O2饱和湿度的培 养箱中孵育； 5) 融合后6?9d，用HAT培养液半量换液1次，在12?14d后根据增殖情况改用 RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总 数，取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细 胞； 6) 采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞 争抑制反应的孔为产抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆； 7) 无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板 的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2?1/3孔底后，取上清液， 间接ELISA检测；取呈阳性强的亚克隆，如此反复2?5次，待所克隆的8个孔上清液中抗 体阳性率为100%时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细 胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射〇. 5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。 取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用IOmL 不完全培养基悬浮，计数；将细胞（每只小鼠 lmL，含3. IX IO7个细胞）腹腔注射小鼠腹部， 10?15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；2000r/min离心lOmin， 去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装_70°C冻存备用； 8) 取腹水离心后的中层部分3mL，加入2倍体积的0. 06mol/L、pH 4. 5醋酸钠缓冲 液。将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33 μ g/mL腹水，边加边搅拌，加完后继续搅 拌30min，4°C下10000r/min离心30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清 经 0·45μπι 微孔膜过滤，与 1/10 体积 10XPBS 混合（10XPBS 由 80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HP04、2g ΚΗ2Ρ04、0· 5845g EDTA 用 950mL 蒸馏水溶解后，调 pH 至 7· 4 并定容至 IOOOmL 而 得），用lmol/L NaOH溶液调pH值到7. 4。上清冷却到4°C，加硫酸铵至终浓度为0. 277g/ mL。搅拌30min，4°C下10000r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50? 100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。得到纯化抗体，4°C下贮藏备用。
[0023] 其中由RQGRQQGRQQQEEGR-Cys构建的抗原所制备的单克隆抗体特异性识别扁桃 仁prunin-Ι蛋白，命名为Anti-AL ;由RQQRQQPFGRPG-Cys构建的抗原所制备的单克隆抗体 特异性识别杏仁prunin-Ι蛋白，命名为Anti-AP。由AFVFSLCLLLVFNGCL-Cys构建的抗原所 制备的单克隆抗体可同时识别扁桃仁和杏仁的prunin-Ι蛋白，命名为Anti-total。
[0024] 胶体金的制备 取1 %氯金酸溶液lml，加99ml超纯水成终浓度0. 01 %的氯金酸溶液，加热沸腾后，取 1 %柠檬酸三钠 I. 9ml -次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转 为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，超纯水定容至100mL。
[0025] 抗唾液酸糖蛋白抗体胶体金标记物的制备 在磁力搅拌下，将100 μ g/mL Anti-total抗体溶液加入pH6. 0的胶体金溶液中。分 别取lmlAnti-total抗体胶体金标记物（实验组）和Iml胶体金原液（对照组）于试管 中加10%氯化钠溶液0. lml，室温静置lh，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝 色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验。 最后，在实验组中加入终浓度为0.2%的聚乙二醇（PEG丽20000)，继续搅拌30min，得到 Anti-total抗体胶体金标记物溶液。
[0026] 结合垫的制备 使用PBS溶液稀释Anti-total抗体胶体金标记物至工作浓度8 μ g/mL，均勾浸于玻璃 纤维素膜，-20°C冻存，冷冻真空干燥后，得到结合垫，4°C密封保存。
[0027] 反应垫的制备 取 20 μ g/ml 的 Anti-AL 抗体用 0. Olmol/L 的 PBS 缓冲液（pH 7. 2)以 250 μ g/ml 间隔， 经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应 区，定义为检测线A。另外在距离其5mm处以相同的条件包被Anti-AP抗体，定义为检测线 B。距离检测线B 5mm远的质控线用dispenser线形包被5mg/ml的正常羊抗鼠 IgG，37°C干 燥2h，得到反应垫，4°C密封保存。
[0028] 样品垫的处理 将样品垫浸泡于含封闭液中，封闭液为含1 % B SA，0. 5 %鱼明胶，3 %海藻糖的 0.05mol/L PBS缓冲液中，封闭30min，37°C真空干燥，真空封装，4°C密封保存。
[0029] 杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡的组装 依次将样品垫1、结合垫2、反应垫3和吸水垫4粘附于PVC背衬5上，样品垫设置有 样品孔11，反应垫包被有检测线A31，检测线B32和质控线33,如图1所示。结合垫粘附于 样品垫之上，并与反应垫相搭接，反应垫与吸水垫相搭接，真空封装，4°C密封保存，可保质1 年以上。
[0030] 杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡对杏仁和扁桃仁制品进行检测 样品前处理： 杏仁和扁桃仁制品：将杏仁和扁桃仁制品均质，称取lg，加入20mL 0. OlM pH7. 4的 PBS，反复震荡5min，静置，取上清液为样品检测溶液。
[0031] 杏仁和扁桃仁胶体金检测卡进行检测：取出杏仁和扁桃仁胶体金检测卡，用移液 器取样品检测溶液80 μ 1 (或用滴管取3-4滴）滴入样品垫的样品孔中，5?IOmin观察检 测结果，图2为杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡结果判断示意图。
[0032] 杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡的特异性 使用杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡对食品其他常见蛋白进行检测，结果如表1所 /Js 〇
[0033] 表1杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联检测卡与食品中其他蛋白成分的交叉反应
【主权项】
1. 一种杏仁蛋白的特异性氨基酸序列，其氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG。
2. 权利要求1所述的特异性氨基酸序列作为杏仁蛋白特异性抗原的应用。
3. -种杏仁蛋白特异性抗体，所述抗体由权利要求1直接或间接诱导产生。
4. 根据权利要求3所述的杏仁蛋白特异性抗体，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体。
5. -种鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联快速检测卡，所述快速检测卡中含有扁桃仁蛋 白特异性抗体和杏仁蛋白特异性抗体，其特征在于：杏仁蛋白特异性抗体如权利要求3或4 所述。
6. 根据权利要求5所述的快速检测卡，所述快速检测卡为胶体金快速检测卡。
【专利摘要】本发明公开了杏仁蛋白特异性序列及基于其的快速鉴定二联检测卡，杏仁蛋白氨基酸序列是：RQQRQQPFGRPG。该序列具有很好的免疫原性，可以诱导出效价很好的杏仁蛋白特异性抗体。利用本发明制备的杏仁蛋白特异性抗体和已知的扁桃仁特异性抗体共同制备了鉴定杏仁蛋白和扁桃仁蛋白二联快速检测卡。本发明的二联快速检测卡，能快速检测分辨出食品中的扁桃仁蛋白和杏仁蛋白，特异性高，准确性高，弥补了市场上的空白。
【IPC分类】C07K16-16, C07K7-08, G01N33-68
【公开号】CN104530196
【申请号】CN201410767052
【发明人】张世伟, 赖心田, 李碧芳, 黄静敏, 王士峰, 冯荣虎, 唐栋, 马广东, 陈极锋, 杨国武
【申请人】深圳市计量质量检测研究院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日