一种皮肤成纤维细胞提取制备方法
【专利摘要】本发明公开一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，包括下述步骤：切取人体腹部皮肤，置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中漂洗；将漂洗后皮肤剪成0.8?1.2mm3的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，4℃条件下放置过夜；按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，离心收集细胞，用DMEM洗脱后开放培育48h；待培育的细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化；加入含有15％人自体血清的α?MEM培养液吹打终止消化，以1:2或1:4的比例传代培养48h；取细胞悬液移入离心管中，4?8℃，1000rpm，10～30min条件下离心。本发明提供了充足、可靠的成纤维细胞满足提取。
【专利说明】
_种皮肤成纤维细胞提取制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物细胞技术领域，涉及一种皮肤成纤维细胞提取制备方法。
【背景技术】
[0002]目前最常用的体细胞基因治疗革El细胞有:骨髓细胞、成纤维细胞、角质细胞、肝细胞、内皮细胞、肌细胞等，成纤维细胞是皮肤的主要细胞成分，具有合成和分泌三种纤维APSC多能细胞以及基质的功能，在间质的更新和创伤修复过程中，具有十分重要的作用。成纤维细胞以其众多的优点成为一种理想的靶细胞，皮肤为人体最大的器官，成纤维细胞较容易获取、培养、传代及冻存，从而使成纤维细胞用于基因治疗成为可能。
[0003]现有技术中，皮肤成纤维细胞体外培养常用的方法为组织贴壁法和霉消化法。前者由于皮肤致密、质硬、不宜剪碎，在贴壁时容易造成组织块干燥脱水，细胞不宜获取营养，引起细胞破坏死亡的情况，同时还存在不能短期内获取大量细胞及增殖能力不足的缺陷；后者存在对细胞损伤大、并且对纤维性结缔组织无效的不足。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种皮肤成纤维细胞提取制备方法。
[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0006]—种皮肤成纤维细胞提取制备方法，该方法包括下述提取步骤:
[0007]I)切取人体腹部皮肤，置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中漂洗；
[0008]2)将漂洗后皮肤剪成0.8-1.2mm3的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，4°C条件下放置过夜；
[0009]3)按1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液，离心收集细胞，用DMEM洗脱后开放培育48h;
[0010]4)待培育的细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗，加入含有0.25 %胰酶和0.02% EDTA的PBS消化液消化；
[0011 ] 5)加入含有15 %人自体血清的α-ΜΕΜ培养液吹打终止消化，以1: 2或1:4的比例传代培养48h，制成细胞悬液；
[0012]6)取细胞悬液移入离心管中，4-8°C，lOOOrpm，10?30min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。
[0013]步骤I)中，切取所述的人体腹部皮肤大小为2-3cm2，PBS反复漂洗3-6次，剪弃脂肪和结缔组织。
[0014]步骤3)中，离心步骤为，37 °C、180rpm离心20min，血清终止后，100rpm离心1min
收集细胞。
[0015]步骤3)中，DMEM洗脱2次后，用含有15%人自体血清的α-ΜΕΜ培养液调定细胞密度，以每毫升2-4 X 15细胞接种，37°C，5 %CO2，90%适度条件下开放培育。
[0016]步骤4)中，用无钙镁离子的PBS漂洗I次，PBS消化液消化2-3min。
[0017]步骤4)中，传代培养为:置于37°C，5%CO2，90 %适度条件下开放培养。
[0018]本发明的有益效果:本发明利用胶原酶、透明质酸酶的强消化能力，且低温条件下长时间消化对细胞损伤力小等特点，实现了多种酶联合消化提取皮肤成纤维细胞；
[0019]本发明方法只需2-3cm2的小面积皮肤即可获得较多的原代细胞，通过传代得到高纯度的成纤维细胞，细胞经过扩增大量繁殖，在短时间内(4周左右)可达到18级，从而提供了充足、可靠的成纤维细胞满足提取。
【具体实施方式】
[0020]下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021]实施例1
[0022]皮肤成纤维细胞提取制备方法，首先手术切取3cm2人体腹部皮肤，置于含有IlOU/ml氨苄青霉素和110mg/ml硫酸链霉素的PBS中，反复3次经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；
[0023]将皮肤剪成1.21111113左右的小块，加入含有胶原酶2001]/1111、透明质酸酶3001]/1111的DMEM中，4 0C条件下放置过夜(12h);
[0024]按1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS消化液，37°C、180rpm离心20min，血清终止;再在100rpm离心条件下1min收集细胞；用DMEM洗脱2次后，用含有15%人自体血清的α-ΜΕΜ培养液调定细胞密度，以每毫升4 X 15细胞接种，37°C，5 %CO2，90 %适度条件下开放培育48h;
[0025]当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗I次，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液消化3min;加入含有15 %人自体血清的α-ΜΕΜ培养液吹打终止消化，以1: 2的比例传代，置于37 °C，5 %⑶2，90 %适度条件下开放培养48h制成细胞悬液；
[0026]取细胞悬液移入离心管中，8°C，1000rpm，30min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。
[0027]实施例2
[0028]皮肤成纤维细胞提取制备方法，首先手术切取2cm2人体腹部皮肤，置于含有10U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中，反复5次经过PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织；
[0029]将皮肤剪成0.81111113左右的小块，加入含有胶原酶2001]/1111、透明质酸酶3001]/1111的DMEM中，放置40C过夜；1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 %EDTA的PBS消化液，37 °C、180rpm空气摇床20min，血清终止；100rpm离心1min收集细胞;DMEM洗脱2次后，用含有15 %人自体血清的α-ΜΕΜ培养液调定细胞密度，以每毫升2 X 15细胞接种，37°C，5 %CO2，90 %适度条件下开放培育48h;
[0030]当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗I次，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液消化2-3min ；加入含有15 %人自体血清的α-ΜΕΜ培养液吹打终止消化，以1:4的比例传代，置于37 °C，5 % C02，90 %适度条件下开放培养48h制成细胞悬液;取细胞悬液移入离心管中，4°C，lOOOrpm，1min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。
[0031]本发明利用胶原酶、透明质酸酶的强消化能力，且低温条件下长时间消化对细胞损伤力小等特点，实现了多种酶联合消化提取皮肤成纤维细胞;本发明方法只需2-3cm2的小面积皮肤即可获得较多的原代细胞，通过传代得到高纯度的成纤维细胞，细胞经过扩增大量繁殖，在短时间内(4周左右)可达到18级，从而提供了充足、可靠的成纤维细胞满足提取。
[0032]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0033]以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的【具体实施方式】。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
【主权项】
1.一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，该方法包括下述提取步骤: 1)切取人体腹部皮肤，置于含有?οου/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中漂洗； 2)将漂洗后皮肤剪成0.8-1.2mm3的小块，加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中，4°C条件下放置过夜； 3)按1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 % EDTA的PBS消化液，离心收集细胞，用DMEM洗脱后开放培育48h; 4)待培育的细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的PBS消化液消化； 5)加入含有15%人自体血清的α-ΜΕΜ培养液吹打终止消化，以1:2或1:4的比例传代培养48h，制成细胞悬液； 6)取细胞悬液移入离心管中，4-8°C，lOOOrpm，10?30min条件下离心，提取皮肤成纤维细胞。2.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，步骤I)中，切取所述的人体腹部皮肤大小为2-3cm2，PBS反复漂洗3-6次，剪弃脂肪和结缔组织。3.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，步骤3)中，离心步骤为，37 °C、180rpm离心20min，血清终止后，100rpm离心1min收集细胞。4.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，步骤3)中，DMEM洗脱2次后，用含有15 %人自体血清的α-ΜΕΜ培养液调定细胞密度，以每毫升2_4 X 15细胞接种，37°C，5%CO2，90 %适度条件下开放培育。5.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，步骤4)中，用无钙镁离子的PBS漂洗I次，PBS消化液消化2-3min。6.根据权利要求1所述的一种皮肤成纤维细胞提取制备方法，其特征在于，步骤4)中，传代培养为:置于37 °C，5 % CO2，90 %适度条件下开放培养。
【文档编号】C12N5/071GK105969719SQ201610570570
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】张正亮
【申请人】安徽惠恩生物科技股份有限公司