湖北白猪胎儿成纤维细胞系的制作方法
【专利摘要】本发明属于细胞生物学领域，利用妊娠35天的湖北白猪胎儿，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?No.C201331。本发明得到的湖北白猪胎儿成纤维细胞系纯度高，形态一致，无上皮细胞、肝脏细胞、心肌细胞等的混杂。本发明所建细胞系可为基因工程、细胞工程、胚胎工程、免疫学和分子生物学提供高品质的细胞素材；可作为猪体细胞核移植的供体细胞；是重要的基因资源库，可作为优良地方品种的保种手段之一。
【专利说明】湖北白猪胎儿成纤维细胞系
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种湖北白猪胎儿成纤维细胞系与相关生物学特性，属于细胞生物学领域。
【背景技术】
[0002]生物基因资源是人类社会存在与发展的根本和基础，是实现社会持续发展，维护国家粮食、生态安全和社会稳定的战略性资源。近年来，由于地球生态环境的不断恶化，生物基因资源面临严重危机，有的甚至濒临衰竭、消亡。生物基因资源的保护、开发和利用已经引起世界各国政府的高度重视。挽救濒危物种、保存基因资源、加强开发利用已成为当务之急。
[0003]我国幅员辽阔，地大物博，具有多彩多姿的生态、地理、气候条件，加之拥有较多的民族及风格迥异的生活习惯，在长期的社会发展和民族融合过程中，广大劳动人民驯化、培养、选育了数目众多的优良畜禽品种。如产于关中平原一带的秦川牛、华北平原的鲁西黄牛，是我国发展肉牛养殖业的优秀基因资源；滩羊和中卫山羊是裘皮中的上品；太湖猪的高繁殖力举世闻名；五指山猪、广西巴马猪、贵州小香猪等则是典型的小型猪的代表，对生物医学研究具有重要意义。
[0004]尽管我国拥有大量的优良畜禽品种，但是受到人们认识的限制和现代社会消费需求的影响，大多数品种的生产力较低，产品的数量和质量难以满足人们的需求。因此在农业发展的过程中，一些地方优良品种逐渐为外来品种、杂交品种所取代，地方品种的种群数量减少，基因资源流失。另外，由于大量引进外国品种、生态环境恶化、人类过度利用等，优良畜禽基因资源状况堪忧。这将严重影响和制约我国农业的发展和竞争力。因此在世界各国展开基因资源抢夺和保护生物多样性的今天，通过现代生物技术的运用，妥善保存优良品种的基因资源，具有重大战略意义 。
[0005]湖北白猪是我国培育成功的肉猪品种之一，湖北白猪原产于湖北武汉市，后引种推广至邻近几省，该品种是选用英国大白猪，丹麦、英国、瑞典和法国的长白猪与地方猪种湖北通城猪杂交，经多年的群体继代选育而成。主要分布于华中地区。湖北白猪体格较大，全身被毛全白，头稍轻、直长，两耳前倾或稍下垂，背腰平直，中躯较长，腹小，腿臂丰满，肢蹄结实，有效乳头12个以上。成年公猪体重250~300公斤，母猪体重200~250公斤。该品种具有瘦肉率高、肉质好、生长发育快、繁殖性能优良等特点。6月龄公猪体重达90公斤；25~90公斤阶段平均日增重0.6~0.65公斤，料肉比3.5:1以下，达90公斤体重为180日龄，产仔数初产母猪为9.5~10.5头，经产母猪12头以上，以湖北白猪为母本与杜洛克和汉普夏猪杂交均有较好的配合力，特别与杜洛克猪杂交效果明显。杜X湖杂交种一代肥育猪20~90公斤体重阶段，日增重0.65~0.75公斤，杂交种优势率10%，料肉比3.1~
3.3:1，胴体瘦肉率62%以上，是开展杂交利用的优良母本。
[0006]然而，在多年的生产中，由于对湖北白猪的过度使用和忽视原种培育等因素，湖北白猪自身的优异基因资源未能得到有效推广，近年来甚至出现萎缩势头，这直接影响到该品种的生存，对我国畜牧业将造成不能估量的损失。因此，对该品种基因资源进行有效保藏，将是延续其优良性能的有力手段。
[0007]目前保存生物基因资源的最佳手段是体细胞冻存。这是因为该方法简单易行，稳定可靠，且在多个物种基因资源的保藏中得到广泛运用。而且，该方法获得的体细胞适合体外大规模培养，便于开展各类研究。本发明即是采用通行的体细胞冻存法，获得了形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:武汉市武昌珞珈山武汉大学。保藏编号为CCTCC No:C201331，保藏日为2013年3月26日，命名为猪属家猪种(Sus Scrofa domesticus)湖北白猪胎儿成纤维细胞系。
[0009]本发明还提供上述细胞系的分离、培养、传代和冻存方法及相关生物学特性。
[0010]为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案:
[0011](I)湖北白猪胎儿成纤维细胞的分离
[0012]将发育至35天的湖北白猪胎儿从母体内取出，在灭菌的超净工作台上，首先用加1%青链双抗的DPBS (杜氏磷酸缓冲液)洗涤6-8遍，尽可能去除外源污染物质；用消毒的镊子取出背部及臀部的肌肉组织，用剪刀剪成体积约Imm3细小碎块，尽可能去除内脏及头部组织以防止混杂其它类型的细胞。用胰酶消化液消化组织碎块，培养于39°C、饱和湿度、5%C02的培养箱内。培养基配方为DMEM+10%胎牛血清。
[0013](2)湖北白猪胎儿成纤维细胞的原代培养
[0014]密切观察上述步骤中培养的细胞。开始培养的3-5天后，即可观察到成纤维细胞从组织块的边缘向四周扩散。此时`每隔3天左右更换新鲜培养基，直到成纤维细胞铺满整个培养板底部。
[0015](3)湖北白猪胎儿成纤维细胞的传代培养
[0016]待步骤(2)中的原代细胞汇合度达到100%时，将废弃的液体培养基倒掉，用预热至39°C的加1%青链双抗的DPBS (杜氏磷酸缓冲液)洗涤2次，以彻底去除残留培养基。加入胰蛋白酶消化细胞，再加入等体积完全培养基中和胰蛋白酶，吸打细胞成为单细胞悬液，平均分到2-3个培养瓶内，培养于39°C、饱和湿度、5%C02的培养箱内。
[0017](4)湖北白猪胎儿成纤维细胞的冻存
[0018]待传代细胞的汇合度达到100%时，去除废弃培养基，DPBS洗涤，胰酶消化为单细胞悬液，转移到新鲜灭菌的1.5ml离心管内，在台式离心机上以6000rpm、2min将细胞聚集于管底，彻底去除上清，加入细胞冻存液。冻存液的配方为DMEM:胎牛血清:DMS0=6:3:1。仍然将细胞混匀，用棉花包裹，先在_80°C超低温冰箱内冻存过夜，第二天将细胞转移到液氮内长期保存。注意标明日期和样品名称。
[0019](5)湖北白猪胎儿成纤维细胞的复苏与存活率测定
[0020]从液氮内取出I管冻存的细胞，迅速置于39°C温水浴内不断摇晃使其融化。吸出细胞后加到培养瓶内，在补加适当体积的完全培养基，轻轻摇晃混匀，培养于39 °C、饱和湿度、5%C02的培养箱内。采用台盼蓝斥染法计算细胞存活率。取出适量细胞加到台盼蓝染液内，光学显微镜下计数蓝色细胞数，细胞存活率的计算公式为:存活率=(1-蓝色细胞数/总细胞数)X 100%。
[0021](6)湖北白猪胎儿成纤维细胞的倍增时间测定
[0022]将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照IO4个细胞/ml的密度铺到24孔板内，从第二天开始以血球计数板每隔24小时计数细胞总数，至第五天停止。按照细胞数量绘制其生长曲线，得到其倍增时间。
[0023](7)湖北白猪胎儿成纤维细胞的核型分析
[0024]用秋水仙素处理生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞使其停在分裂中期，经固定、Giemsa染色、镜检等，获取100个分裂相的染色体照片，统计整二倍体细胞的出现比例。湖北白猪细胞二倍体的染色体数目为2n=38。
[0025](8)湖北白猪胎儿成纤维细胞的G418耐受性测试
[0026]将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照IO4个细胞/ml密度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照下列G418浓度加药:200 μ g/ml、400 μ g/ml、600μ g/ml、800l.! g/ml、1000l.! g/ml，放回到培养箱内继续培养。定期观察细胞的死亡情况。当在第7天时引起细胞全部死亡的G418浓度，作为该细胞系的最佳筛选浓度。
[0027](9)湖北白猪胎儿成纤维细胞摄取外源基因的能力测试
[0028]将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照IO4个细胞/ml密度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照Lipofectamine2000说明书进行转染,报告载体为PEGFP-Nl。48小时后计数绿色荧光蛋白的细胞比例，计算该细胞系的转染效率，作为评价其摄取外源基因能力的指标。
[0029](10)湖北白猪胎儿成纤维细胞的转基因细胞系的筛选
[0030]将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照50%汇合度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照LipOfectamine2000说明书进行转染，报告载体为pEGFP-Nl。48小时后，按照测定的浓度加入G418，筛选7天，此时可见发出均匀绿色荧光的单克隆。采用胰酶点消化法分离单克隆后，在培养板内扩大培养，得到足量的带有外源报告基因的转基因单克隆细胞。
[0031](11)湖北白猪胎儿成纤维细胞的重编程能力
[0032]将步骤(10)分离到的转基因单克隆细胞通过核移植的方法，注射到去核的体外成熟猪卵母细胞内，经过融合、激活、体外培养，在荧光显微镜下观察重构胚的卵裂、荧光表达等，评价其发育能力，即重编程能力。
[0033]本发明所提供的湖北白猪胎儿成纤维细胞系，可以作为猪体细胞核移植的供体细胞使用。
[0034]本发明利用妊娠35天的湖北白猪的胎儿，取出背部及臀部的肌肉组织，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。本发明对其培养、传代、冻存等体系进行了标准化和规范化，并对其生物学特性进行了研究。该细胞系可为基因工程、细胞工程、胚胎工程、免疫学和分子生物学提供高品质的细胞素材；可作为猪体细胞核移植的供体细胞；在畜牧业上能为丰富并改良地方品种提供优异的实验材料；是重要的基因资源库，可作为优良地方品种的保种手段之一；可为基因功能解析、信号转导等基础研究提供优良的细胞模型；是建立猪诱导干细胞和转分化细胞的重要原始素材。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1湖北白猪胎儿成纤维细胞原代培养照片
[0036]将妊娠35天的湖北白猪胎儿用剪刀剪成细小碎片，用胰酶消化后接种到培养板内，添加完全培养基于培养箱内培养。在第5天左右,可在光学显微镜下观察到有成纤维细胞从组织块周围溢出，并向四周扩散。图中视野的放大倍数为20X。
[0037]图2湖北白猪胎儿成纤维细胞生长曲线
[0038]湖北白猪胎儿成纤维细胞的生长呈现“S”形，即在一定密度接种后，其生长密度以“慢-快-慢”的形式递增。第I天为适应期，此后进入快速增值期，在第4天后进入平台期。平均倍增时间为24小时，属于生长旺盛的细胞类型。图中数据点表示三个生物学重复的均数(Mean),误差棒表不标准差(SEM)。
[0039]图3湖北白猪胎儿成纤维细胞核型
[0040]猪的染色体数目为2X 19=38条。采用DAPI染色法分析处于分裂中期的染色体形态特征，采用LSM510META共聚焦显微镜成像,LSM Image Examiner分析图像。图中显示所分离的湖北白猪胎儿成纤维细胞具有19对清晰染色体，表明核型正常。
[0041]图4湖北白猪胎儿成纤维细胞G418耐受性
[0042]将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照一定密度接种后加入G418浓度梯度进行耐药实验，以在第7天全部死亡的细胞作为该细胞系的最佳筛选浓度。图中显示在600 μ g/ml的G418作用下，该细胞系在第7天的时候全部死亡。低于此浓度，细胞仍然存活；高于此浓度，细胞提前开始全部死亡。灰色三角为该浓度的作用曲线。图中数据点表示三个生物学重复的均数(Mean)，误差棒表示标准差(SEM)。
[0043]图5湖北白猪胎儿成纤维细胞的转染效率
[0044]以红色突光蛋白表达载体pDsred-monomer为报告基因，按照脂质体Lipofectamine2000的标准步骤转染湖北白猪胎儿成纤维细胞，48小时后观察红色荧光蛋白的表达并计算转染效率。左图为亮视野，右图为红色荧光视野。转染效率为75%。
[0045]图6湖北白猪胎儿成纤维细胞的转基因细胞系单克隆
[0046]将报告载体pEGFP-Nl转染于湖北白猪胎儿成纤维细胞，G418筛选，胰酶点消化法挑取单克隆。图中为正在生长的转基因单克隆细胞系，可见所有细胞发出均匀绿色荧光。
[0047]图7湖北白猪胎儿成纤维细胞的重编程能力
[0048]将表达EGFP的单克隆转基因细胞作为核供体，以体外成熟的猪卵母细胞作为受体，采用盲吸法去核、移植、融合、激活，体外培养，观察重构胚的卵裂和EGFP的表达水平。以无供体细胞的猪孤雌胚作为对照。左上图为孤雌胚的亮视野，右上图为孤雌胚的荧光视野，左下图为重构胚的亮视野，右下图为重构胚的荧光视野。图中显示孤雌胚在荧光激发下无荧光细胞，证明孤雌胚本身的背景荧光极低；而重构胚在荧光激发下发出明亮的绿色荧光，证明重构胚卵裂球的荧光是来自表达EGFP的供体细胞，说明湖北白猪胎儿成纤维细胞具有重编程能力，可以用于体细胞核移植以及相关研究。
【具体实施方式】[0049]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件和方法者，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。
[0050]实施例1湖北白猪胎儿成纤维细胞的分离与原代培养。
[0051]⑴材料
[0052]
【权利要求】
1.湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0.201331。
2.权利要求1所述的湖北白猪胎儿成纤维细胞系的制备方法，其特征在于，利用妊娠35天的湖北白猪的胎儿，取出背部及臀部的肌肉组织，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。
3.权利要求1所述的 湖北白猪胎儿成纤维细胞系作为猪体细胞核移植的供体细胞的用途。
【文档编号】C12N15/873GK103509752SQ201310381274
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】毕延震, 刘西梅, 肖红卫, 郑新民, 华文君, 张立苹 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所