专利名称：绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码4E-BP1 蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码4E-BP1蛋白质的cDNA编码区232bp的核苷酸序列和与 它的前231bp核苷酸序列对应的氨基酸序列。
背景技术：
细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空 间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生 长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为 生长。eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E) ^^tliffllfillifin^n 复合体的亚单位之一，结合于mRNA的5' cap，与eIF4E结合的是eIF4G，二者的结合受到 eIF4E结合蛋白4E-BPs的调节。低磷酸化的4E-BP1与eIF4E具有较高的亲和力，处于较高 磷酸化状态的4E-BP1则可释放出eIF4E，使得eIF4G得以与eIF4E结合，进而启动5' cap mRNA的翻译。人的4E-BP1包含了 118个氨基酸残基，小鼠的则是117个，C端的T0S模序 (motif)对于与Raptor的结合进而被mTOR磷酸化是十分重要的。人4E-BP1已报道的磷酸化位点有7个，分别是Thr37，Thr46，Ser65,Thr70, Ser83, SerlOl和Serll2。在生长因子的刺激下，mTOR使4E-BP1磷酸化的顺序是首先是Thr37 和Thr46，然后是Thr70和Ser65，Thr70和Ser65的磷酸化对于eIF4E的释放是最为重要 的，Thr70可以促进释放，而Ser65可以防止二者重新结合。这样的磷酸化在由胰岛素和IGF 诱导时，在不同类型的细胞中是有差异的。上述结果显示了 mTOR使得4E-BP1磷酸化对于 eIF4E释放的重要性和这种磷酸化过程的复杂性。迄今，关于4E-BP1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在牛、 人、大鼠、小鼠和黑猩猩等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见绒山羊细胞 中4E-BP1的研究报道，也未见有绒山羊4E-BP1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基 酸序列的报道。在各种情况下，有重要的原因研究和开发与绒山羊4E-BP1蛋白相关的基因克隆 及其重组表达，因为研究清楚绒山羊的4E-BP1基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培 养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组4E-BP1蛋白制备的抗体 可以检测4E-BP1基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达 情况。发明内容本发明人已经努力从绒山羊的不同组织细胞中分离4E-BP1基因。作 为结果，本发明人从绒山羊体外培养的胎儿成纤维细胞分离了 4E-BP1基因的cDNA编码区 232bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对已 知的牛、马、人、小鼠、黑猩猩、猪的4E-BP1基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛的 4E-BP1基因(NM_001077893)cDNA编码区的序列，在不打乱氨基酸编码序列的前提下设计 出了一对用于通过RT-PCR方法扩增绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区片段的简并引物(上 游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了绒 山羊4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段，序列分析表明与牛的序列(NM_001077893)同源性为98% (229/232)，推导出的由此序列的前231bp核苷酸序列编码的氨基酸序列与牛 的相比有1个氨基酸的差别。这一 cDNA片段称为“g4E-BPl”。所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的4E-BP1的核苷酸序列设计简并引 物，然后通过RT-PCR方法克隆绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提 供编码绒山羊4E-BP1蛋白的基因的cDNA的编码区232bp的核苷酸序列和由此序列的前 231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。附图的简要说明从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中
图1显示了牛4E-BP1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号NM_001077893)。图2显示了 232bp的绒山羊4E-BP1基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO 1)和由此序列的前231bp的核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。图3是显示从绒山羊胎儿成纤维细胞分离的总RNA的RT-PCR的结果(232bp的 cDNA g4E-BPl)的电泳图。图4是显示以质粒pMD19-T-g4E-BPl为模板，以PI、P2为引物进行PCR鉴定的电 泳图。图5是显示将质粒pMD19-T-g4E-BPl进行酶切鉴定的电泳图。图6显示了绒山羊4E-BP1基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(NM_001077893) 的4E-BP1基因cDNA的序列的比较。
具体实施方式
为了从绒山羊胎儿成纤维细胞中分离4E-BP1基因，本发明人首 先按照提取细胞总RNA的标准要求收集体外培养的内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat, Capra hircus)的胎儿成纤维细胞。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂 盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞的 总RNA，然后以该总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为 模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段 切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-g4E_BPl。为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-g4E_BPl，将其转化E coli DH5a感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-g4E_BPl转化了的Ecoli DH5 a细胞涂在含有 氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37°C培养16小时后选取白色的 重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白色菌落为获得的重组菌落。重组菌落和重组质粒pMD19-T-g4E_BPl的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先 挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR 鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为 重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒 进一步进行EcoR I单酶切和EcoR 1/HindIII双酶切鉴定。经过了 PCR和酶切双重鉴定的 质粒确定为重组质粒pMD19-T-g4E-BPl。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重 组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-g4E-BPl的Ecoli DH5 a液体培养的样品送宝生物工程 (大连)有限公司测序。作为结果，获得了 232bp的山羊4E-BP1基因cDNA编码区的核苷酸 序列。显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法
4扩增出绒山羊的4E-BP1基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的绒山羊4E-BP1基因 cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测4E-BP1基因的组织表达特异 性，也可进一步实现绒山羊4E-BP1基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载 体上可能会表达出完整的4E-BP1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、 早期胚胎、个体在不同状态下的4E-BP1基因的表达情况等等。在下面的实施例中进一步说 明了本发明，但这并不限制本发明的范围。实施例1 绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段的克隆为了克隆来自绒山羊胎儿成纤维细胞的4E-BP1基因包含232bp编码区的cDNA，根 据图1公开的核苷酸序列(NM_001077893)，首先制备允许扩增232bp的cDNA的PCR简并 引物，即上游引物 P1 5 ‘ ACGCTCTTCAGCACCAC 3 ‘；下游引物 P2 5 ‘ TGTCCATCTCAAAC (T) TGTG 3‘。为了利用RT-PCR方法克隆4E-BP1基因的cDNA，从绒山羊胎儿成纤维细胞分离总 RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作 程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80°C冰 箱保存备用。然后，利用TaKaRa的AMV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录 反应，得到cDNA第一链。以上面得到的cDNA第一链为模板，PI、P2为引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶 进行PCR反应。PCR反应体系如表1，反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物10 u 1进行0. 7%琼脂糖凝胶电泳(0. 5% TAE，电压 8v/cm, 1. 5h)。电泳结束，0. 5 u g/ml的EB染色液中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置 于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了 232bp的特异性目的片段(参见图3)。为了将获得的232bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19_T克隆载体上，首先将 电泳分离的232bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片 段，紫外测定浓度后按照PMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应 是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-g4E-BPl，将其转化Ecoli DH5 a感受态细胞，然后将 此被质粒pMD19-T-g4E-BPl转化了的Ecoli DH5 a细胞涂在含有氨苄青霉素和X_gal的选 择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37°C培养16小 时后选取白色的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白色的重组菌 落。表14E-BP1基因PCR反应体系 表24E-BP1基因PCR反应循环 进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒 的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白色的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌 落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物PI、P2进行PCR鉴定。对阳性 的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行琼脂糖凝胶电 泳(0.5%14￡，电压8^皿，1.51!)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最 后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以 PI、P2为引物，反应体系如表1，反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物lOiU进行 0. 7%琼脂糖凝胶电泳(0. 5% TAE，电压8v/cm, 1. 5h)。电泳结束，0. 5 u g/ml的EB染色液 中染色20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了 232bp 的特异性目的片段(参见图4)。酶切鉴定采用TaKaRa EcoRI单酶切和EcoR I/HindIII 双酶切，作为结果，质粒的单双酶切得到了与预期结果大小相符的片段(参见图5)。经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌 落样品1ml送往宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了绒山羊4E-BP1基因 的cDNA编码区232bp片段的克隆。实施例2 绒山羊4E-BP1基因的cDNA的核苷酸序列图2显示了实施例1中获得的232bp的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)， 和由此序列的前231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID N0:2)。在图2中，显示的 序列是4E-BP1基因的核苷酸序列，它包括了 cDNA编码区的232bp的核苷酸序列和由此序 列的前231bp核苷酸序列编码形成的推断的分子量为8. 47KDa的成熟蛋白质的77个氨基酸。图6显示了绒山羊4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列与牛的4E-BP1基因 (NM_001077893) cDNA的核苷酸序列的比较。表明1)绒山羊4E-BP1基因cDNA的核苷酸序 列与牛的4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列有98%的同源性。由绒山羊的这段核苷酸序列的 前231bp核苷酸序列推导出的氨基酸序列与牛的4E-BP1蛋白相同位置片段的氨基酸序列 相比(NP_001071361. 1)有1个氨基酸的差别，同源性99% (76/77)。正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆绒山羊4E-BP1基因 cDNA编码区的引物和编码绒山羊的4E-BP1蛋白质的包括232bp的cDNA的核苷酸序列和由 它的前231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列。此cDNA包括的231bp的核苷酸序列，它编码 含有77个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3. 1 等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的4E-BP1蛋白， 进而可用于抗体生产，检测绒山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的4E-BP1 基因的表达情况等等。1.绒山羊4E_BPlcDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所述。2.由cDNA编码区的核苷酸序列的前231bp核苷酸序列推断出的绒山羊4E-BP1蛋 白质的氨基酸序列如SEQID NO 2所述。绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区核苷酸序列.ST25SEQUENCE LISTING<110>内蒙古大学实验动物研究中心王，志钢刘，东军旭，日干<120>绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区核苷酸序列<130>gene sequence<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>231<212>DNA<213>Capra hircus<220><221>CDS<222>(1). . (231)<400>1acg ctc ttc age accThr Leu Phe Ser Thr15aag ttc ctg atg gagLys Phe Leu Met Glu
acc ccc gga ggt acc agg ate ate tat gac egg 48 Thr Pro Gly Gly Thr Arg lie lie Tyr Asp Arg
1015
tgt egg aac tea cct gtg acc aag acg ccc ccg 96 Cys Arg Asn Ser Pro Val Thr Lys Thr Pro Pro[0062202530[0063egggacctgcccaccattcccggggtcactagecctacaggcgatgag[0064ArgAspLeuProThrlie Pro Gly ValThr Ser Pro Thr Gly Asp Glu[0065354045[0066ccccccacggaagccagecagaatcacctgcgcageagecccgaggac[0067ProProThrGluAlaSer Gin Asn His Leu Arg Ser SerProGluAsp[0068505560[0069aagccggcaggcggtgaagagteacaatttgagatggac[0070LysProAlaGlyGlyGluGluSerGinPheGluMetAsp[0071657075[0072<210>2[0073<211>77[0074<212>PRT[0075<213>Capra hircus[0076<400>2[0077ThrLeuPheSerThrThrProGlyGlyThrArglielieTyrAspArg[0078151015[0079LysPheLeuMetGluCysArgAsnSerProValThrLysThrProPro[0080202530[0081ArgAspLeuProThrlieProGlyValThrSerProThrGlyAspGlu[0082354045[0083ProProThrGluAlaSerGinAsnHisLeuArgSerSerProGluAsp[0084505560[0085LysProAlaGlyGlyGluGluSerGinPheGluMetAsp[0086657075
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权利要求
本发明涉及一段从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码4E-BP1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码4E-BP1蛋白质的cDNA编码区核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。目前应用RT-PCR方法克隆基因并获得相应的核苷酸序列是获得基因(cDNA)核苷酸序列的常用方法。本项发明设计了一对引物并应用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了绒山羊4E-BP1基因cDNA的编码区特异性片段，经过测序后得到这一片段的232bp的核苷酸序列，其特征是在还没有绒山羊4E-BP1基因核苷酸序列的情况下，通过比较已知的牛、马、人、小鼠、黑猩猩、猪的4E-BP1基因的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛4E-BP1基因cDNA序列(NM_001077893)，在不打乱氨基酸编码序列的前提下设计PCR简并引物，进而通过RT-PCR方法扩增出了绒山羊4E-BP1基因cDNA的编码区片段，测序后得到了232bp的核苷酸序列和与它的前231bp的核苷酸序列对应的氨基酸序列，这一绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区片段的核苷酸序列和与它的前231bp的核苷酸序列对应的氨基酸序列在国内外是首次获得。基于上述说明的本发明的技术特征，本发明的独立权利要求表述为一种自绒山羊分离的多核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列，是下列序列之一1)序列表中SEQ ID NO1的cDNA序列；2)与序列表中SEQ ID NO1的cDNA序列的前231bp的核苷酸序列对应的标注为SEQ ID NO2的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码4E-BP1蛋白的cDNA的核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列。本发明通过比对已知的牛、马、人、小鼠、黑猩猩、猪的4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列，找到保守区，然后根据牛4E-BP1基因cDNA序列(GenBank登录号NM_001077893)，在不打乱氨基酸编码序列的前提下设计出了一对用于RT-PCR扩增绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区片段的简并引物并用这对引物通过RT-PCR方法扩增出了特异性片段，测序后得到了绒山羊4E-BP1基因cDNA的编码区的232bp的核苷酸序列和与它的前231bp核苷酸序列对应的氨基酸序列。获得的这232bp的核苷酸序列可进一步用于绒山羊4E-BP1基因全长cDNA的克隆及用于通过RT-PCR或杂交的方法检测4E-BP1基因的组织表达特异性，也可用于重组表达得到蛋白后制备检测4E-BP1的抗体。
文档编号C12N15/12GK101851626SQ20091013247
公开日2010年10月6日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者刘东军, 旭日干, 王志钢 申请人:王志钢;刘东军;旭日干