sequencer)、Illumina公司的Solexa基因组分析仪（IlluminaGenomeAnalyzer)和 ABI的SOLiD测序仪（ABISOLiDsequencer)等，应当指出的是，本发明提供的技术方案适 用于目前任一一种二代高通量测序平台。
[0101] 本发明优选包括第二模拟实验。第二模拟实验的目的：理论上，一条染色体被打断 之后，对比到基因组上，绝大部分片段（也就是后来测序的read)，还能对比到那条染色体 上面去。第二模拟实验目的在于验证该理论，具体模拟方法：
[0102] 1.选取参考基因组为hgl9 ;选定碎片长度为50bp(因为测序仪输出的结果，能用 的长度一般在50bp到150bp之间；且50bp的序列，在基因组上，基本只有一个特定的位置， 极少数有多个位置）。
[0103] 2.把1号染色体每50个bp，取出来作为一个read，制作成fastq文件，再用 bowtie2 (开源生物信息学软件），对比到hgl9基因组上；统计其所有reads在各染色体上 的分布。
[0104] 3.对其他所有染色体重复步骤2。
[0105] 4.对四号染色体切割的结果见图4,其他所有染色体的结果均类似，即几乎所有 (约95% )的reads都对比到原染色体上。
[0106] 以上说明，测序之后，把某稀释管的测序结果align到全基因组上，统计各条染色 体上reads的数目，来确定该稀释管中有哪几条染色体的方法是可行的。
[0107] 本发明部分英文释义（若无释义，则为本领域技术人员常规理解，优选为高通量 测序中的常规理解）：
[0108]Adapter(adapter):接头序列（根据具体的高通量测序平台，使用相应的接头序 列，比如，illumina有PCR扩增接头和测序接头，分别用于文库构建和测序的引物；具体接 头序列参照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书）
[0109]ligasebuffer:连接酶缓冲液Iigase:连接酶
[0110] index:索引序列（测序公司用index来标记样品，以区分样品；具体索引序列参 照罗氏、illumina或ABI的高通量测序文库构建说明书）
【具体实施方式】
[0111] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0112] 本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品。
[0113] 第一模拟实验
[0114] 第一模拟实验所得分析结果如图3所示，图3包括（a) - (d)，由图3可知，第一模拟 实验所得最佳稀释容器数为24 (Q值）。因为：由图3-a可知，Q值=24时，处于同一个稀释 容器中的同源染色体的平均数量小于1 ;由图3-b可知，Q值=24时，将所有同源染色体完 全分开的实验的频率约为〇. 36 ;由图3-c可知，Q值=24时，只含有1条染色体的稀释容器 的频率达到峰值0. 27 ;由图3-d可知，Q值=24时，完全不含染色体的稀释容器的频率也不 是特别高，仅达到〇. 14。
[0115]验证实验（wetlab)
[0116] 本发明实施例提供的一种采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体高通量 测序的方法。
[0117] 实验一：孵育淋巴细胞
[0118] 1)收集全血样品；
[0119] 2)无菌条件下，采用2mL注射器将25滴全血样品滴加到含有细胞培养基的细胞培 养瓶中，制备2瓶，分别进行后续步骤3-6;
[0120] 3)轻轻混匀；
[0121] 4) 37°C，5%CO2条件下，培养 69 小时；
[0122] 5)无菌条件加入秋水仙素至终浓度为0. 4ug/mL;
[0123] 6)轻轻混勾，孵育3小时；
[0124] 7)收集处于有丝分裂中期（M期）的淋巴细胞：
[0125] 7-1)收集2瓶细胞培养瓶中的细胞培养液，混合，500g离心5分钟；
[0126] 7-2)去上清，加入IOmLKCl(75mM)溶液；
[0127] 7-3)将细胞吹散（轻缓），室温静置15分钟；
[0128] 7-4)加入200uL乙酸至终浓度2%，混匀（轻缓），冰上放置30分钟；
[0129] 7-5) 800g离心5分钟，去上清；
[0130] 7-6)加入乙醇：乙酸（3:1)混合液，10mL，细胞吹散（轻缓），800g离心5分钟；
[0131] 7-7)用2mLKCl(75mM)溶液洗涤，800g离心5分钟；
[0132] 7-8)根据细胞量，采用2. 5-5mL的溶液将细胞分散，溶液组分（ImMEDTA，1 % Trition-X100,0.2mg/mLRNaseA，75mMKC1)，然后放入 4°C冰箱过夜。
[0133] 实验二：获取单个淋巴细胞
[0134] 1)制备如下组分的细胞裂解液：
[0135] 0? 03%P印sin1%TritonX1002% 乙酸 75mMKCL
[0136] 2)取准备实验一，步骤7-8所得的细胞悬浮液置于1个PCR管内；
[0137] 3)吸取约5滴细胞悬浮液置于一个Petri板上；
[0138] 4)采用显微操作注射仪吸取1个M期淋巴细胞，释放到板上的细胞裂解液中；当 观察到细胞裂解，使用显微操作仪吸取已经裂解并分散的染色体转移至预先加入的9ul超 纯水中，吹散在PCR管内（低吸附）。
[0139] 实验三：稀释法分离染色体获得单染色体
[0140] 图5为本发明提供的一种采用稀释容器对染色体进行分离，获得单染色体的方法 不意图（以Q= 24为例）。
[0141] 参照图5,采用稀释容器对染色体进行分离的步骤包括：
[0142]l)Q= 24,进行因式分解（Q=y*2n)，得 24 = 3*2*2*2;
[0143] 2)取实验二步骤5所得含染色体溶液的PCR管，所述PCR管中仅具有1个单细胞 的全部染色体，总体积为9uL;
[0144] 3)，将步骤2)所得的9ul含染色体纯水等倍稀释至预先放放置其他待稀释的9ul 纯水低吸附PCR管中，中途不得更换枪头参照准备实验三步骤1-5的方法，取Q= 8、16、32， 分别进行因式分解（Q=y*2n)，分别得8 = 2*2*2 ;16 = 2*2*2*2、32 = 2*2*2*2*2 ;对实验 二步骤5所得含染色体溶液的PCR管进行不同稀释，分别获得8、16、32个含有细胞裂解液 的PCR管，对各PCR管进行编号。
[0145] 实验四：构建单染色体高通量测序文库
[0146] 采用下述步骤对构建单染色体高通量测序文库，步骤包括：
[0147] 1)取准备实验三步骤5)所得的含有单染色体的PCR管，分别作为待扩增样品，配 置WGA4扩增体系进行后续扩增；
[0148] 2)WGA4(Sigma,GenomePlex(K)SingleCellWholeGenomeAmplification Kit)扩增；
[0149]3)磁珠（Beckman,AmpureXP)或柱纯化（Qiagen,QIAquickPCRPurification Kit)，WGA3(Sigma,WholeGenomeAmplification,WGAReamplificationKit)扩增
[0150]4)磁珠（Beckman,AmpureXP)或柱纯化（Qiagen,QIAquickPCRPurification Kit)，-20°C储存。
[0151]5)将步骤4)所得纯化后的DNA进行如下处理：Endpair
[0152]
[0153]Total:50uL，在 20°C下孵育 30 分钟。
[0154] 6)用磁珠（Beckman,AmpureXP)或柱纯化（Qiagen,QIAquickPCRPurification Kit)，得 40uL
[0155] 纯化DNA产物，对所得纯化DNA加A:
[0156]
[0157]Total:50uL，37°C下，孵育30分钟后，柱纯化，得27uL纯化DNA产物。
[0158]7)Adapter连接（采用（NewEnglandBiolabs)连接试剂盒）
[0159] 配置的连接体系如下：
[0160]
[0161] 其中，Adapter信息如下：
[0162]MultiplexingAdapters:
[0163] 5, -P-GATCGGAAGAGCACACGTCT-3，（SEQUNECNO.I)
[0164] 5，-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3，（SEQUNECNO. 2)
[0165] 其中，"P"表示磷酸化；
[0166] 用如上反应体系IOOuL在20°孵育30