一种秋刀鱼抗氧化肽及其分离提取方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种秋刀鱼抗氧化肽及其分离提取方法 与应用。
【背景技术】
[0002] 秋刀鱼属于中上层鱼类，价格低廉，其肉含有丰富的蛋白质。秋刀鱼蛋白及其酶 解产物中不仅含有人体所需的必需氨基酸，而且含有大量具有较高营养价值的氨基酸，如 His、Tyr和Met等具有抗氧化活性的氨基酸，因此，秋刀鱼蛋白可作为制备抗氧化活性肽的 良好来源。目前，国内外对秋刀鱼的研宄主要集中在贮藏和捕捞方面，虽然也有少数的研宄 者为了提高秋刀鱼的附加值，对其加工副产物进行了研宄，并提取了不同部位的有效成分 用于工业中，但也仅仅是集中在鱼鳞和内脏两方面，而对秋刀鱼蛋白制备抗氧化肽的研宄 则很少。
[0003] 国外在抗氧化活性肽研宄方面走在世界的前列，且对海洋鱼类蛋白源抗氧化活性 肽有广泛的研宄，如Kim Se-Kwon等已从罗非鱼、鲑鱼、金枪鱼、鳕鱼和明太鱼中分离出不同 分子量与氨基酸结构的抗氧化活性肽段，这些肽类主要通过抑制氧化反应、减少氢过氧化 物、螯合金属离子和清除自由基而体现活性；印度SRM大学分别从竹荚鱼、金线鱼、翱翔飞 鱼和黑鲳鱼中分离出的四肽、五肽、六肽和七肽，均具有较强的抗氧化活性及显著的自由基 清除活性。而我国对抗氧化活性肽的研宄则起步较晚，且对抗氧化活性肽的研宄多为植物 蛋白。因此，在寻找抗氧化活性肽的进程中，越来越多的国内学者的目光已转向动物蛋白， 尤其是海洋鱼类蛋白。近几年，随着对海洋生物研宄的深入和开发技术的提高，从海洋鱼类 蛋白中制备出安全、高效的活性肽已成为当今社会的研宄热点。秋刀鱼蛋白富含多种具有 营养价值的氨基酸，目前这些氨基酸尚未得到充分利用，造成资源的浪费。
【发明内容】
[0004] 为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种秋刀 鱼抗氧化肽。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述秋刀鱼抗氧化肽的分离提取方法。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述秋刀鱼抗氧化肽的应用。
[0007] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0008] 一种秋刀鱼抗氧化肽，所述抗氧化肽具有Ser-Gly-Ala-Ala-Met的氨基酸序列。 [0009] 上述秋刀鱼抗氧化肽的分离提取方法，包括以下操作步骤：
[0010] (1)将秋刀鱼去头及内脏，血水清洗干净后绞成鱼糜，将鱼糜与水按质量比为1 : (2?4)混合，加入蛋白酶酶解4?12h，灭酶，冷却后离心取上清液，得到秋刀鱼蛋白酶解 产物（PSPHs);
[0011] (2)用大孔吸附树脂对PSPHs进行分离，依次用蒸馏水及体积分数为10 %?29%、 30 %?49 %、50 %?69 %和70 %?90 %的乙醇溶液梯度洗脱，收集30 %?49 %乙醇溶液 洗脱的组分，冷冻干燥，得到肽粉I ;
[0012] (3)将肽粉I用葡聚糖凝胶色谱柱分离，以蒸馏水为流动相进行洗脱，按洗脱的时 间先后依次得到三个组分，收集最后洗脱的组分，冷冻干燥，得到肽粉II ;
[0013] (4)将肽粉II溶于水后，用反相高效液相色谱柱进一步纯化，依次用乙腈的体积 百分比分别为2%?9%、10%?19%、20%?39%和40%?55%的乙腈-三氟乙酸水溶 液为流动相进行洗脱，收集10 %?19 %的乙腈-三氟乙酸水溶液洗脱的组分，冷冻干燥，即 得秋刀鱼抗氧化肽。
[0014] 步骤（1)中所述的蛋白酶为风味蛋白酶或胰酶中的一种或两种，蛋白酶添加量为 500?1500U/g蛋白；所述酶解的pH为6. 5?8. 5,酶解温度为45?55 °C。
[0015] 步骤⑴中所述的灭酶是指在85?100°C下保温10?30min ;所述的离心是指在 1500?4000g的离心力下离心10?30min。
[0016] 步骤（2)中所述的大孔吸附树脂优选HP-20树脂。
[0017] 步骤（3)中所述的葡聚糖凝胶色谱柱优选S印hadex G-25葡聚糖凝胶色谱柱。
[0018] 步骤（4)中所述的反相高效液相色谱柱优选C18柱；所述三氟乙酸水溶液是指体 积分数为〇. 1%?0.2%的三氟乙酸水溶液。
[0019] 上述秋刀鱼抗氧化肽在食品、化妆品和医药领域中的应用。
[0020] 通过本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
[0021] (1)本发明的秋刀鱼抗氧化肽为短肽，分子量为43?a，易被人体吸收，且具有较 强的抗氧化活性，其氧自由基吸收能力为谷胱甘肽的4. 47倍，为粗肽的10倍左右，安全、无 毒和高效的秋刀鱼抗氧化肽可以代替一些化学合成抗氧化剂应用到食品工业中提高食品 稳定性；
[0022] (2)本发明利用酶解技术及特定分离提纯技术得到一种高活性抗氧化肽，不仅提 高秋刀鱼产业的经济效益，而且提高了秋刀鱼资源的利用率和附加值；
[0023] (3)本发明运用了大孔吸附树脂分离纯化秋刀鱼多肽，与以往常用的分离纯化技 术不同，大孔吸附树脂可以有效的除去酶解产物中的无机盐，而盐的大量存在不仅影响到 肽作为食品的安全性，还影响到肽的活性和风味；本发明制备出的抗氧化肽溶液无苦味、腥 味，口感良好，较粗肽的风味有明显改善，解决了因活性肽带有不同程度的苦味而限制了秋 刀鱼蛋白应用的问题。
【附图说明】
[0024] 图1实施例5的HP-20大孔吸附树脂分离后得到的五个组分的吸光度；
[0025] 图2为实施例5的S印hadexG-25葡聚糖凝胶色谱柱分离后得到的三个组分的吸 光度；
[0026] 图3为实施例5的反相高效液相色谱柱XBridge? prep C18柱分离的五个组分的 谱图；
[0027] 图4为实施例5得到的秋刀鱼抗氧化肽的氨基酸序列的质谱分析图；
[0028] 图5为实施例5的S印hadexG-25葡聚糖凝胶色谱柱分离后得到的三个组分的抗 氧化活性测定图；
[0029] 图6为实施例5的反相高效液相色谱柱XBridge? pr印C18柱分离得到的五个组 分的抗氧化活性测定图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0031] 实施例1
[0032] (1)将秋刀鱼去头及内脏，血水清洗干净后绞成鱼糜，将鱼糜与水按质量比1:2 混合，加入风味蛋白酶，添加量为1500U/g蛋白，在pH为6. 5、温度为45°C条件下酶解4h ; 85°C下保温30min，在1500g的离心力下离心30min，取上清液，得到秋刀鱼蛋白酶解产物 (PSPHs)，水解度为 13. 10% ±0.72% ;
[0033] (2)用HP-20大孔吸附树脂对PSPHs进行分离，上样后依次用蒸馏水及体积分数 为10%、30%、50%和70%乙醇溶液梯度洗脱，收集30%乙醇溶液洗脱的组分，冷冻干燥， 得到肽粉I ;
[0034] (3)将肽粉I用S印hadex G-25葡聚糖凝胶色谱柱分离，以蒸馏水为流动相进行洗 脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集最后洗脱的组分，冷冻干燥，得到肽粉II ;
[0035] (4)将肽粉II溶于水后，用反相高效液相色谱柱XBridge? pr印C18柱进一步 纯化，依次用乙腈的体积百分比分别为2 %、10 %、20 %和40 %的乙腈-三氟乙酸水溶液 (0. 1% V/V三氟乙酸水溶液）为流动相进行洗脱，收集10%的乙腈-三氟乙酸水溶液洗脱 的组分，冷冻干燥，即得秋刀鱼抗氧化肽。
[0036] 本实施例得到的秋刀鱼抗氧化肽，用质谱法进行序列分析，从一级质谱产生的分 子离子中选择m/z为436. 4338作为母离子，进入二级质谱，经过序列分析，得到该肽的氨基 酸序列为 Ser-Gly-Ala-Ala-Met。
[0037] 实施例2
[0038] (1)将秋刀鱼去头及内脏，血水清洗干净后绞成鱼糜，将鱼糜与水按质量比1:2混 合，加入胰酶，添加量为500U/g蛋白，在pH为8. 5、温度为55°C条件下酶解8h ;100°C下保 温lOmin，在4000g的离心力下离心lOmin，取上清液，得到秋刀鱼蛋白酶解产物（PSPHs)，水 解度为 15. 58% ±0. 55% ;
[0039] (2)用HP-20大孔吸附树脂对PSPHs进行分离，上样后依次用蒸馏水及体积分数 为29 %、49 %、69 %和90 %乙醇溶液梯度洗脱，收集49 %乙醇溶液洗脱的组分，冷冻干燥， 得到肽粉I ;
[0040] (3)将肽粉I用S印hadex G-25葡聚糖凝胶色谱柱分离，以蒸馏水为流动相进行洗 脱，按洗脱的时间先后依次得到三个组分，收集最后洗脱的组分，冷冻干燥，得到肽粉II;
[0041] (4)将肽粉II溶于水后，用反相高效液相色谱柱XBridge? pr印C18柱进一步 纯化，依次用乙腈的体积百分比分别为9 %、19 %、39 %和55 %的乙腈-三氟乙酸水溶液 (0. 2% V/V三氟乙酸水溶液）为流动相进行洗脱，收集19%的乙腈-三氟乙酸水溶液洗脱 的组分，冷冻干燥，即得秋刀鱼抗氧化肽。
[0042] 本实施例得到的秋刀鱼抗氧化肽，用质谱法进行序列分析，从一级质谱产生的分