一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇产量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌中1,2,4?丁三醇产量的方法，属于遗传工程领域。本发明是以重组大肠杆菌E.coli(pEtac?mdlC?tac?xdh)作为出发菌株，通过共表达分子伴侣蛋白，辅助1,2,4?丁三醇合成途径中关键酶的折叠，增强关键酶活性，从而提高1,2,4?丁三醇产量的方法。最后优选分子伴侣Trigger factor，使重组大肠杆菌1,2,4?丁三醇产量提高了1.4倍。
【专利说明】
一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌1 ,2,4-丁三醇产 量白勺方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种共表达分子伴侣蛋白提高重组大肠杆菌中1，2,4_ 丁三醇的方法， 属于遗传工程领域。 技术背景
[0002] 1，2,4_ 丁三醇是一种四碳多元醇，无色，无臭，无味，性质与甘油类似，主要应用于 军工、医药、化妆品、化工等领域。目前，1，2,4_丁三醇主要通过化学法生产，但化学法存在 着反应条件严苛，所用催化剂昂贵，易造成环境污染、副产物较多，不利于分离纯化的弊端， 故近年来，研究的焦点逐渐转向生物合成法。
[0003] 迄今为止，尚未在生物体内发现1，2，4-丁三醇，故生物法合成丁三醇是通过引进 外源蛋白，构建合成路径。目前已在大肠杆菌中构建成功且研究较多的合成途径为:从木糖 出发，在木糖脱氢酶作用下，生成木糖酸，木糖酸经木糖酸脱水酶，苯甲酰甲酸脱羧酶及醇 脱氢酶的作用，生成1，2,4_ 丁三醇。但该方法产量仍未达到工业生产的要求，主要是由于关 键代谢酶催化活性低下。因此，提高关键代谢酶活性是提高1，2，4-丁三醇产量的关键。
[0004] 分子伴侣蛋白（chaperone)是一类蛋白，他们可以介导蛋白质的正确装配，但并不 作为蛋白的组成部分。目前常见于大肠杆菌中的分子伴侣蛋白有三种:G r〇ES-Gr〇EL、DnaK-DnaJ-GrpE和Trigger factor。其中，GroEL属于Hsp60伴侣家族，GroES为其辅助分子伴侣， 两者在ATP的共同作用下可以与未折叠或部分折叠的多肽结合，释放未折叠的多肽进入折 叠池，以及对折叠好的蛋白进行结构重排。DnaK、DnaJ均属于Hsp70家族，主要功能包括辅助 体内蛋白质折叠以及跨膜转运、降解以及调节异常蛋白质。GrpE作为二者的辅助因子，可以 辅助正确折叠蛋白的释放。Trigger factor是一个三亚基蛋白，可以与新生肽链结合，辅助 蛋白折叠。另外，不同的伴侣蛋白间也存在协同作用。在大肠杆菌中共表达分子伴侣蛋白可 以辅助外源蛋白的折叠，提高目的蛋白酶活水平，如trigger factor的引入促进小鼠内皮 抑制素、人体氧调节蛋白的溶解程度。在本研究中，引入分子伴侣蛋白，可能提高代谢酶活 性，从而提升1，2，4-丁三醇产量。
【发明内容】
[0005] 本发明首先提供五种共表达分子伴侣蛋白的重组大肠杆菌，是以E.c〇li(pEtac-mdlC-tac-xdh)为出发菌株，分别转入含有分子伴侣蛋白基因的质粒pG-KJE8、pGr 〇7、 pTf!6、pKJE7、pG_Tf2,构建而成的重组大肠杆菌 Ε· coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_KJE8， E·coli(pEtac-mdlC-tac_xdh)/pGro7，E·coli(pEtac-mdlC-tac_xdh)/pTfl6，E·coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pKJE7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_Tf2〇
[0006] 其中，所述E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)，是以E.coli W3100为宿主，以启动子 Ptac调控Xdh、MdlC表达，具体构建方法参见文献(孙文龙，陆信曜，宗红，等.代谢工程改造 大肠杆菌合成D-1，2，4-丁三醇[J].微生物学通报，2014，41 (10))。
[0007] 本发明所述质粒PG-KJE8、pGr〇7、ρΤΠ 6、pKJE7、pG-Tf 2含有不同分子伴侣蛋白基 因，其中，PG-KJE8 含有 DnaK-DnaJ-GrpE 及 GroES-GroEL 编码基因，pG-Tf2 携带 Trigger factor及GroES-GroEL，而质粒pGro7、pTf 16、pKJE7则分别带有GroES-GroEL、Trigger factor、DnaK_DnaJ-GrpE 蛋白。
[0008] 所述DnaK编码基因如NCBI-Gene ID:944750所示，DnaJ编码基因如NCBI-Gene ID: 944753所示，GrpE基因如NCBI-Gene ID:947097所示。所述GroES编码基因如NCBI-Gene ID: 948655所示，GroEL编码基因如NCBI-Gene ID:948665所示，tig基因如NCBI-Gene ID: 945081 所示。
[0009] 分子伴侣蛋白氨基酸序列如下：
[0022] 本发明还提供了应用所述重组大肠杆菌发酵生产1，2,4-丁三醇的方法，将37°C、 200rpm下培养12h的重组大肠杆菌以1%的接种量转入发酵培养基，同时根据需要加入2mg/ mL阿拉伯糖，10ng/mL四环素，0.5mmol/L IPTG，在37°C、200rpm下培养50h。
[0023] 重组大肠杆菌种子培养及发酵：
[0024]种子培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10。
[0025]发酵培养基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10,木糖20。
[0026] 培养条件:将37°C、200rpm下培养12h的种子以1%的接种量转入发酵培养基，于37 °C、200rpm条件下培养50h。
[0027] 本发明是以重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)作为出发菌株，通过共表 达分子伴侣蛋白提高关键代谢酶的折叠效率，进而提高关键酶催化活性，从而提高1，2,4_ 丁三醇的产量。在摇瓶发酵过程中，含有质粒ΡΤΠ 6的重组大肠杆菌1，2,4_丁三醇产量达到 1.0 lg/L，提高1.4倍。本发明为进一步代谢工程改造大肠杆菌生产1，2，4-丁三醇奠定了基 础。本发明提供的重组大肠杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0028] 实例 1
[0029] 将E · coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)菌体培养到0D6Q()等于0 · 4-0 · 6时，从摇床取出，冰 浴30min后离心。用O.lmol/L的CaCl2洗涤菌体，培养lh后涂布相应抗性平板，待其长出后挑 取正确转化子，得到含有相应质粒的重组大肠杆菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-χdh)/pG-KJE8,E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pGro7,E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pTf16,E.coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pKJE7，Ε·coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_Tf2〇
[0030] 实例2
[0031] 从平板上挑取不同重组菌的单菌落，过夜培养后作为种子液，以1%的接种量接种 于45mL LB中，同时加入2mg/ml阿拉伯糖或10ng/ml四环素诱导分子伴侣蛋白表达。待培养 至0D6q() = 0 · 6时加入IPTG和木糖母液，至IPTG、木糖终浓度分别为0 · 5mmol/L和20g/L，在37 °C、200rpm下培养50h，取发酵上清液进行高效液相色谱检测。
[0032] 实例3
[0033]首先将发酵液12 OOOrpm离心除去细胞，上清液用0.22μπι混合纤维素酯微孔膜过 滤即可用于HPLC检测。检测条件：Agilent 1260，RID检测器，色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87 column(300mmX7.8mm)，柱温60°C，流动相为5mmol/L H2SO4,流速0.6mL/min。结果 如表 1所示，其中E · coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pTf 16的1，2，4-丁 三醇产量达到 1 · Olg/1。 [0034]表1含有不同分子伴侣蛋白的重组大肠杆菌的1，2,4_ 丁三醇产量
[0036]虽然本发明已以较佳实例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术 的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围 应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种高产1，2,4-丁三醇的重组大肠杆菌，其特征在于，以重组大肠杆菌E.coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)为出发菌株，导入含有分子伴侣蛋白的质粒pG-KJE8、pGro7、pTf 16、 pKJE7和pG-Tf2。2. 根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以重组大肠杆菌E. coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)，是以E.coli W3100为宿主，以启动子Ptac调控Xdh、MdlC表达。3. 应用权利要求1或2所述重组大肠发酵生产1，2，4-丁三醇的方法，其特征在于，将37 °C、200rpm条件下培养12h的重组大肠杆菌以1%的接种量转入发酵培养基，同时根据需要 加入2mg/mL阿拉伯糖，10ng/mL四环素，0.5mmol/L IPTG，在37°C、200rpm下培养50h。4. 应用权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有:蛋白胨10g/L、酵母 粉5g/L、氯化钠1 Og/L、木糖20g/L。
【文档编号】C12R1/19GK105969712SQ201610316953
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】诸葛斌, 何姝颖, 陆信曜, 宗红, 陈雯
【申请人】江南大学