色体的数量和类型。
[0182] 为进一步说明本发明的有益效果，本发明还提供了Q= 32个PCR管的实验数据（Q =8、16、24未显示），包括：
[0183]本实施例中步骤2)WGA4扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果（如图6-a所示）， 和步骤3)WGA3扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果（如图6-b所示），以及步骤9)的纯 化后获得单染色体高通量测序文库的琼脂糖凝胶电泳检测结果（如图6-c所示）。在图6 中，a、b、c图分别包括上下两排，共32个样品孔，分别对应32个PCR管。
[0184] 本实施例中步骤10)生物信息学分析结果的部分数据，如表1和图7所示：表 1显示了每个PCR管的测序所得序列数（rawsequencingreadsnumber)以及比对比例 (mappingrate)，从表1可以看出32个PCR管中各单染色体的情况。图7是统计结果，包 括a-d，经过分析，编号为3以及4的PCR管中第8号染色体的出现频率最高（分别如图7-a 和4-b所示）；在1号PCR管中，出现了多个峰值，表明1号管中有多个染色体（如图7-c所 示）；在某些管中，看上去没有峰值，比如5号，很难说这样的管中存在哪一条染色体（如图 7-d所示）。
[0185] 表I. 32个PCR管中各染色体以及序列信息
[0186] (TubeNo:PCR管编号；existingchromosome(s):含有的染色体）
[0187]
[0188] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种单染色分离方法，其特征在于，包括如下步骤： 501) 模拟实验 采用随机数产生方法建模，获得验证实验所需要的稀释容器的最佳数目，包括如下步 骤： a) 待分析物种染色体数记为X，并分别编号为Sn，n = 1-X，n和X为自然数； b) 在I-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个Sn各对应X 个数中的一个数值；将Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X ; 重复步骤b)T次； c) 计算步骤b) T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对 应染色体的种类和数量； d) 将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及Pl~P3四 个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC ;2)将所有同源染色体完 全分开的实验的频率，记为Pl ;3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2 ;4)完全不 含染色体的稀释容器的频率，记为P3 ;综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳 数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。 502) 进行验证实验 获得待分析物种分裂中期至中后期任一阶段的单细胞，取全部染色体，采用梯度稀释 法将全部染色体稀释到Q个稀释容器中，获得至少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。2. 如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)之前 还包括：确定Z和T值。3. 如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)中， Z 为 2n，n = 6 ~16。4. 如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S01)中的步骤b)中， N为4-256中任一自然数。5. 如权利要求1所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S02)中，梯度稀释法对 染色体进行稀释的步骤包括： 1) 将Q或者R进行因式分解，得Y = y*2n，其中，Y = R或Q，n为自然数，R = Q±2k， k、R为自然数； 2) 取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬 液，总体积为V1; 3) 将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超 纯水至体积为V1，并混匀； 4) 将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容 器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V 1，并混匀； 5) 重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至 少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。6. 如权利要求5所述的单染色分离方法，其特征在于，所述步骤S02)中的步骤1)中， 所述Y = 8、16、24和32中的至少1种。7. -种单染色体高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 将权利要求1所得的单染色体进行扩增，得到单染色体高通量测序文库。8. 如权利要求7所述的单染色体高通量测序文库的构建方法，其特征在于，对单染色 体高通量测序文库进行高通量测序，并对测序结果进行生物信息学分析，获得各稀释容器 中的单染色体的种类和数量，以及所有单染色体的序列信息。9. 一种采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的方法，其特征在于，包括如 下步骤： 1) 将Q或者R进行因式分解，得Y = y*2n，其中，Y = R或Q，n为自然数，R = Q±2k， k、R为自然数； 2) 取1个稀释容器，在稀释容器中先后加入细胞裂解液和1个单细胞，孵育，得细胞悬 液，总体积为V1; 3) 将步骤2)所得细胞悬液等体积分配在y个稀释容器中，并在每个稀释容器中补足超 纯水至体积为V1，并混匀； 4) 将步骤3)中每个稀释容器中溶液的一半分别置于新的稀释容器中，得y*2个稀释容 器，并在每个稀释容器补足超纯水至体积为V 1，并混匀； 5) 重复步骤4)共n次，最后获得Y个含有细胞悬液的稀释容器；在Y稀释容器中，至 少有1个为仅含有单染色体的稀释容器。10. 如权利要求1所述的单染色分离方法、如权利要求7所述的单染色体高通量测序文 库的构建方法或如权利要求9所述的采用稀释法对染色体进行分离获得单个的染色体的 方法在单倍型测序中的应用。11. 一种模拟单染色分离的方法，其特征在于，包括如下步骤： a) 待分析物种染色体数记为X，并分别编号为Sn，n = 1-X，n和X为自然数； b) 在I-Z个数中随机产生X个数；将X个数分别对应为染色体编号，每个Sn各对应X 个数中的一个数值；将 Z个数均等分布在N个稀释容器中，其中Z、X为自然数，Z不小于X ; 重复步骤b)T次； c) 计算步骤b) T次模拟实验中，每次模拟实验后各稀释容器中对应的数字，记录为对 应染色体的种类和数量； d) 将所有模拟实验步骤c)所得的数据进行统计学分析，获得如下PHC、及Pl~P3四 个参数：1)处于同一个稀释容器中的同源染色体的数量，记为PHC ;2)将所有同源染色体完 全分开的实验的频率，记为Pl ;3)只含有1条染色体的稀释容器的频率，记为P2 ;4)完全不 含染色体的稀释容器的频率，记为P3 ;综合四个参数评估出总共所需要的稀释容器的最佳 数目Q，其中，Q为不大于N的自然数。
【专利摘要】本发明提供了一种单染色体分离方法、单染色体高通量测序文库的构建方法及应用。本发明提供了的技术方案，先通过计算机模拟实验，获得最佳的稀释参数，然后通过稀释法对单个细胞中的染色体进行分离，获得单染色体，再进行高通量测序以及生物信息学分析，从而判断出变异基因是来源于同源染色体中的父方还是母方。相比将同源染色体作为一个混合样品进行测序，本发明采用稀释法分离获得单染色体，可用于单倍型测序，对科研以及临床均有重要应用价值。
【IPC分类】C12N5/078, C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN105087484
【申请号】CN201510501091
【发明人】贺建奎, 张萌, 罗登, 郭佳杰, 王嫣, 陈杳
【申请人】南方科技大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月14日