专利名称：藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种成纤维细胞的培养，尤其涉及藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方 法。
背景技术：
藏羚羊(Pantholops hodgsoni)隶属于偶蹄目牛科山羊亚科藏羚属，青藏高原特 有物种，属国家一级保护动物和《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)中严禁进行贸 易活动的濒危动物，主要分布在中国境内的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒 草原和高寒草甸地区，平均生活在海拔4100 5500m之间恶劣的环境中。由于环境因素导 致深入研究藏羚羊存在着很大困难，目前关于藏羚羊的研究主要以宏观动物学研究为主， 包括动物行为、种群分布、个体生物学、系统发生学、寄生虫、疾病的诊断和治疗、羊绒的物 理和化学性质等。关于藏羚羊分子生物学和细胞生物学的研究较少。鉴于此，建立藏羚羊 细胞系以解决研究材料的问题十分必要。细胞培养技术是生命科学研究领域的重要研究技术。现代生物技术中无论是基因 治疗、干细胞、动物克隆都以细胞为载体进行。细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持 细胞生长的营养基质称为培养基。目前商品化的常用培养基包括MEM培养基系列、DMEM培 养基系列、RPMI-1640培养基系列、199培养基系列、水解乳蛋白细胞培养基、F10、F12细胞 培养基系列等。在众多培养基中，哪种培养基可以培养藏羚羊皮肤成纤维细胞以及建立藏 羚羊皮肤成纤维细胞系的具体方法没有详细报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种获得藏羚羊皮肤成纤维细胞、为开展藏羚 羊分子生物学和细胞生物学的相关研究提供研究材料的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建 方法。为解决上述问题，本发明所述的一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括 以下步骤(1)采样从雌性成年藏羚羊个体的耳部取1cm2皮肤组织，并将其放入装有贮存 液的离心管中；(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养将所述步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织 依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)浸洗、含有双抗的D/F12培养液冲洗后，将样 本组织块放入35mm培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培 养瓶中，均勻地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h 后翻转培养瓶，加入3 5mL D/F12培养液继续培养10 18天，得到生长至80% 90% 汇合的原代细胞；(3)传代与纯化将所述步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细 胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0.01%乙二胺四乙酸
4(EDTA)的混合液消化，得到消化液A ；然后将所述消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱 2 3min，取出，加入与消化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B ；将所述消化 液B经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物A ；用D/F12培养液将所述细胞沉淀物A传入另 一个培养瓶中，在37. 5°C、含5% C02的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3 6天，得 到生长至80% 90%汇合的皮肤成纤维细胞；(4)细胞冻存将所述步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白 酶和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混勻，先在4°C保 存半小时，然后在-70°C冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；(5)细胞复苏将所述步骤(4)所得的冻存皮肤成纤维细胞放入37°C水浴中融化， 吸出细胞悬液，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到 细胞沉淀物B ；用D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二 氧化碳培养箱中培养即可。所述步骤(1)中的贮存液为加入双抗的T20 ；所述加入双抗的T20是由占总溶液 体积的20%的胎牛血清(FBS)和80%的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液 组成，并在配置后加入双抗，然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶液。所述步骤(2)中的杜氏磷酸缓冲液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 0203g/100mL的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸钠、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的链霉素和0. lg/100mL的葡萄糖组成。所述步骤(2)、(3)和(5)中的D/F12培养液均是由占总培养液体积的10%的胎 牛血清(FBS)、90%的D/F12和双抗组成。所述步骤(3)中的磷酸盐缓冲液是由0. 8g/100mL的NaCl、0. 02g/100mL的KC1、 0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 组成。所述步骤(4)中的冻存液是由占总溶液体积的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二 甲基亚砜(DMS0)、70%的D/F12和双抗组成。所述步骤(2)、(3)和(5)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为37. 5°C、含 5% C02的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。所述双抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的链霉素。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明通过建立藏羚羊皮肤成纤维细胞的培养方法获得藏羚羊皮肤成纤维细 胞，为开展藏羚羊分子生物学和细胞生物学的相关研究提供了研究材料。2、本发明在进行组织块帖壁法原代培养时，通过预先对培养瓶底壁涂布血清和倒 置培养3h，有效地避免了组织块在培养液中脱离底壁浮起，有效地提高了组织块成活率。3、本发明采用了组织块帖壁法进行原代培养，与酶消化法相比，所获得的成纤维 细胞较好的保持了原有组织细胞的特性，而避免了酶消化对细胞表面蛋白质的破坏以及对 细胞特性的改变(参见图1)。4、本发明利用皮肤成纤维细胞对消化液较上皮细胞敏感的原理，控制合适的消化 时间便可使成纤维细胞脱壁，而上皮细胞因脱壁较慢仍贴在培养瓶壁上，因此，只需经过几 次传代就可以得到纯化的皮肤成纤维细胞(参见图2)。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明藏羚羊耳部皮肤组织经培养前消毒处理及剔除毛发处理后，采用组 织块贴壁培养法进行原代培养，经10天培养组织块周围有成纤维细胞游出，环绕于组织块 周围。图2为本发明原代培养的皮肤细胞经过2 3次传代以后得到的较纯的成纤维细 胞，成纤维细胞呈梭型。
具体实施例方式材料本实验所用耳部皮肤组织供体为患有严重脑包虫病的雌性成年藏羚羊个 体。藏羚羊为我课题组经国家林业局批准的人工驯养藏羚羊。试剂杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、 0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、 0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸钠、0. 0075g/100mL 的青霉素、 0. 005g/100mL的链霉素和0. lg/100mL的葡萄糖组成。贮存液为加入双抗的T20 ；所述加入双抗的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛 血清(FBS)和80%的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加 入双抗，然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶液。D/F12培养液均是由占总培养液体积的10%的胎牛血清(FBS)、90%的D/F12和双 抗组成。磷酸盐缓冲液(PBS)是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 组成。冻存液是由占总溶液体积的20%的胎牛血清(FBS)、10%的二甲基亚砜(DMS0)、 70%的D/F12和双抗组成。双抗是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的链霉素。一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤(1)采样取样时，先用灭菌的剪刀剪掉雌性成年藏羚羊个体的耳部毛发，再用剃 须刀片尽可能的剔除残留的发根。然后用香皂、蒸馏水、新洁尔灭、生理盐水、75%酒精、 D-PBS依次清洗，最后剪取1cm2皮肤组织，并将其放入已装有贮存液的50mL离心管中。(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养将步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织用含 有双抗的D-PBS浸洗5次，每次浸泡3min ；再用含有双抗的D/F12培养液冲洗3遍后，将样 本组织块放入35mm培养皿中，用剪刀尽量将组织块剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先 用胎牛血清涂布的培养瓶中，均勻地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶慢慢翻转，倒置放在 饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后轻轻翻转培养瓶，加入3 5mL D/F12培养液继续培养 10 18天，得到生长至80% 90%汇合的原代细胞。(3)传代与纯化将步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用无 Ca2+、Mg2+的PBS清洗2次，再用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶和0. 01 %乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，得到消化液A(消化液A以铺满培养瓶底为宜)；将消化液A放入饱和湿度 二氧化碳培养箱2 3min，取出，在显微镜下观察消化情况，轻轻敲打底部，然后加入与消 化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B ；将消化液B转移至离心管中以1000 转/分钟离心5min，去上清液后，得到细胞沉淀物A ；用D/F12培养液将细胞沉淀物A轻轻 混勻，传入另一个培养瓶中，在饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3 6天，得到生长至 80% 90%汇合的皮肤成纤维细胞，该皮肤成纤维细胞呈梭型(参见图2)。(4)细胞冻存将步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1 2mL含0. 05%胰蛋白酶 和0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混勻，先在4°C保存 半小时，然后将细胞冻存盒直接放入-70°C冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存 皮肤成纤维细胞。(5)细胞复苏将步骤(4)所得的装有冻存皮肤成纤维细胞的冻存管从液氮中取 出，迅速放入37°C水浴中融化，吸出细胞悬液放于15mL离心管中，用9倍所述细胞悬液体积 的D/F12培养液进行洗涤后，以1000转/分钟离心5min，去上清后，得到细胞沉淀物B ；用 D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中 培养即可。上述步骤(2)、(3)和(5)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为37. 5°C、含 5% C02的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。
权利要求
一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，包括以下步骤(1)采样从雌性成年藏羚羊个体的耳部取1cm2皮肤组织，并将其放入装有贮存液的离心管中；(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养将所述步骤(1)所得的藏羚羊耳部皮肤组织依次经含有双抗的杜氏磷酸缓冲液浸洗、含有双抗的D/F12培养液冲洗后，将样本组织块放入35mm培养皿中，剪碎；然后用吸管将碎组织块移入预先用胎牛血清涂布的培养瓶中，均匀地摆放于培养瓶底部；最后将培养瓶倒置放在饱和湿度二氧化碳培养箱中，3h后翻转培养瓶，加入3～5mL D/F12培养液继续培养10～18天，得到生长至80％～90％汇合的原代细胞；(3)传代与纯化将所述步骤(2)所得的原代细胞进行传代培养；首先将原代细胞用磷酸盐缓冲液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后将所述消化液A放入饱和湿度二氧化碳培养箱2～3min，取出，加入与消化液A等量的D/F12培养液终止消化，得到消化液B；将所述消化液B经离心、去上清液后，得到细胞沉淀物A；用D/F12培养液将所述细胞沉淀物A传入另一个培养瓶中，在37.5℃、含5％CO2的饱和湿度二氧化碳培养箱中继续培养3～6天，得到生长至80％～90％汇合的皮肤成纤维细胞；(4)细胞冻存将所述步骤(3)所得的皮肤成纤维细胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，离心后加入细胞冻存液混匀，先在4℃保存半小时，然后在-70℃冰箱中过夜，最后直接投入液氮保存，得到冻存皮肤成纤维细胞；(5)细胞复苏将所述步骤(4)所得的冻存皮肤成纤维细胞放入37℃水浴中融化，吸出细胞悬液，用9倍所述细胞悬液体积的D/F12培养液进行洗涤，经离心、去上清后，得到细胞沉淀物B；用D/F12培养液充分悬浮细胞沉淀物B，并接种于培养瓶中，置于饱和湿度二氧化碳培养箱中培养即可。
2.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(1)中的贮存液为加入双抗的T20；所述加入双抗的T20是由占总溶液体积的20%的胎牛 血清和80%的含10mM羟乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基础培养液组成，并在配置后加入双抗， 然后用NaOH调节pH值至7. 2 7. 4的溶液。
3.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤(2)中的杜氏磷酸缓冲液是由0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 0203g/100mL 的 KC1、0. 1152g/100mL 的 Na2HP04、0. 0203g/100mL 的 KH2P04、0. 0134g/100mL 的 CaCl2 2H20、0. Olg/lOOmL 的 MgCl2 6H20、0. 0036g/100mL 的丙酮酸钠、0. 0075g/100mL 的青霉素、0. 005g/100mL 的链霉 素和0. lg/100mL的葡萄糖组成。
4.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤 ⑵、(3)和(5)中的D/F12培养液均是由占总培养液体积的10%的胎牛血清、90%的D/F12 和双抗组成。
5.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步 骤(3)中的磷酸盐缓冲液是由 0. 8g/100mL 的 NaCl、0. 02g/100mL 的 KC1、0. 115g/100mL 的 Na2HP04 和 0. 02g/100mL 的 KH2P04 组成。
6.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤⑷中的冻存液是由占总溶液体积的20 %的胎牛血清、10 %的二甲基亚砜、70 %的D/F12和 双抗组成。
7.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述步骤 (2)、(3)和(5)中的饱和湿度二氧化碳培养箱是指温度为37. 5°C、含5% C02的饱和湿度空 气的二氧化碳培养箱。
8.如权利要求1所述的藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，其特征在于所述双抗 是指75 u g/mL的青霉素和100 u g/mL的链霉素。
全文摘要
本发明涉及一种藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤(1)采样；(2)藏羚羊耳部皮肤组织原代培养；(3)传代与纯化；(4)细胞冻存；(5)细胞复苏。本发明通过建立原代培养、细胞传代、细胞冻存与复苏的方法，获得了高活力藏羚羊成纤维细胞系，为深入开展藏羚羊分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了研究材料与技术支持。
文档编号C12N5/071GK101870962SQ20101020182
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者于鸿浩, 徐世晓, 曹俊虎, 赵新全, 郭志林, 郭松长 申请人:中国科学院西北高原生物研究所