一株地衣芽孢杆菌及包含该菌株的饲料添加剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及功能微生物筛选技术领域，具体设及一株地衣芽抱杆菌及包含该菌株 的饲料添加剂。
【背景技术】
[0002] 随着水产品需求量的增加及水产品贸易的国际化发展，水产养殖业近年来发展突 飞猛进。但是，水产养殖的集约化和高密度规模日益扩大，养殖环境的恶化和疾病的危害给 水产养殖业带来了巨大的经济损失。传统防治疾病的方法主要是使用抗生素，抗生素使用 易产生耐药性菌株问题，并且存在水产动物体内残留的问题，因此寻找抗生素替代品成为 必然。
[0003] 益生菌能够参与动物体内微生物平衡，直接通过增强动物对肠内有害微生物群落 的抑制作用，或通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，进而间接起到促进动物生长的作 用，提高动物饲料的转化率。因此，近些年对于益生菌的筛选成为本领域内的研究热点，也 对水产饲料配方的改进具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一株新型地衣芽抱杆菌及包含该菌株的水产饲料添加剂。所 述地衣芽抱杆菌筛选自刺参养殖池，能够显著抑制病原菌，提高水产动物的免疫力和抗病 力，促进水产动物生长，可广泛应用于水产饲料领域。
[0005] 本发明一方面提供了一株地衣芽抱杆菌DN29度acilluslicheniformisDN29)， 已于2015年8月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号 为CCTCCN0:M2015482。
[0006] 本发明另一方面提供了包含上述地衣芽抱杆菌的饲料添加剂。
[0007] 所述复合制剂还包括多糖、维生素、中草药、酶和乳化剂。
[0008] 本发明还提供了上述地衣芽抱杆菌在水产养殖中的应用。
[0009] 本发明的有益效果：
[0010] 本发明筛选到的地衣芽抱杆菌DN29,能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原 菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的 利用率，促进动物生长。所述地衣芽抱杆菌DN29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过 程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可W有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的 抵抗能力。与对照组相比，添加地衣芽抱杆菌DN29的益生菌组中刺参稚参的特定生长率、 细胞密度、吞隧活性、呼吸爆发活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分别提高了 23. 5%、 58. 7%、70%、77. 4%、9. 7%和0. 9%，而累计死亡率下降了 32% ;添加包含地衣芽抱杆菌 DN29的复合型免疫增强剂的益生菌组中刺参幼参的特定生长率、细胞密度、吞隧活性、呼 吸爆发活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分别提高了 23.4%、17.4%、130%、26. 1%、 51. 8%和13. 8%，累计死亡率下降了 36. 1%，取得了显著的技术效果。
【具体实施方式】
[0011] 实施例1菌株的分离、筛选与鉴定 [001引 1、样品
[0013] 采集于青岛市胶南刺参养殖场养殖池底泥。
[0014] 2、抬养基：
[0015] 1)2216E海水培养基：蛋白陈5g，酵母浸出物Ig，憐酸铁O.Olg，海水1000ml， 抑7. 6-7. 8,配制固体培养基加入15-20g的琼脂，121°C灭菌20min。
[0016] 2)TSB培养基：膜蛋白腺大豆肉汤30g，氯化钢15g，蒸馈水1000ml，pH7. 4-7. 6,配 制固体培养基加入15-20g的琼脂，121°C灭菌20min。
[0017]扣MRS培养基：蛋白腺lOg，牛肉膏lOg，葡萄糖20g，酵母粉5g，吐溫-801ml， 憐酸二氨钟2g，巧樣酸二锭2g，乙酸钢5g，硫酸儀0. 58g，硫酸儘0. 15g，蒸馈水1000ml， P册.2-6. 4,加入15-20g的琼脂W配制固体培养基，115°C灭菌20min。
[001引 3、筛选方法
[0019] 取底泥样品，加入无菌生理盐水，振荡摇匀化(28°C，150巧m)，使底泥中细菌充分 散布于生理盐水中，10倍梯度稀释，分别接种于2216E、TSB和MRS固体培养基上，28°C培养 2地-4她。选取均匀清晰的单菌落，划线纯化细菌。单菌落依此命名为DN1、DN2、DN3……、 DN30。
[0020] W致病菌--灿烂弧菌（Vibriosplendidus)和假交替单胞菌 (Pseudoalteromonasnigrifaciens)为指示菌，采用平板括抗法筛选益生菌。在涂有指示 菌的平板上点种待筛选的细菌菌液，28°C恒溫培养，4化内观察点种区周围是否出现抑菌透 明区或覆盖区。最终，申请人筛选到10株病原括抗菌对上述两种致病菌均有不同程度的抑 制作用，具体结果如表1所示。
[0021] 表1潜在益生菌株抑菌情况
[0022]
[0023]
[0024]从表1的数据可W看出，本发明筛选到的10株病原接抗菌中菌株DN29对灿烂弧 菌和假交替单胞菌的抑菌能力最强。
[00巧]4、菌株鉴定
[0026] 1)菌落形态特征：将上述菌株DN29重新划线培养，其呈现为白色、不透明、菌落凸 起、边缘整齐，镜检显示其细胞为短杆状。
[0027]。提取上述菌株DN29的基因组DNA，利用PCR技术扩增leSrRNA序列，通过测序 BLAST比对分析，其与已公布的多株地衣芽抱杆菌的16SrRNA序列相似度高达99%，鉴定 证实菌株DN29为地衣芽抱杆菌度acilluslicheni化rmis)，与生化鉴定结果一致。
[0028] 3)将上述菌株DN29命名为地衣芽抱杆菌DN29度acilluslicheniformisDN29)， 已于2015年8月10日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中屯、，其保藏编号 为CCTCCN0:M2015482。
[0029] 实施例2 :地衣芽抱杆菌DN29对刺参稚参生长、免疫及抗病力的影响
[0030] 实验设对照组和益生菌组，每组分别设置Ξ个平行。每个平行刺参稚参40头（初 始体重0. 198 + 0. 008)。其中，对照组W鼠尾藻粉为基础饲料，益生菌组是在基础饲料中按 109CRJ/g添加上述地衣芽抱杆菌DN29,混合均匀投喂刺参稚参。养殖实验在室内海水系统 开展，共进行30天，每天投巧两次，每天换水50%，海水盐度28-3化pt，pH8. 0 + 0. 3,水溫 20-22 °C，溶氧充足。
[0031] 养殖实验结束后，对刺参稚参进行计数并称重，计算其特定生长率。每个平 行中随机取6头刺参稚参，自刺参腹腔抽取体腔液，1:1加入抗凝剂，取一部分抗凝体 腔液直接用于计数体腔细胞，测定吞隧活性、呼吸爆发活力；另一部分抗凝体腔液离屯、 lOmin(3000Xg，4°C)收集体腔细胞沉淀，继而超声破碎后，再次离屯、lOmin(3000Xg，4°C) 所得上清液为体腔细胞破碎上清液（CLS)，用于酪氧化酶（PO)活力和酸性憐酸酶（AC巧活 力的测定。W灿烂弧菌为病原菌，腹腔注射刺参，进行2周的观察，统计累积死亡率。
[0032] 表2地衣芽抱杆菌DN29对刺参幼苗生长、免疫及抗病力的影响
[0033]
[0034]
[0035] 注：不同的字母表示差异显著（P< 0. 05)。
[0036] 从表2的结果可W看出，与对照组相比，添加了地衣芽抱杆菌DN29的益生菌组中 刺参稚参的特定生长率、细胞密度、吞隧活性、呼吸爆发活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶 活性分别提高了 23. 5%、58. 7%、70%、77. 4%、9. 7%和0. 9%，而累计死亡率下降了 32%， 从而说明本发明所述地衣芽抱杆菌DN29对刺参稚参的生长有显著的促进作用，可W有效 提高刺参稚参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力，因此可W作为益生菌广泛应用于刺参稚 参的养殖生产过程中。
[0037] 实施例3 :包含地衣芽抱杆菌DN29的复合型免疫增强剂对刺参幼参生长的影响
[0038] 本实验设对照组和益生菌组，每组分别设置Ξ个平行，每个平行30头刺参幼参 (初始体重4. 928 + 0. 008)。W鼠尾藻粉、鱼粉、面粉等为基础原料，配制成含蛋白21. 5%， 含脂肪4. 5%的基础饲料。其中，对照组饲喂基础饲料，益生菌组是先在基础饲料中按 109C即/g添加地衣芽抱杆菌DN29,按1. 25g/kg和200mg/kg的比例分别添加葡聚糖和肤聚 糖，混合均匀后再进行饲喂。
[0039] 实验在循环水系统中进行，实验持续8周，每日按海参体重的2-3%投喂巧料，根 据摄食量情况随时对投巧量进行调整，每天早晚各投喂一次，并吸底排污一次。实验期间溶 氧> 6mg/l，溫度17 +rC，盐度28-30,P册.0 + 0. 3。实验在循环水系统中进行，实验持续 每日按海参体重的投喂巧料，
[0040] 养殖实验结束后，对刺参幼参进行计数并称重，计算特定生长率。从每个平行中 随机取6头刺参，自海参腹腔抽取体腔液，1:1加入抗凝剂，取一部分抗凝体腔液直接用于 计数体腔细胞，测定吞隧活性、呼吸爆发活力；另一部分抗凝体腔液离屯、l〇min(3000Xg， 4°C)收集体腔细胞沉淀，继而超声破碎后，再次离屯、lOmin(3000Xg，4°C)所得上清液为体 腔细胞破碎上清液（CLS)，用于酪氧化酶（P0)活力和酸性憐酸酶（AC巧活力的测定。W灿 烂弧菌为病原菌，腹腔注射刺参，进行2周的观察，统计累积死亡率。
[0041] 表3包含地衣芽抱杆菌DN29的复合型免疫增强剂对刺参生长、免疫及抗病力的影 响
[0042]
[0043] 注：不同的字母表示差异显著（P< 0. 05)。
[0044] 从上述实验结果可W看出，与对照组相比，添加本发明所述包含地衣芽抱杆菌 DN29的复合型免疫增强剂的益生菌组中刺参的特定生长率、细胞密度、吞隧活性、呼吸爆发 活力、酪氧化酶活力和酸性憐酸酶活性分别提高了 23. 4%、17. 4%、130%、26. 1 %、51. 8% 和13. 8%，累计死亡率下降了 36. 1%。从而说明本发明提供的复合型免疫增强剂能有效促 进刺参幼参的生长，提高幼参的抗病能力。
[0045] 综上，本发明提供的地衣芽抱杆菌DN29既能有效抑制病原菌，减少养殖动物病害 发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进养殖动物 生长，有助于提高养殖户的经济效益。同时，本发明提供的地衣芽抱杆菌DN29还可W与其 他物质，例如多糖类免疫增强剂、维生素类、中草药等进行复配，应用于鱼类、邮蟹等水产动 物的饲料中，能够使水产动物的主要免疫指标值提高5-10%，全周期存活率提高10-20%， 生长率提高10-15%，饲料系数降低5-10%，应用前景广阔。
【主权项】
1. 一株地衣芽孢杆菌，其保藏编号为CCTCCNO:M2015482。2. -种包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的饲料添加剂。3. 如权利要求2所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的饲料添加剂还包括多糖、维生 素、中草药、酶或乳化剂中的一种或多种的组合。4. 权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的应用。
【专利摘要】本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一株新型地衣芽孢杆菌DN29(Bacillus？licheniformis？DN29)，其保藏编号为CCTCC？NO：M2015482。本发明筛选到的地衣芽孢杆菌DN29，能有效抑制灿烂弧菌和假交替单胞菌等病原菌，减少养殖动物病害发生的几率，同时还能作为饲料添加剂，显著提高养殖动物对饲料的利用率，促进动物生长。所述地衣芽孢杆菌DN29可作为益生菌应用于刺参的养殖生产过程中，对刺参的生长具有显著的促进作用，还可以有效提高刺参的免疫力及对灿烂弧菌的抵抗能力。CCTCC NO:M201548220150810
【IPC分类】A23K10/18, A23K50/80, C12R1/10, C12N1/20
【公开号】CN105368750
【申请号】CN201510896838
【发明人】周怡, 于朝磊, 许宏伟, 苟万里, 陈琳
【申请人】青岛玛斯特生物技术有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月4日