杏仁蛋白特异性序列及基于其的快速鉴定二联检测卡的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测，具体涉及现场快速鉴定食品中的扁桃仁蛋白和杏仁蛋白。
【背景技术】
[0002] 在上世纪70年代美国扁桃仁出口到我国时，被误译成"美国大杏仁"，并广泛传 播，这使得大多数消费者根本不知道扁桃仁、杏仁是两种完全不同的产品，造成了长期的误 导。很多消费者都认为美国大杏仁就是产自美国的大杏仁，甚至因为美国大杏仁圆润饱满 颗粒大而中国杏仁相对扁平颗粒小，从而认为美国大杏仁比中国杏仁质量好。中国杏仁行 业遭遇不公平竞争，由兴转衰。
[0003] "美国大杏仁"也就是扁桃仁和中国产杏仁分别为扁桃（Primus armeniaca)和杏 (Prunus amygdalus dulcis)的果实，两者均属于李属（Prunus sp.)植物。
[0004] 美国大杏仁具有丰富的营养物质，如维生素 E和类黄酮植物化合物等抗氧化剂， 能防止细胞受到氧化损伤，预防心脏病、中风和慢性疾病的发生；含有丰富的维生素 E，这 种营养素对保持皮肤健康非常重要；胆固醇含量低，含不饱和脂肪酸，可以降低体内胆固醇 水平，不会导致肥胖和高脂血症；有膳食纤维丰富，减低脂肪的消化和吸收，缓解便秘；含 有铁、镁、锌、磷等微量元素，补充人体的营养素。相比较来说，美国大杏仁更多是作为食物 应用。
[0005] 中国杏仁分为两种，药用多用苦杏仁（俗称北杏仁），它性微温，味苦，可降气平喘 止咳，润肠通便，但略微有毒性，不可多服；食用多用甜杏仁（俗称南杏仁）。甜杏仁是一种 健康食品，适量食用不仅可以有效控制人体内胆固醇的含量，还能显著降低心脏病和多种 慢性病的发病危险。素食者食用甜杏仁可以及时补充蛋白质、微量元素和维生素，例如铁、 锌及维生素 E。甜杏仁中所含的脂肪是健康人士所必需的，是一种对心脏有益的高不饱和脂 肪。研宄发现，每天吃50?100克杏仁（大约40?80粒杏仁），体重不会增加。甜杏仁中 不仅蛋白质含量高，其中的大量纤维可以让人减少饥饿感，这就对保持体重有益。纤维有益 肠道组织并且可降低肠癌发病率、胆固醇含量和心脏病的危险。所以，肥胖者选择甜杏仁作 为零食，可以达到控制体重的效果。最近的科学研宄还表明，甜杏仁能促进皮肤微循环，使 皮肤红润光泽，具有美容的功效。
[0006] 扁桃仁和杏仁（甜杏仁）均为受消费者喜爱的核果，被加工成植物蛋白饮料或作 为蛋糕、面包、饼干以及巧克力等食品的辅料。由于其外观，口感非常相近，导致通过感官较 难分辨。然而两者之间存在价格差，标签上对原料的错误标准，所以目前市场上对两种产品 的标示比较混乱，暂时没有快速便捷的方法来鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种杏仁蛋白特异性氨基酸序列。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种杏仁蛋白特异性抗体。
[0009] 本发明的再一个目的在于一种鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联快速检测卡。
[0010] 本发明所采取的技术方案是： 一种杏仁蛋白的特异性氨基酸序列，其氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG(SEQ ID ΝΟ:1)。
[0011] -种杏仁蛋白特异性抗体，由杏仁蛋白特异性抗原直接或间接诱导产生。
[0012] 进一步的，杏仁蛋白特异性抗体为单克隆抗体。
[0013] 一种鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联快速检测卡，所述快速检测卡中含有扁桃仁 蛋白特异性抗体和杏仁蛋白特异性抗体，其中杏仁蛋白特异性抗体如前所述。
[0014] 进一步的，所述快速检测卡为胶体金快速检测卡。
[0015] 本发明的有益效果是： 发明人通过自行测序，首次确定了杏仁蛋白prunin-Ι的全序列，并从中选择了杏仁蛋 白的特异性氨基酸序列，其氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG(SEQ ID ΝΟ:1)。该序列具有很好 的免疫原性，可以诱导出效价很好的杏仁蛋白特异性抗体。
[0016] 通过对比序列，确定了杏仁蛋白prunin-Ι与扁桃仁蛋白prunin-Ι之间的异同，为 制备鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白的检测试剂提供了条件。
[0017] 本发明的二联快速检测卡，能快速检测分辨出扁桃仁蛋白和杏仁蛋白，特异性高， 准确性尚，弥补了市场上的空白。
【附图说明】
[0018] 图1为杏仁蛋白和扁桃仁蛋白 >联检测卡结构不意图； 图2为杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡结果判断示意图。
【具体实施方式】
[0019] 以下结合具体实验操作，对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0020] 抗原多肽的选取： 根据自行测得的杏仁蛋白prunin-Ι序列进行Blast比对，综合特异性，抗原性分析，选 择杏仁蛋白prunin-Ι的特异性氨基酸序列RQQRQQPFGRPG(SEQ ID NO :1)作为杏仁蛋白特 异性抗原多肽； 根据NCBI扁桃仁prunin-Ι的蛋白序列进行Blast比对，综合特异性，抗原性分析，选 择多肽RQGRQQGRQQQEEGR(SEQ ID NO :2)作为扁桃仁蛋白特异性抗原多肽； 根据NCBI杏仁prunin-l的蛋白序列进行Blast比对，综合特异性，抗原性分析，选 择多肽AFVFSLCLLLVFNGCL(SEQ ID N0:3)作为同时识别杏仁和扁桃仁prunin-Ι蛋白的 AFVFSLCLLLVFNGCL 氨基酸序列。
[0021] 免疫原的制备： 分别将上述3个多肽通过Cys偶联钥孔血蓝蛋白作为免疫原，偶联载体蛋白牛血清白 蛋白作为包被原。偶联方法如下： 5. 8mg 3-(2-卩比啶二疏基）丙酸N-轻基琥泊酰亚胺醋溶解于ImL二甲亚砜中，逐步滴 加至溶解有〇. Ig钥孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白的ImL 0. OlM pH7.4PBS中，室温反应12小 时。透析过夜除去游离的3-(2-吡啶二巯基）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯。将4mg多肽加 入上述活化好的蛋白溶液中。反应12小时后透析过夜，冻干保存。
[0022] 抗体的制备和纯化： 1) 分别用制备得到的抗原免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别 100 μ g/mL的免疫抗原100 μ L，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周 后，取用样的抗原，与100 μ L不完全佐剂乳化，同样方法注射； 2) 在细胞融合前Id或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，体表消毒；用大头针 固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完 全培养液（由GIBICO RPMI-1640基础培养液加入15%胎牛血清而得），用手轻轻揉动腹腔， 将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液（由74. 25mL RPMI-1640完全培养液 加入0. 75mL 100XHAT液而得）中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0. 5mL，置于37°C C02 培养箱中； 3) 小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入 RPMI-1640基础培养液（购自GIBIC0,货号为A10491-01)中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪 碎，置于100目的不锈钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于 50mL无菌离心管中，离心； 4) 将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5 :1的比例加入同一 50mL的离心管 中，加入37°C温浴的RPMI-1640不完全培养液（购自GIBIC0,货号为61870-036) 20mL，混 合均匀，1500r/min离心6min，弃去上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状；用 移液管取37°C预热的PEG lmL，滴入离心管，静置Imin后，于37°C水浴中在2min内滴加 RPMI-1640完全培养液10mL，lOOOr/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混 匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0. 5mL，于37°C、5% C