一种地衣芽孢杆菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。具体地说，本发明提供了一种能够发酵生产香料乙偶姻的地衣芽孢杆菌，并利用这种微生物发酵烟草工业废弃物生产香料乙偶姻的方法。该地衣芽孢杆菌（Bacillcus licheniformis）T8，是从卷烟厂周围土壤中通过选择性培养基分离得到的，已于2016年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 12732。该菌株能够以烟草发酵废弃物为原料合成香料乙偶姻，该乙偶姻可直接用于烟草增香或经纯化后作为食品添加剂。CGMCC No.1273220160701
【专利说明】
一种地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用，特别涉及一株筛选获得的地衣芽孢杆菌及利用该菌株发酵烟草废弃物生产香料乙偶姻的方法。【背景技术】
[0002]乙偶姻(3-羟基-2-丁酮，又名3-羟基丁酮或甲基乙酰甲醇，)作为一种具有特殊奶油香气的食用香料，广泛应用于食品、烟草、酒类和化妆品行业。烟草工业废弃物主要为烟梗和烟肩，具有较高的尼古丁含量，随意堆放处理会对环境造成污染。利用微生物处理发酵生产生物基化学品，可以提高烟叶资源的利用率，有研究开发价值，更同时可以降低尼古丁，减少烟草工业产生的大量的废弃物对生态环境的污染。因此，其开发应用将具有巨大的发展潜力和应用前景。
[0003]根据目前研究结果，乙偶姻是香烟香气的一种重要成分，而香烟的香气主要由微生物发酵产生。但是，目前的乙偶姻生物发酵主要利用葡萄糖为碳源，尚未发现以烟草废弃物为原料发酵合成乙偶姻的报道。本发明以获得以烟草废弃物为原料发酵合成乙偶姻的菌株为出发点，旨在建立一种烟草有毒废弃物高值化利用的新途径。
【发明内容】
[0004]本发明针对目前烟草工业废弃物利用率低，尽管烟草发酵中能够产生乙偶姻但缺乏菌株的现状，筛选获得一株能够利用烟草废弃物转化合成乙偶姻的菌株地衣芽孢杆菌 (feciicus 2i/3cAe/3i/o_rais)，利用该地衣芽孢杆菌能够在以烟草加工废弃物烟梗作为主要营养源的培养基中生长，并能够产生乙偶姻。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:一种地衣芽抱杆菌(你(^_/_/(^5_/_/〇/?6/^/>〇17^‘5)18，已于2016年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.12732。[〇〇〇6] 本发明还提供地衣芽孢杆菌(ifeciDcus _/icAe/3i/b_rais)T8在生产乙偶姻中的应用。
[0007] 利用地衣芽孢杆菌(5a ci D cus 2 i cA e/3 ii s) T8生产乙偶姻中的方法，包括如下步骤:步骤(1 )，将地衣芽孢杆菌按照1~5%的接种量接种至灭过菌的LB培养基中培养，培养至 0D600为0.8?1.2;所述的LB培养基的组分为:蛋白胨8?12 g/L，酵母粉4?6 g/L，氯化钠1?4 g/L，pH7.0~7.5;步骤(2)，将步骤(1)培养得到的地衣芽孢杆菌按照3~5%的接种量接种至灭过菌的以烟草废弃物为碳源的培养基中，于摇床中，30~37°C培养24?36小时；所述的以烟草废弃物为碳源的培养基的组分为:胰蛋白胨卜3 g/L，牛肉膏卜3 g/L， 恥〇13~68/1，1%3〇47112〇,2~4 8/1，烟草废弃物3~1〇8/1，？11值7.0~7.4;所述的摇床的转速为100?140r/min;所述的烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目。
[0008]进一步，优选的是所述的LB培养基的灭菌条件是112°C灭菌25?35分钟。
[0009]进一步，优选的是所述的以烟草废弃物为碳源的培养基的灭菌条件是110?120°C 灭菌20~30分钟。
[0010]进一步，优选的是，将40?80 ml灭过菌的以烟草废弃物为碳源的培养基置于250 ml的三角瓶中，然后接种步骤(1)培养得到的地衣芽孢杆菌，之后于摇床中培养。
[0011]本发明涉及的以烟草加工废弃物为主要碳源生产乙偶姻的一一地衣芽孢杆菌 (5aciDcus JicAaoi/or/ffis)是从卷烟厂周围土壤中通过选择性培养基分离得到的。
[0012]本发明涉及地衣芽孢杆菌为革兰阳性杆菌，有芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大，在显微镜下观察菌体的大小为0.8 mi x( 1.5?3.5)mi。菌体细胞呈短杆状。在LB 固体培养基表面，菌体形成不透明的浅黄色小菌落，菌落有褶皱，边缘不整齐。上述菌株的经通用引物PCR获得16S rDNA序列与其它多株地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%的相似性但是不同。[〇〇13]其中，上述PCR的上游引物为fDl: 5’_agagtttgatcctggctcag_3’(SEQ ID N0.2);
[0014]本发明以烟草废弃物为碳源的培养基中复合氮源可以是牛肉膏和蛋白胨，但不局限于牛肉膏和蛋白胨。
[0015]本发明与现有技术相比，其有益效果为:1)本发明筛选获得地衣芽孢杆菌能够利用烟草废弃物为主要营养源。
[0016]2)该地衣芽孢杆菌能够发酵烟草废弃物生产乙偶姻。该乙偶姻可直接用于烟草增香或经纯化后作为食品添加剂。【附图说明】
[0017]图1本发明发酵获得乙偶姻的质谱图。
[0018]地衣芽抱杆菌(7?3(^_/_/(^5_/_/〇/?6/3_//>〇17?_/5)18，已于2016年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.12732,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。【具体实施方式】[〇〇19]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0020]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。[0021 ]本发明除非有特殊说明，否则百分数为质量百分数。[〇〇22]实施例1利用烟草加工废弃物生产乙偶姻微生物的筛选 1.培养基及培养条件:以烟草废弃物为碳源的培养基配方为:胰蛋白胨1?3 g/L，牛肉膏1?3 g/L，NaCl 3?6 g/L，MgS〇4 ? 7H20,2?4 g/L，烟草废弃物3?10 g/L，pH值7.0?7.4。最佳温度为30~37°(:，在250ml的三角瓶中的装液量为40?80ml。[〇〇23]所述的烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目，即过80目筛，取筛下物。
[0024] 上述菌种的培养的培养时间为24?36小时。[〇〇25]上述培养基的灭菌条件为112°C灭菌30分钟。
[0026]上述培养基中添加质量百分含量为0.1%的肌酸作为筛选指示剂。
[0027]上述培养基中添加质量百分含量为1%?1.5%的琼脂制备成固体培养基用于菌株筛选。[〇〇28]2.筛选方法:取烟厂、烟区周围土样按照lg样品5 ml水溶解，将水样置于室温24小时活化然后用无菌吸管从此试管中吸取1 ml加入另一盛有9 ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成 10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6 不同稀释度的土壤。[〇〇29]取不同浓度的稀释土壤菌液涂布到步骤1中所述的固体培养基培养皿上，培养36 小时后挑取显色单菌落利用步骤1中所述的以烟草废弃物为碳源的培养基于37°C，120转/ min进行培养12-24h，经筛选共获得菌株36株，经过液体培养复筛，复筛时采用步骤1中所述的以烟草废弃物为碳源的培养基于37°C，120转/min进行培养12-24h，取复筛培养得到的发酵液稀释5-10倍，得到稀释后的发酵液。
[0030] 将lmL质量浓度为10%的NaOH、lmL质量浓度为0.5%的肌酸、lmL质量浓度为5%的1-萘酚和7mL去离子水混合均匀后，向其中加入25此稀释后的发酵液，之后于30°C震荡反应 30 min，测定其0D520值，每次实验均以不同浓度的乙偶姻标准样品绘制标准曲线，通过标准曲线测定乙偶姻的含量。经过筛选获得最优菌种T8。[〇〇31]实施例2筛选微生物的菌种鉴定 1.培养基及材料LB培养基含有如下成分:酵母粉4?6 g/L，蛋白胨8?12 g/L，氯化钠1?4 g/L，pH 7.0? 7.5，112°C灭菌25?35分钟。[〇〇32] LA培养基:LB培养基中添加40?100yg/mL氨苄青霉素。
[0033]LB固体培养基:在上述LB培养基中添加质量百分数为1.5%的琼脂。
[0034]TAE: 50倍的TEA缓冲液含有2M tris-acetate, 0.05M EDTA，pH 8.3。
[0035]琼脂糖电泳凝胶:1倍TAE电泳缓冲液，添加质量百分含量为0.8?1.2%的琼脂糖凝胶。
[0036]2.16S rDNA测定将12-1菌体培养于LB培养基中，12?24小时后，离心，提取基因组DNA，然后用浓度为质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行DNA的电泳检测。经检测含基因组DNA的样品进行PCR基因扩增。
[0037]PCR的上游引物为fDl: 5’-agagtttgatcctggctcag-3’(SEQ ID N0.2);[〇〇38] PCR的反应体系为:模板DNA添加0.5 yl调节到合适浓度，引物浓度为0.4 yM，dNTP 浓度为0.2 mM，DNA聚合酶大约2.5 U，加ddH20至反应总体积50 yl。[〇〇39] PCR的反应条件为:94°C变性30秒，55°C度退火30秒，72°C延伸1分钟，共30个循环。
[0040]PCR产物约为1.5 kb左右，经质量百分含量为1%的琼脂糖凝胶电泳，利用质量百分含量在0.01%的溴化乙锭进行染色，紫外分析仪下观察，在1.5kb左右有亮色条带的产物，连接到PMD18-T转化大肠杆菌，转化的DH5a菌株涂布在LA培养基上(Luria-Bertani培养基添加50 mg/L氨苄青霉素)，于37°C静止培养后，提取质粒利用和酶切后，利用质量百分含量为1%琼脂糖凝胶进行电泳验证，将含有目的条带的质粒进行测序，测序结果如SEQ ID N0.1所示。[〇〇41 ]将本发明的菌株的16S rDNA序列与GenBank中已公布的16S rDNA序列进行同源比对，该16S rDNA序列与其它多株地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列相似但不完全相同。该菌为革兰阳性杆菌，杆菌，有芽孢，产生近中生的椭圆状芽孢，孢囊稍膨大，在显微镜下观察菌体的大小为0.8 mi x(l.5?3.5)mi。菌体细胞呈短杆状。在LB固体培养基表面，菌体形成不透明的浅黄色小菌落，菌落有褶皱，边缘不整齐。上述菌株的经通用引物PCR获得16S rDNA序列与其它多株地衣芽孢杆菌的16S rDNA序列有99%的相似性但是不同。初步鉴定改菌种为地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)，该菌株保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为:CGMCC N0.12732。[〇〇42]实施例3利用烟草工业废弃物生产乙偶姻以烟草废弃物为碳源的培养基的组分为:胰蛋白胨2 g/L，牛肉膏2 g/L，NaCl 4 g/L， 1%5〇47出0,6 8/1，烟草废弃物7 8/1，？11值7.2;烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目。 [〇〇43]LB培养基的组分为:蛋白胨10g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠3g/L，pH7.3;LB培养基的灭菌条件是112 °C灭菌30分钟。
[0044]以烟草废弃物为碳源的培养基的灭菌条件是115°C灭菌25分钟。
[0045]LB培养基和以烟草废弃物为碳源的培养基均需灭菌后才能使用。[〇〇46]用接种环划取菌株接种于含有2 ml的LB培养基的试管中，120转/min培养12小时， 对地衣芽抱杆菌(ife_/icAe/3i/or?is)T8进行活化；取以烟草废弃物为碳源的培养基，按照3%的接种量接种活化后的地衣芽孢杆菌 (feciDcus 2icAe/3i/o_?is)T8,接种于装有2ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为 0D600 1.0时，按照4%的接种量接种于装有50 ml以烟草废弃物为碳源的培养基的250 ml的摇瓶中，于120 r/min的摇床中，37°C培养。培养36小时后利用肌酸和a萘酚进行显色并测定乙偶姻的产量为5.6 g/L。[OO47]乙偶姻的定性检测:取上述发酵液经12000 r/min离心10min，0.22iim膜过滤后，利用GC-MS进行定性检测。采用Agilent HP-1NN0Wax毛细管色谱柱(30 mX0.32 mm，0.25 y m.)，升温程序为50°C维持2分钟，然后10°C/分钟程序升温至240°C，240°C维持3分钟。获得结果质谱图如图1所示，经与标准库比对为乙偶姻。[〇〇48]实施例4利用烟草工业废弃物生产乙偶姻以烟草废弃物为碳源的培养基的组分为:胰蛋白胨1 g/L，牛肉膏1 g/L，NaCl 3g/L， MgS〇47H20，2g/L，烟草废弃物3 g/L，pH值7.0;烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目；LB培养基的组分为:蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，氯化钠1 g/L，pH7.0;LB培养基的灭菌条件是112 °C灭菌25分钟。[0049 ]以烟草废弃物为碳源的培养基的灭菌条件是110 °C灭菌20分钟。
[0050]LB培养基和以烟草废弃物为碳源的培养基均需灭菌后才能使用。
[0051]用接种环划取菌株接种于含有2 ml的LB培养基的试管中，100转/min培养12小时， 对地衣芽抱杆菌(ife_/icAe/3i/or?is)T8进行活化；取以烟草废弃物为碳源的培养基，按照1%的接种量接种活化后的地衣芽孢杆菌 (feciDcus 2icAe/3i/o_?is)T8,接种于装有2ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为 0D600 0.8时，按照3%的接种量接种于装有40 ml以烟草废弃物为碳源的培养基的250 ml的摇瓶中，于100 r/min的摇床中，30°C培养。培养34小时后利用肌酸和a萘酚进行显色并测定乙偶姻的产量为5.5 g/L.实施例5利用烟草工业废弃物生产乙偶姻以烟草废弃物为碳源的培养基的组分为:胰蛋白胨3 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 6 g/L， 1%5〇47出0,4 8/1，烟草废弃物1〇8/1，？11值7.4;烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目； LB培养基的组分为:蛋白胨12 g/L，酵母粉6 g/L，氯化钠4 g/L，pH7.0?7.5;LB培养基的灭菌条件是112 °C灭菌35分钟。[〇〇52]以烟草废弃物为碳源的培养基的灭菌条件是120°C灭菌30分钟。[〇〇53] LB培养基和以烟草废弃物为碳源的培养基均需灭菌后才能使用。[〇〇54]用接种环划取菌株接种于含有2 ml的LB培养基的试管中，140转/min培养12小时， 对地衣芽抱杆菌(ife_/icAe/3i/or?is)T8进行活化；取以烟草废弃物为碳源的培养基，按照5%的接种量接种活化后的地衣芽孢杆菌 (feciDcus 2icAe/3i/o_?is)T8,接种于装有2ml LB培养基的试管中，生长到菌体密度为 0D600 1.2时，按照5%的接种量接种于装有80 ml以烟草废弃物为碳源的培养基的250 ml的摇瓶中，于140 r/min的摇床中，35°C培养。培养30小时后利用肌酸和a萘酚进行显色并测定乙偶姻的产量为5.56g/L。
[0055]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
[0056]序列表 SEQ ID N0.1agctatacat gcagtcgagcggaccgacgggagcttgctcccttaggtcagcggcggacg60ggtgagtaac acgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggct120aataccggat gcttgattgaaccgcatggttcaatcataaaaggtggcttttagctacca180cttgcagatg gacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgac240gatgcgtagc cgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagact300cctacgggag gcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgc360cgcgtgagtg atgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacc420gttcgaatag ggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgcc480agcagccgcg gtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcg540cgcaggcggt ttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcactgg600aaactgggga acttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgc660gtagagatgt ggaggaacaccagtggcgtaggcgactctctggtctgtaactgacgctga720ggcgcgaaag cgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacga780tgagtgctaa gtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcact840ccgcctgggg agtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaa900gcggtggagc atgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatc960ctctgacaac cctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatgg1020ttgtcgtcag ctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttga1080tcttagttgc cagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggagga1140aggtggggat gacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaa1200tgggcagaac aaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctca1260gttcggatcg cagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatc1320agcatgccgc ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagag1380tttgtaacac ccgaagtcggtgaggtaaccttttgagccagccgccgaacgggac1435SEQ ID N0.2agagtttgat cctggctcag20SEQ ID N0.3cggctacctt gttacgactt20 〇
【主权项】
1.一种地衣芽抱杆菌_/icAe/3i/b_?is)T8，已于2016年7月1日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.12732。2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)T8在生产乙偶姻中的 应用。3.根据权利要求2所述的地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)T8在生产乙偶姻 中的应用，其特征在于，包括如下步骤:步骤(1)，将地衣芽孢杆菌按照1~5%的接种量接种至灭过菌的LB培养基中培养，培养至 0D600为0.8?1.2;所述的LB培养基的组分为:蛋白胨8?12 g/L，酵母粉4?6 g/L，氯化钠1?4 g/L，pH7.0~7.5;步骤(2)，将步骤(1)培养得到的地衣芽孢杆菌按照3~5%的接种量接种至灭过菌的以烟 草废弃物为碳源的培养基中，于摇床中，30~37°C培养24?36小时；所述的以烟草废弃物为碳源的培养基的组分为:胰蛋白胨1?3 g/L，牛肉膏1?3 g/L， 恥〇13~68/1，]\%3〇4.71120,2~4 8/1，烟草废弃物3~1〇8/1，？11值7.0~7.4;所述的摇床的转速为100?140r/min;所述的烟草废弃物为烟梗粉碎物的粒径为-80目。4.根据权利要求3所述的地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)T8在生产乙偶姻 中的应用，其特征在于，所述的LB培养基的灭菌条件是112°C灭菌25?35分钟。5.根据权利要求3所述的地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)T8在生产乙偶姻 中的应用，其特征在于，所述的以烟草废弃物为碳源的培养基的灭菌条件是110?120°C灭菌 20?30分钟。6.根据权利要求3所述的地衣芽孢杆菌(feciDcus 2icAe/3i/o_rais)T8在生产乙偶姻 中的应用，其特征在于，将40?80 ml灭过菌的以烟草废弃物为碳源的培养基置于250 ml的 三角瓶中，然后接种步骤(1)培养得到的地衣芽孢杆菌，之后于摇床中培养。
【文档编号】C12R1/10GK105969703SQ201610598365
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】向海英, 吴丽君, 端凯, 刘晶, 白晓莉, 谢志强, 王毅, 周桂园
【申请人】云南中烟工业有限责任公司