一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌及 其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，FA)是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，是多种植 物中的一种酚酸。具有镇静、抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、降血脂等独特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交联的形式存在，人和动物不能直接吸收这类阿魏酸， 必须依靠微生物产生酯酶将阿魏酸游离出来。另一方面，在植物细胞壁中，阿魏酸或二聚体 阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，增强阿拉伯木聚糖链的 强度。但从空间上限制了动物和微生物对植物细胞壁中纤维素和半纤维素的有效降解。
[0003] 阿魏酸酯酶（EC 3. I. 1. 73, feruloyl esterase)又称肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯键，将阿魏酸释放出来。它能与其他水解酶如木聚糖 酶、纤维素酶和木质素酶相互联合作用，较为彻底地降解细胞壁中的多糖和木质素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及能源开发等诸多领域都有着巨大的 应用潜能。
[0004] 自首次在链霉菌中发现阿魏酸酯酶以来，至今已分离纯化近30种阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少数是来自于细菌，例如嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌等，而且 它们的阿魏酸酯酶的酶学特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生长、酶产量以 及真菌对生长条件的种种限制都制约着酶法制备阿魏酸的工业化生产。故寻求以细菌为发 酵菌株生产阿魏酸酯酶具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种产阿魏酸酯酶的地衣芽孢杆菌 及其应用，该菌株不仅对碳源和氮源要求较低、发酵时间短、菌株安全无毒，可以在食品饲 料工业中使用；而且遗传稳定性好，操作简单，连续传代10代以上，阿魏酸酯酶的合成能力 基本不变。
[0006] 一种产阿魏酸醋酶的地衣芽抱杆菌（Bacillus licheniformis)DBM12,已于2014 年1月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC(地址为：中国北 京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号：CGMCC No. 8672。
[0007] 本发明所述的地衣芽孢杆菌DBM12的筛选方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤1，土样采集及处理
[0009] 土样采自江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵中的家畜粪便堆肥。采集的土 样置密封的无菌塑料袋中于室温保存，并在1周内进行目的菌株的分离。
[0010] 取5-10g 土样放入装有20-40mL无菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上， 120-160r/min旋转震荡20-30min，然后将三角瓶置于70-80°C水浴加热15-30min，期间每 隔5min中震荡一次。
[0011] 步骤2,富集培养
[0012] 取l_2mL热处理后的土样于装有30-50mL富集培养基一的三角瓶中，在160-1801·/ min转速50-60°C下震荡培养20-24h。然后取l-2mL培养液接种到装有50mL浓度5-10% 的富集培养基二中，继续在160_180r/min转速50-60°C下震荡培养18-20h。
[0013] 富集培养基一：酵母提取物 0· 5g，KH2PO4 0· lg，NH4NO3 0· lg，NaCl 0· lg， MgSO4 · 7H20 0. 25g，微量元素 lmL，阿魏酸乙醋lg，去离子水100mL，调节pH4. 0。
[0014] 富集培养基二：ΝΗ4Ν030 · 5g，尿素 0· lg，KH2PO4O. lg，NaCl 0· lg，阿魏酸乙酯 lg，去 离子水100mL，调节ρΗ3· 0。
[0015] 微量元素 ：EDTA 5g，CaCl2 · 2H20 6g，FeSO4 · 7H20 6g，MnCl2 · 4H20 I. 15g， CoCl2 · 6H20 0· 8g，ZnSO4 · 7H20 0· 7g，CuCl2 · 2H20 0· 3g，H3BO3 0· 3g，（NH4)6Mo7O2 · 4H20 0. 25g，去离子水 1000mL。
[0016] 步骤3,初筛
[0017] 对第二次富集的培养液无菌水稀释，分别取稀释到10' 10' 10' 10' KT6的稀释 液150-250 μ L涂布于初筛培养基一上，待培养基表面的菌液完全干后，培养皿以封口膜封 口，将培养皿置于40-45°C培养箱中培养24-48h，然后将培养皿置于10-20°C培养箱中继续 培养6-12h。
[0018] 挑取不同形态的单菌落点接到初筛培养基二上，45-60°C恒温培养24-48h。挑选出 在初筛培养基二上生长较好以及透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株，划线接种于纯化 培养基，于45-50°C培养l-2d。然后挑取其中的单菌落再次划线分离，重复操作3次。如连 续多次在显微镜下观察到形态单一的菌体则认为菌株已纯化。最后将纯化的菌株接种于斜 面保藏培养基中4°C保存，接着进一步复筛。
[0019] 初筛培养基一：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0· lg，NaNO3 0.3g，K2HPO4 0· lg，KCl 0· 5g，MgSO4 · 7H20 0· 025g，FeSO4 · 7H20 0· 001g，琼脂 2· 5,去离子水 100mL，调节 ρΗ4· 5。
[0020] 初筛培养基二！KH2PO4 0· 2g，（NH4)2SO4O. 4g，MgSO4 · 7Η20 0· 03g，FeSO4 · 7Η20 0· 001g，MnSO4 (λ 001g，ZnCl2 (λ 001g，琼脂 2· 5g，去离子水 100mL，ρΗ4· 0。培养基 121°C、 15min灭菌后，冷却至60-70°C时，加入阿魏酸乙酯溶液lmL，充分摇匀后，平均倒至3个直径 90mm的培养皿中。
[0021] 阿魏酸乙酯溶液：0. 2g阿魏酸乙酯加到I. 5mL无菌离心管中，再加入500 yLN、 N-二甲基甲酰胺溶解，然后再加入500 μ L无菌水，充分摇匀。
[0022] 步骤4,复筛
[0023] 将初筛得到的菌株划线接种到活化固体培养基中，40-45 °C恒温培养箱培养 16-20h。将活化好的菌株再接种到装有30-50mL种子培养液的三角瓶中，以培养温度为 40-45°C，摇床转速160-200r/min频率下震荡恒温培养16-20h。按照4-10%的接种量接种 到复筛发酵培养基中，摇床震荡培养。发酵条件为：250mL三角瓶，装液量为30-60mL，摇床 震荡频率为160-200r/min，发酵温度40-50°C，发酵时间24-48h。发酵结束后，取发酵液以 6000-1000r/min转速离心5-10min，取上清液检测酶活性。
[0024] 复筛种子培养基：蛋白胨lg、牛肉膏0· 5g、酵母粉0· 5g、NaCl 0· 5g、K2HP04 0· 02g、 加去离子水至100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌15min。
[0025] 发酵培养基配方：可溶性淀粉0. 5g、蛋白胨lg、牛肉膏0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2PO4 0· lg、MgS04 · 7H20 0· 04g、去离子水 100mL，ρΗ4· 5,121°C，灭菌 15min。
[0026] 所述的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis)DBM12在发酵产阿魏酸醋酶并 制备阿魏酸中的应用，包括以下步骤：
[0027] 步骤1，将地衣芽孢杆菌DBM12菌株进行发酵，发酵周期2-3d，发酵温度35-40°C， 接种量4-10%，摇床转速160-2001·/!^!!;
[0028] 步骤2,将步骤1的发酵液8000r/min离心20min，上清用0. 22 μπι过滤，收集滤 液；
[0029] 步骤3,按硫酸铵饱和度为75%，向步骤2所得滤液中添加硫酸铵，4°C静置12h， 8000r/min离心20min，收集沉淀，用20mmol/L，pH6. 0磷酸缓冲溶液溶解，上样Sephedex G25分子筛凝胶柱脱盐，以pH6. 5的磷酸缓冲液进行洗脱，洗脱速率为15~20ml/h，得到粗 酶液；
[0030] 步骤4,将步骤3所得粗酶液加到麸皮粉中，再加水，调节pH6. 5,摇床上震荡频率 120r/min，50°C酶解12h，沸水灭酶，离心取上清，即为阿魏酸。
[0031] 作为上述发明的进一步改进，步骤1所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨2g、葡 萄糖0. 5g、过60目筛的麸皮粉2g、过60目筛谷糠粉lg、酵母提取物0. 5g、NaCl 0. 4g、 KH2PO4O. lg、MgSO4 0· 05g，蒸馏水 100mL，ρΗ7· 0-7. 5。