专利名称：：酪氨酸酶衍生的分离肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及衍生自酪氨酸酶的分离肽及其应用，所说肽是由HLA-A2和HLA-B44分子呈递的。另外，本发明涉及鉴别被诊断患有细胞异常状态的个体之能力，其中细胞异常状态的异常细胞呈递这些肽和HLA-A2和HLA-B44的复合物，还涉及呈递的肽及其衍生物。背景和现有技术哺乳动物免疫系统识别外源和外来材料并发生反应的过程是一个复杂的过程，该系统的一个重要的方面是T细胞应答。这种应答要求T细胞识别称作为人白细胞抗原(“HLA”)或者主要组织相容性复合物(“HMCs”)的细胞表面分子和肽形成的复合物并与之发生作用。这些肽来源于被也能呈递HLA/MHC分子的细胞加工的较大分子。参见例如Maleetal.，AdvancedImmunology(J.P.LipincottCompany，1987)，特别是第6-10章。由于要求T细胞特异于HLA分子和一种肽的特定结合，所以T细胞和HLA/肽的复合物的相互作用受到限制。如果不存在特定的T细胞，即使存在其配体复合物也没有T细胞应答。同样，如果没有特定的复合物但存在T细胞，也不发生应答。其机理涉及免疫系统的外来材料的应答，自身免疫病理学，和对细胞异常的应答。最近，更多的研究集中于将蛋白质加工为HLA结合肽的原理，在这方面，参见Barinaga，Science257880(1992)；Fremontelal.，Science257919(1992)Matsumuraetal.，Science257927(1992)；Latronetal.，Science257964(1992)。在癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机理，例如PCT申请PCT/US92/04354，1992年5月22申请，1992年11月26日公开，作为本文的参考，其中公开了一个基因族，它被加工为肽，该肽依次在细胞表面表达，从而导致由特异性CTLs裂解肿瘤细胞。据说这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，并且将由此产生的肽称作为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。有关该基因族的其它信息参见Traversarietal.，Immunogenetics35145(1992；vanderBruggenetal.，Science2541643(1991)。在美国专利申请系列号938,334(作为本文的参考)中，公开了与HLA-A1分子结合的九肽。该参考文献告诉我们，如果已知特定肽与特定HLA分子的特异性，应该可以预期该特定肽与一种HLA分子结合，但不与另一种结合。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。因此尽管对作为特定的HLA分子的配体的特定肽的鉴别具有诊断和治疗意义，但他们仅与有特定HLA分子表型的个体相关。在该领域内还需要作进一步的研究，因为细胞异常状态并不局限于一个特定的HLA表型，进行有目的治疗需要一些已经公开的异常细胞表型知识。酪氨酸酶催化将酪氨酸转化为脱羟基苯基丙氨酸或者“DOPA”的反应并且显示选择性的在黑素细胞上表达(Mullerelal.，EMBOJ72715(1988))，在Kwon，U.S.PatentNO.4,898,814最早报道有关人的该酶的cDNA。由Bouchardetal.，J.Exp.Med.1692029(1989)的最近报道提供了稍微有差异的序列。对于鉴别该酶的抑制剂已经花费了大量的精力，因为它与色素沉着疾病有关。该文献的一些例子包括Jinbow，wo9116302；Mishimaetal.，U.S.PatentNO.5，077,059，和Nazzaropor，U.S.PatentNo.4,818,768，技术人员对其它公开类似物质的文献是熟知的。美国专利申请08/081,673(1993年6月23日申请，作为参考文献)公开了可以将酪氨酸以类似于外源抗原或TRAP分子的方式处理，即，发现对于特定的细胞异常状态，例如黑素瘤，在异常细胞中酪氨酸酶被加工并且由此产生的一种肽与HLA分子形成一种复合物。发现这些复合物可被胞溶性T细胞(“CTLs”)识别，裂解此异常细胞。对这种令人惊奇的和出入意料的现象的细节已进行了讨论。目前已经发现另外的肽也可作为由HLA/AR分子呈递的肿瘤排斥抗原。这些内容在申请号NO.08/203,054,1994年2月28日申请的申请中描述，该申请作为本文参考文献。目前已经发现来源于酪氨酸酶的另外的肽是肿瘤排斥抗原，他们是由MHC分子HLA/B44呈递的，并且被胞溶性T细胞溶解。附图简述图1集合性的描述了细胞溶解研究结果，具体是图1A显示细胞系LB24/MEL的裂解；图1B显示细胞系SK29/MEL的裂解；图1C显示细胞系LB4/MEL的裂解；图1D显示细胞系SK23/MEL的裂解；图1E显示细胞系LE516/MEL的裂解；图1F显示细胞系SK29/MEL.1.22的裂解；该细胞系已经失去了HLA-A2表达能力；图1G显示MZ2-MEL失去溶解能力；图1H显示对NK靶K562进行研究的溶解情况；图1I显示在用编码HLA-A2的基因转染之后，图1F变异体失去溶解能力；图1J显示来自患者SK29的自体EBV转化的B细胞的溶解情况。图2显示对CTLIVSB的TNF释放情况进行的研究。图3描述了CTL210/9的TNF释放情况的研究。图4描述肽YMNGTMSQV被胞溶性T细胞克隆CTL-IVSB识别但不被胞溶性T细胞克隆CTL2/9识别。图5显示肽YMNGTMSQV不被胞溶性T细胞克隆CTL210/9识别。图6显示在各种细胞，包括那些在其表面呈递HLA-B44的细胞进行的TNF释放试验的结果。图7集合性的显示利用本申请中描述的肽在三个不同细胞系上进行的一系列铬释放试验。图7A显示使用SEQIDNo4肽进行的试验。图7B显示使用SEQIDNo5肽的结果。图7C显示使用SEQIDNo2肽进行的试验获得的结果。在图7中，利用标记“○”表示细胞系T2，用“□”表示不能呈递HLA-A2的MZ2-MEL，以及用“●”表示已经被转染能呈递HLA-A2的MZ2-MEL。实施例12描述了这些检测试验。图8A和8B显示利用能呈递MHC分子HLA-B44的细胞系和胞溶性T细胞克隆22/31(下文中称为“CTL22/31”)进行的研究。在图8A中，用单克隆抗体W6/32预培养细胞系(“RosiEBV”)，而图8B中没有进行预培养。优选实施例的详细描述实施例1在下面的试验中使用黑素瘤细胞系SK29-MEL(在文献中也称作为SKMEL-29)和LB24-MEL，这两种细胞系已经被研究者使用了许多年。从患者SK29(AV)和LB2(这些患者也分别是SKMEL-29和LB24-MEL的来源)获得含有单核血细胞的样品。将黑素瘤细胞系与含有单核血细胞的样品接触。观察该混合物中黑素瘤细胞系的溶解情况，这种溶解作用表明在样品中存在特异于由黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子的复合物的胞溶性T细胞(“CTLs”)。所使用的溶解试验是由Herinetal.，Int.J.Cancer39390-396(1987)，作为本文参考文献，呈递的铬释放试验。但是下文中描述了该检测法，体外培养靶黑素瘤细胞，然后以107细胞/ml的浓度重悬于补充了10mMHEPES和30％FCS的DMEM中，并在37℃用200μCi/ml的Na(51Cr)O4培养45分钟。被标记的细胞用补充了10mMHEPES的DMEM洗涤3次。然后重悬于补充了10mMHEPES和30％FCS的DMEM中，之后将含有103细胞的100μl的样品分布到96孔微滴板。在100μl的相同培养基中加入PBLs样品，设置两个相同的试验组。将平板以100g离心4分钟，在37℃，5.5％CO2中培养4小时。将平板再次离心，收集100μl的上清液并且计数。按下列公式计算51Cr的释放百分数51Cr的释放百分数＝(ER－SR)/(MR－SR)×100其中ER是观察到的试验51Cr的释放量，SR是通过将103标记细胞在200μl的培养基中单独培养检测到的自发释放量，MR是通过向靶细胞中加入100μl0.3％TritonX-100获得的最大释放量。通过有限稀释将显示强CTL活性的单核血样品扩增和克隆，利用相同的方法进行再次筛选。用相同的方法检测靶K562细胞。如果使用EBV转化的B细胞(EBV-B细胞)，唯一的变化是用补充了5％的Hank’s培养基替代DMEM培养基。利用这些试验可从患者SK29(AV)中分离出CTL克隆“IVSB”以及从患者LB24分离出CTL克隆210/9。在图1A，B，G和I中提供了试验结果，具体地说，可以看到两种CTLs可以裂解两种黑素瘤细胞系，K562和EBVB细胞系没有发生溶解。实施例2对所描述的CTLs抗其它黑素瘤细胞系的能力进行检测，以确定这些靶是否是其它黑素瘤细胞系共有的。对于LB4.MEL，SK23.MEL(也称为SKMEL-23)和LE516.MEL按实施例1中描述的溶解试验进行研究。图1C，D和E组显示克隆溶解这些细胞系。已知所检测的细胞系是HLA-A2型，结果暗示CTLs特异于肽和HLA-A2形成的复合物，通过对失去了HLA-A2表达能力的SK29-MEL变异体进行检测可以证明这种暗示。图1F组显示这些结果，没有克隆能溶解失去HLA的变异体。然而，当用SK29-MEL的HLA-A2基因转染变异体，而且重新检测时，观察到溶解。因此可以总结出呈递的分子是HLA-A2。实施例3一旦鉴别出呈递的HLA分子，就可完成鉴别该分子的研究，下文中称该分子为“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，该分子是所呈递的肽的来源。为此，从细胞系SK29-MEL.1中分离总RNA，该细胞是SK29-MEL的亚克隆。利用寡聚-dT结合试剂盒，和熟知的技术分离该RNA。一旦获得总RNA，再用标准方法将其转录为cDNA。然后根据制造商说明，将该cDNA连接到EcoRI衔接头上并克隆到pcDNA-I/Amp质粒的EcoRI位点。然后将重组质粒电穿孔到大肠杆菌JM101(电穿孔条件在25μfarads，2500v1个脉冲)。用氨苄青霉素(50μg/ml)选择被转染的细菌，然后划分到各200个克隆的700个集合中，每个集合代表约100个不同cDNA，如分析结果所示约50％质粒含有一个插入片段。使每个集合扩增到饱和，根据Maniatis等人在MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarbor，N.Y.，1992)描述的碱裂解，乙酸钾沉淀和酚提取法分离质粒DNA。不使用铯梯度离心。实施例4然后将经扩增的质粒转染到真核细胞中。以15,000个细胞/孔的浓度将COS-7细胞样品接种到含有添加了10％胎牛血清的Dulbeco’s改良的Eagles培养基(“DMEM”)的组织培养平底微孔中。在37℃将细胞培养过夜，除去培养基，然后用30μl/孔的DMEM培养基替代，所述DMEM培养基含有10％Nu血清，400μg/mlDEAE-葡聚糖，100μM氯喹，100ng质粒pcDNA-I/Amp-A2和100ng的上文中描述的一个集合中的cDNA文库DNA。质粒pcDNA-I/Amp-A2含有来自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃培养4小时之后，除去培养基，并用含有10％DMSO的PBS50μl替代。2分钟后除去该培养基，并用补充了10％FCS的200μl的DMEM替代。在培养基进行这种变更之后，将COS细胞在37℃培养48小时。然后滗去培养基，并将上面描述的CTL克隆各200个细胞加入到100μl的Iscove培养基中，该培养基含有10％库存人血清。如果使用克隆210/9，则使用补充了25U/mlIL-2的培养基。24小时之后，除去上清液，然后按Traversaroetal.，Immunogenetics35145-152(1992)的描述，在WEHI细胞进行检测以确定TNF的含量，所述文献引入本文作参考。用IVSB检测700个孔，696个显示1ml中含有0.6至4pg之间的TNF，其余的四个孔含有10和20pg/ml之间的TNF。用CTL210/9检测的同源孔显示相似的，明显更高的值。图2和3呈递了这些资料。实施例5进一步的实验中对鉴别为高生产者的四个集合中的三个(编号“123”，“181”和“384”)进行选择。具体地说，将细菌克隆，并且对于每个集合对570细菌进行检测。从其中提取质粒DNA，并以类似于上文中的方式转染到COS细胞的一个新样品中，再次检测细胞对CTL210/9和CTLIVSB的刺激作用。在123号集合中发现阳性克隆(“p123.B2”)，并在384号集合中发现一个阳性克隆(“p384.C6”)。通过实施用cDNA和HLA-A2基因转染的COS细胞和仅用HLA-A2转染的COS细胞进行的比较试验获得了由CTLs识别的转染细胞的可信证据。通过在WEHI细胞中检测而测出CTL上清液中TNF释放量。利用MTT检测存活的WEHI细胞的光密度值。结果列于表1中。表1cDNA(123.B2)没有cDNA+试验10.0870.502试验20.1080.562对于cDNA和HLA-A其WEHIOD的值相当于24Pg/ml，而对于对照相应值为2.3Pg/ml。从阳性克隆中提取出质粒，并按本领域已知技术进行测序。序列研究结果显示该质粒插入物几乎相同于酪氨酸酶的cDNA，如由Bouchardetal.，J.Exp.Med.1692029(1989)描述，引入本文作参考。因此，一种天然存在的分子(即酪氨酸酶)具有肿瘤排斥抗原前体的作用并可被加工形成一种肿瘤排斥抗原，该抗原存在于细胞的表面，并与HLA-A2形成一种复合物，从而刺激CTL克隆的溶解。被鉴别分子的核酸序列显示于SEQIDNO1中。实施例6由Chomezetal.，Immunogenetics35241(1992)报道的以前的工作已经证明含有编码一个抗原肽的序列的小基因片段导致该肽的表达。该项研究(其全文引入本文作参考)表明对上文中描述的和SEQIDNO1中描述的人酪氨酸酶cDNA的小部分序列进行了克隆。利用实施例1-5中描述的方法，将该cDNA的各个片段和编码HLA-A2的基因一起共转染到COS-7细胞中，并检测TNF的释放量。这些试验可对约400个碱基对片段进行检测，当在其转染试验中使用时，该片段可促进TNF从上文中讨论的胞溶性T细胞克隆CTLIVSB中释放，显示出对呈递HLA-A2的细胞具有特异性。所使用的400个碱基片段对应于SEQIDNO1的碱基711-1152。从该片段密码子推导出氨基酸序列，然后将该序列与由Hunt等人，Science2551261(1992)，和Falk等人，Nature351290(1991)提供的资料进行比较，两篇文献引入本文作为参考。这种参考文献讨论了呈递HLA-A2的肽的一致序列。具体地说，Hunt讨论了九肽，其中在第二位上总发现Leu或Ile，Leu是“占优势的残基”。所描述的第9个残基是具有脂肪族烃侧链的一个残基，Val是该位置上占优势的残基。Hunt讨论了第二位为Leu时的强信号，以及为Met时的中等强度信号，在第6位为Val，Len，Ile或Thr之一，第9位为Val或Leu，具有Val时是特别强的。基于比较结果，合成九肽，然后检测其对呈递HLA-A2的细胞是否敏感。为此，使用丧失酪氨酸酶的变异细胞系SK29-MEL1.218和T202LB。将需检测的不同浓度的肽与胞溶性T细胞克隆CTLIVSB或胞溶性T细胞克隆CTL2/9一起加入到细胞系中。上文中讨论的以前的研究工作已经确定前一克隆裂解呈递HLA-A2的表达酪氨酸酶细胞，后一克隆没有此作用。在37℃，含有51Cr的溶液中，用或不用抗HLA-A2抗体MA2.1培养失去酪氨酸酶的变异体一小时，所述抗体使游离HLA-A2分子变得稳定。在该试验中，将细胞洗四次，然后用浓度从100μM降到0.01μM的不同稀释度的肽进行保温。30分钟之后，以E/T比例为40/1的浓度加入效应细胞，四个小时之后，收集100λ上清液，并检测放射活性。图4显示由九肽TyrMetAsnGlyThrMetSerGlnVal(SEQIDNO2)获得的结果。下文中称作为SEQIDNO2的该肽相应于列于SEQIDNO1中的酪氨酸酶的cDNA序列的第1129-1155残基。由CTL克隆IVSB识别出HLA-A2和该肽的复合物。在一个平行试验中，已经证明来自于LB24患者的CTL克隆CTL210/9并不识别HLA-A2和SEQIDNO2的肽形成的复合物，虽然它识别HLA-A2和酪氨酸酶衍生的肽形成的复合物。因此，将酪氨酸酶加工为至少一种其他的肽，如果由HLA-A2分子呈递该肽，则可被CTL克隆识别。实施例7在下面实验中，使用不是编码SEQIDNO2肽的第二个基因片段，该片段起始于SEQIDNO1的第一位碱基并结束于1101位碱基(即EcoRI-SphI片段)。按上文中描述的方式对胞溶性T细胞克隆CTL210/9(上文中讨论)抗转染了该片段的COS-7细胞的抗性进行检测。也对CTLIVSB进行检测。这些结果显示LB24-CTL210/9识别用该片段转染的表达HLA-A2的细胞的表面上的抗原，但CTLIVSB并不识别。因此，第二个肿瘤排斥抗原肽来源于酪氨酸酶。实施例8为了进一步定义由LB24-CTL210/9识别的肿瘤排斥抗原，完成下列实验。将对应于SEQIDNO1的碱基451-1158的第二个片段与编码HLA-A2的基因一起转染到COS细胞中，并对TNF释放进行检测。该序列可刺激TNF从克隆SK29-CTLIVSB(20pg/ml)中释放，但不能刺激从LB24-CTL210/9(3.8pg/ml)释放。这些结果证实两个CTL克隆识别不同的肽，并且由LB24-CTL210/识别的肽是由1-451区编码。实施例9对由cDNA片段1-451编码的酪氨酸酶衍生的肽进行分析，分析其中已知与HLA-A2结合的共有序列。合成对应于这些共有序列的肽，并检测其使呈递HLA-A2的细胞致敏的能力。为此，使用两个酪氨酸酶阴性黑素瘤细胞系(即，NA8-MEL和MZ2-MEL2.2，已用HLA-A2转染)，以及细胞系T2，如由Salter等人，Immunogenetics21235-246(1985)描述的细胞系T2。用51Cr，和特异于HLA-A2的单克隆抗体MA.2，1，于37℃将细胞培养50分钟，随后进行洗涤(参见Bodmeretal.，Nature342443-446(1989)，引入本文作参考)。将靶细胞用不同浓度的肽，和用LB24-CTL克隆210/5或210/9进行培养，培养4小时之后检测铬释放百分数。发现肽MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu(SEQIDNO3)是具活性的。在此概述的其他实验中，前面已证明可识别YMNGTMSQV的CTL-结果概述于下列表2-4中表2肽YMNGTMSQVMLLAVLYCLL(1120-1155)(25-54)SK29-CTL-IVSB+-LB24-CTL-210/5-+LB24-CTL-210/9-+表3由LB24-CTL210/5和210/9和SK29-CTLIVSB介导的由酪氨酸酶肽致敏的MZ2-2.2-A2的3/93裂解效应细胞肽剂量MZ2.2.2-A2抗-A2*LB24-CTLMLLAVLYCLL10μM18210/5(LAUS17-5)317(44∶1)116YMNGTMSQV30M1(MAINZ)10131LB24-CTLMLLAVLYCLL10μM18210/9(LAUS17-5)317(30∶1)115YMNGTMSQV30M1(MAINZ)10131SK29-CTLMLLAVLYCLL10μM1IVSB(LAUS17-5)31(40∶1)11YMNGTMSQV30μM68(MAINZ)1068362*靶细胞用Cr51和单抗MA2.1(抗-HLA-A2)培养50分钟，然后洗3次。它们用各种不同浓度的肽培养30分钟。按所指定(E∶T)比例加入CTL细胞。培养4小时之后检测特定的Cr51释放百分数。表4由LB24-CTL210/5和210/9或SK29-CTLIVSB识别的酪氨酸酶肽的检测(Cr51特异性释放的百分数)效应细胞肽剂量NA8-MEL*MZ2-2.2∶A2T2LB24-CTL.MLLAVLYCLL10μM303136210/5(LAUS17-5)32327351172026(41∶1)300nM61716100285303520000LB24-CTL.MLLAVLYCLL10μM141921210/9(LAUS17-5)3131720191413(26∶1)300nM395100111300100010SK29-CTL.YMNGTMSQV10μM303136IVSB(MAINZ)33844521274046(42∶1)300nM1422341003132130191010133303410100040特异性释放339259198最大释放269416931206％111314实施例10利用CTL克隆22/31完成其他实验。前面已经证明该克隆可溶解自体黑素瘤细胞系MZ2-MEL中的亚细胞系MZ2-MEL.43，但不溶解其他亚细胞系，例如MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL61.2，也不溶解自体EBV转化的B细胞，或者杀伤细胞系K562(参见VandenEyndeetal.，Int.J.Cancer44634-640(1989)。由MZ2-MEL.43呈递的抗原称作为抗原C。在包括本申请的母申请中报道的研究工作中，发现酪氨酸酶基因编码一种由大多数表达HLA-A2黑素瘤的自体CTLs识别的一种抗原。通过PCR扩增可检测细胞MZ2-MEL的亚系中该基因的表达。发现MZ2-MEL.43克隆是阳性的，而其他MZ2-MEL克隆，例如MZ2-MEL.3.0是阴性。酪氨酸酶基因的表达与抗原MZ2-C的相关性表明MZ2-C可能是一种肿瘤排斥抗原，它来源于酪氨酸酶，并且是被由MZ2-MEL表达的HLA分子呈递的。该细胞系并不表达HLA-A2，这表明如果所呈递的酪氨酸酶衍生的肽一种TRA，则涉及第二种HLA分子。进行鉴别那一种HLA分子给CTL22/31呈递了抗原C的研究。为此，从MZ2-MEL.43cDNA文库中分离已知位于细胞表面上的HLA分子的cDNA克隆即HLA-A29，HLA-B37，HLA-B44.02和HLA-C克隆10，然后克隆到表达载体pcDNAI/Amp.中。然后用这些构建体之一或含有HLA-A1，以及编码酪氨酸酶(SEQIDNO1)的cDNA的构建体转染受体COS7细胞。共转染按上文中列出的方法进行。一天之后加入CTL22/31，并且24小时之后，通过按照Traversari等人(见上文)的方法用对WEHI-164-13的胞溶性的检测结果确定TNF释放。图6显示仅在由HLA-B44和酪氨酸酶转染的细胞存在的条件下由CTL22/31释放TNF。由此得出结论HLA-B44呈递了酪氨酸酶衍生的肿瘤排斥抗源。实施例11上文中描述的实验特别显示了十聚体MLLAVLYCLL有效地诱导呈递HLA-A2细胞的溶解。已公认MHC分子呈递九肽。为此，完成对两个九聚体进行检测的试验，其中实验是以得到阳性结果的十肽为基础的。具体地说，删除了第一或第十个氨基酸以制备两个肽，即MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeu(SEQIDNO4)LeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu(SEQIDNO5)按照前面实施例中给出的对浓度为10μM-1nM范围内的十肽进行检测的方法对这些肽进行检测。使用三个现存细胞，概述于下列表5中，“T2”是一种突变的人细胞系，“CEMX721.174T2”由Salter，Immunogenetics21235(1985)描述，该细胞系呈递HLA-A2，“G2.2”是细胞系MZ2-MEL变异体，已用编码HLA-A2的基因转染该变异体。缩写“G2.2.5”代表了一种并不表达HLA-A2的变异体。在与胞溶性T细胞克隆接触之前将所有细胞与单克隆抗体MA2.1一起培养。该步骤使所谓“自由”MHC分子稳定，尽管其出现的机理并不是熟知的，并利用了效应细胞CTLs210/5和210/9。结果列于下文表5中，结果显示在10μM浓度时，与CTL克隆210/5一起使用时SEQIDNO4的九聚体效率为2倍，但用210/9克隆时其效率高4倍，而SEQIDNO5的九聚体在诱导裂解方面是无效的。实施例12在进一步的实验中，利用肽SEQIDNO4和5，以及SEQIDNO2完成铬释放试验。靶细胞是先前已用HLA-A2转染的异体黑素瘤细胞即MZ2-MEL和呈递HLA-A2的、但具有抗原加工缺陷而导致呈递外源肽能力增加的细胞系T2(Cerundoloetal.Nature345-449(1990))。所有细胞用单克隆抗体MA2.1预滴定50分钟。用各种浓度的肽培养细胞30分钟，然后，以效应细胞靶细胞的比例为60加入CTL克隆210/9和ISVB之一。按上文中描述的方法，四小时之后测量释放的铬。结果列于图7，即图7A-7C中。SEQIDNO4肽使细胞对CTL210/9致敏，而DEQIDNO5不能。在前面实施例中已注意到SEQIDNO6使细胞对CTLIVSB致敏。表5表5(续)表5(续)实施例13然后完成紧接着实施例10中列出的实验之后的研究，以便对由HLA-B44呈递的抗原肽进行定义。为此，将对应于酪氨酸酶cDNA序列的片段的cDNA序列与编码HLA-B44的基因一起共转染到COS-7细胞中。基本上按上文实施例6中描述的方案实施。使用上文中讨论的胞溶性T细胞克隆22/31确定TNF释放量。两个片段，即碱基片段1-611和427-1134诱导TNF释放，该结果表明所呈递的肽是位于重叠区。根据该结果，对更短的片段进行检测。从385位，442位，514位和574位起始的片段也能诱导TNF的释放，而从579和585位起始的片段却不能。这些结果又暗示按照标准方法合成的13个氨基酸的肽起始于第574位。然后将该肽用于试验中以确定其是否被CTL22/31诱导溶解，下文表6显示13聚体提供了两个EBV转染的细胞系，它们表达对溶解敏感的HLA-B44。表610F94类型13聚体surEBV-1</tables>下文中将对更短的肽进行检测。对应于核苷酸碱基574-604位的十聚体肽，即SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAla(SEQIDNO7)可以刺激溶解，正如肽SerGluIleTrpArgAspIleAspPhe(SEQIDNO8)一样。相反没有识别出九聚体GluIleTrpArgAspIleAspPheAla(SEQIDNO9)肽。下面表7中概括了这些结果，也描述于附图8中。由Burrows等人，J.Virol643974(1990)报道的唯一一种与HLA-B44结合的其他肽是GluGluAsnLeuLeuAspPheValArgPhe(SEQIDNO10)。上文中描述的资料表明第二位的Glu和第9位的Phe可以给HLA-B44提供“锚着”残基。表7在B44上的10M94肽酪氨酸酶</tables>以前的实验证明将酪氨酸酶加工为肿瘤排斥抗原前体，导致得到的肿瘤排斥抗原与至少某些异常细胞例如具HLA-A2或HLA-B44表型的黑素瘤细胞上的分子形成一个复合物。该复合物被CTLs识别后，使呈递该复合物的细胞被裂解。该观察结果具有治疗和诊断意义，这也是本发明的特点。就治疗方法而言，产生特异于呈递上述复合物的异常细胞的CTLs的观察结果预示了各种治疗途径，一种这样的途径是给患有所述表现型的异常细胞的患者施用特异于该复合物的CTLs。体外研制这样的CTLs是本领域内技术人员熟知的。具体地说，将细胞样品(例如血细胞)与呈递该复合物的细胞相接触，并且能够刺激特定的CTL进行增殖。该靶细胞可以是一种转染子，例如上文中描述类型的COS细胞。这些转染子在其表面上呈递了所需复合物，并且当与所需CTL结合时，刺激其增殖。为了使本领域内技术人员能够制备这些CTLs，已经按照布达佩斯条约规定将含有所需基因的载体即pcDNA-1/Amp1(HLA-A2)和p123.B2(人酪氨酸酶)寄存于巴斯德学院，寄存号分别为NO.I1275和I1276。COS细胞，例如本领域内广泛使用的那些，也是另外的合适的宿主细胞。对于详细的治疗方法，称为过继性转移(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Reddeletal.，Science257238(7-10-92)；Lynchetal.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991)；Kastetal.，Cell59603-614(11-17-89))，将呈递所需复合物的细胞与CTLs结合，从而导致特异于CTLs的细胞增殖。然后将增生的CTLs施用给患有细胞异常的患者，所述细胞异常的特征在于异常细胞呈递特定的复合物。然后CTLs溶解异常细胞，从而达到预期治疗目的。上述治疗方法假设至少一些患者的异常细胞呈递了一种或多种HLA/酪氨酸酶衍生的肽的复合物。这可以非常容易地确定，例如利用上文中讨论的转染子可识别CTLs，并且一旦分离，就可与患者的异常细胞样品一起用于确定体外溶解情况。如果观察到溶解，然后可使用在该治疗方法中的特异性CTLs来减轻与异常细胞相关的症状。利用标准检测方法，用简单的步骤就可检测异常细胞的HLA表现型，并且利用例如PCR技术通过扩增可确定酪氨酸酶的表达。许多不同的HLA分子呈递来自于酪氨酸酶的TRAs这一事实增加了适合作为本文中讨论的治疗法的患者的个体数目。过断性转移不是本发明可用的唯一治疗形式。利用许多方法也可以体外激发CTLs。上文中阐明了一种途径，即利用表达该复合物的非增殖性细胞，在该方法中使用的细胞是那些通常表达所述复合物的细胞，例如被辐射的黑素瘤细胞或者用呈递该复合物所需的一或二种基因转染的细胞。Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114(1991年1月)列举了这些途径，显示了在一种治疗方式中表达HPVE7肽的转染细胞的应用。可使用各种细胞类型，同样，可以使用携带一或两种所需基因的载体。病毒或细菌载体是特别优选的。在这些系统中，由例如一种痘苗病毒或细菌BCG携带所需基因，得到的材料称为“感染”宿主细胞。从而导致细胞呈递所需复合物，并由自体CTLs识别，然后增殖。通过将酪氨酸酶本身与一种促进其掺入到呈递HLA-A2细胞中的佐剂结合可达到相似效果。然后将酶加工以产生HLA分子的肽配体。前面讨论中涉及“异常细胞”和“细胞异常”，这些术语具有最广泛意义上的含意，并且是指其中所指细胞至少显示一种特性的情形，该特性指明它们不同于其特异性类型的正常细胞。异常特性的例子包括形态和生化改变，例如细胞异常包括肿瘤，例如黑素瘤，自身免疫紊乱等等。本发明还呈递了用于鉴别针对CTL靶的前体的方法。当靶细胞是肿瘤时，这些前体是指肿瘤排斥抗原，但必须指出异常细胞不是肿瘤时，不能将该分子称为肿瘤排斥抗原。实质上，本方法涉及鉴别一种作为上面讨论的类型的胞溶性T细胞的靶的细胞。一旦鉴别出这样一种细胞，就可将总RNA转化为一种cDNA文库，然后将其转染到能呈递一种抗原的细胞样品中，所述抗原与有关的HLA分子形成复合物。将该转染子与上文中讨论的CTL接触，再者，观察到CTL的靶击作用(溶解和/或TNF生产)。然后对被裂解的这些转染子进行处理，以去除cDNA，并进行测序，并且按照该方式可鉴别出异常状态的前体例如肿瘤排斥抗原前体。本发明的其他方面对本领域技术人员而言是显而易见的，并在此不再重复。已经使用的术语和表示方式是用作为描述的术语。不是为了限制发明，并不打算使用这样的术语和表达方式而排除具有相同特性的等价体或其部分，因为应认识到各种可能的修改都在本发明范围内。序列表(1)一般信息(i)申请人Wolfel，Thomas；VanPel，Aline；Brichard，Vincent；Boon-Falleur，Thierry(ii)发明名称酪氨酸酶衍生的分离肽及其应用(iii)序列数10(iv)联系地址(A)联系人Felfe&Lvnch(B)街道805ThirdAvenue(C)城市纽约市(D)州纽约(F)邮编10022(v)计算机可读形式(A)媒介类型5.25寸磁盘，360kb存储(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)本申请资料(A)申请号08/233,305(B)申请日1994年4月26日(C)分类514(vi)本申请资料(A)申请号08/203,054(B)申请日1994年2月28日(vii)在先申请资料(A)申请号08/081,673(B)申请日1993年6月23日(vii)在先申请资料(A)申请号08/054,714(B)申请日1993年4月28日(vii)在先申请资料(A)申请号07/994,928(B)申请日1992年12月22日(xiii)律师/代理人信息(A)姓名Hanson，NormanD(B)注册号30，946(C)文档号LUD5360.1(ix)通讯信息(A)电话(212)688-9200(B)传真(212)838-3884(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度1894bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO1GGAAGAATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAG48GlyArgMetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeuTrpSerPheGln-15-10-5ACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTG96ThrSerAlaGlyHisPheProArgAlaCysValSerSerLysAsnLeu1510ATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGT144MetGlyLysGluCysCysProProTrpSerGlyAspArgSerProCys15202530GGCCAGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAAT192GlyGlnLeuSerGlyArgGlySerCysGlnAsnIleLeuLeuSerAsn354045GCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGAG240AlaProLeuGlyProGlnPheProPheThrGlyValAspAspArgGlu505560TCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAAC288SerTrpProSerValPheTyrAsnArgThrCysGlnCysSerGlyAsn657075TTCATGGGATTCAACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCA336PheMetGlyPheAsnCysGlyAsnCysLysPheGlyPheTrpGlyPro808590AACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGATTTG384AsnCysThrGluArgArgLeuLeuValArgArgAsnIlePheAspLeu95100105110AGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAG432SerAlaProGluLysAspLysPhePheAlaTyrLeuThrLeuAlaLys115120125CATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGGGACCTATGGCCAA480HisThrIleSerSerAspTyrValIleProIleGlyThrTyrGlyGln130135140ATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGAC528MetLysAsnGlySerThrProMetPheAsnAspIleAsnIleTyrAsp145150155CTCTTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGG576LeuPheValTrpIleHisTyrTyrValSerMetAspAlaLeuLeuGly160165170GGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGCT624GlyTyrGluIleTrpArgAspIleAspPheAlaHisGluAlaProAla175180185190TTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATC672PheLeuProTrpHisArgLeuPheLeuLeuArgTrpGluGlnGlyIle195200205CAGAAGCTGACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGG720GlnLysLeuThrGlyAspGlyAsnPheThrIleProTyrTrpAspTrp210215220CGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAGTACATGGGAGGT768ArgAspAlaGluLysCysAspIleCysThrAspGlyTyrMetGlyGly225230235CAGCACCCCACAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCC816GlnHisProThrAsnProAsnLeuLeuSerProAlaSerPhePheSer240245250TCTTGGCAGATTGTCTGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAG864SerTrpGlnIleValCysSerArgLeuGluGluTyrAsnSerHisGln255260265270TCTTTATGCAATGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAATCCTGGA912SerLeuCysAsnGlyThrProGluGlyProLeuArgArgAsnProGly275280285AACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTA960AsnHisAspLysSerArgThrProArgLeuProSerSerAlaAspVal290295300GAATTTTGCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAA1008GluPheCysLeuSerLeuThrGlnTyrGluSerGlySerMetAspLys305310315GCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCA1056AlaAlaAsnPheSerPheArgAsnThrLeuGluGlyPheAlsSerPro320325330CTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTG1104LeuThrGlyIleAlaAspAlaSerGlnSerSerMetHisAsnAlaLeu335340345350CACATCTATATGAATGGAACAATGTCCCAGGTACAGGGATCTGCCAAC1152HisIleTyrMetAsnGlyThrMetSerGlnMetGlnGlySerAlaAsn355360365GATCCTATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGlTGACAGTATTTTTGAG1200AspProIlePheLeuLeuHisHisAlaPheValAspSerIlePheGlu370375380CAGTGGCTCCAAAGGCACCGTCCTCTTCAAGAAGTTTATCCAGAAGCC1248GlnTrpLeuArgArgHisArgProLeuGlnGluValTyrProGluAla385390395AATGCACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTACATGGTTCCTTTTATA1296AsnAlaProIleGlyHisAsnArgGluSerTyrMetValProPheIle400405410CCACTGTACAGAAATGGTGATTTCTTTATTTCATCCAAAGATCTGGGC1344ProLeuTyrArgAsnGlyAspPhePheIleSerSerLysAspLeuGly415420425430TATGACTATAGCTATCTACAAGATTCAGACCCAGACTCTTTTCAAGAC1392TyrAspTyrSerTyrLeuGlnAspSerAspProAspSerPheGlnAsp435440445TACATTAAGTCCTATTTGGAACAAGCGAGTCGGATCTGGTCATGGCTC1440TyrIleLysSerTyrLeuGlyGlnAlaSerArgIleTrpSerTrpLeu450455460CTTGGGGCGGCGATGGTAGGGGCCGTCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGG1488LeuGlyAlaAlaMetValGlyAlaValLeuThrAlaLeuLeuAlaGly465470475CTTGTGAGCTTGCTGTGTCGTCACAAGAGAAAGCAGCTTCCTGAAGAA1536LeuValSerLeuLeuCysArgHisLysArgLysGlnLeuProGluGlu480485490AAGCAGCCACTCCTCATGGAGAAAGAGGATTACCACAGCTTGTATCAG1584LysGlnProLeuLeuMetGluLysGluAspTyrHisSerLeuTyrGln495500505510AGCCATTTA1593SerHisLeu513TAAAAGGCTTAGGCAATAGAGTAGGGCCAAAAAGCCTGACCTCACTCTAACTCAAAGTAA1653TGTCCAGGTTCCCAGAGAATATCTGCTGGTATTTTTCTGTAAAGACCATTTGCAAAATTG1713TAACCTAATACAAAGTGTAGCCTTCTTCCAACTCAGGTAGAACACACCTGTCTTTGTCTT1773GCTGTTTTCACTCAGCCCTTTTAACATTTTCCCCTAAGCCCATATGTCTAAGGAAAGGAT1833GCTATTTGGTAATGAGGAACTGTTATTTGTATGTGAATTAAAGTGCTCTTATTTTAAAAA1893A1894(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构单链(xi)序列描述SEQIDNO2TyrMetAsnGlyThrMetSerGlnVal5(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构单链(xi)序列描述SEQIDNO3MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu510(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO4MetLeuLeuAlaValLeuTyrCysLeu5(2)SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO5LeuLeuAlaValLeuTyrCysLeuLeu5(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)长度13个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO6SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAlaHisGluAla5l0(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO7SerGluIleTrpArgAspIleAspPheAla510(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO8SerGluIleTrpArgAspIleAspPhe5(2)SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO9GluIleTrpArgAspIleAspPheAla5(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQIDNO10GluGluAsnLeuLeuAspPheValArgPhe510权利要求1.用于鉴别一种候选患者的方法，该候选患者适用于用特异于MHC分子和酪氨酸酶衍生的肽形成的复合物的治疗剂进给治疗，复合物中的肽选自于下列组SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8，该方法包括(i)将来自患者的异常细胞样品与特异于所说复合物的胞溶性T细胞接触，并且(ii)确定至少部分所述异常细胞样品发生的溶解，指明该候选患者适用于所述治疗。2.根据权利要求1所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。3.根据权利要求1所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。4.用于治疗患有细胞异常的患者的方法，包括给所述患者施用一定量的药剂，该药剂促进一种胞溶性T细胞对在其表面呈递MHC分子和一种酪氨酸酶衍生物肽形成的复合物的细胞进行应答，所述肽选自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8的组，该药剂量足以刺激对其表面呈递所述复合物的异常细胞产生应答。5.根据权利要求3的方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。6.根据权利要求4所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。7.根据权利要求4所述方法，其中所述药剂包括一种编码人酪氨酸酶的载体。8.根据权利要求7所述方法，其中所述药剂进一步包括编码HLA-A2的第二载体。9.根据权利要求7所述方法，其中所述药剂进一步包括编码HLA-B44的第二载体。10.根据权利要求7所述方法，其中所述载体还编码HLA-A2。11.根据权利要求7所述方法，其中所述载体还编码HLA-B44。12.根据权利要求4所述方法，其中所述药剂是一种在其表面呈递所述复合物的非增殖细胞的样品。13.治疗细胞异常的方法，该方法包括给患有细胞异常的患者施用一定量的足以使所述异常细胞溶解的特异于所述复合物的胞溶性T细胞，所述细胞异常的特征在于在异常细胞表面呈递一种MHC分子和酪氨酸酶衍生的肽的复合物，所述肽选自于下列组SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8。14.根据权利要求13所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。15.根据权利要求13所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。16.根据权利要求13所述方法，其中所述胞溶性T细胞是自体的。17.离体的胞溶性T细胞，特异于选自于HLA-A2组的一种MHC分子和选自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8组的酪氨酸酶衍生肽形成的复合物。18.根据权利要求17所述的离体的胞溶性T细胞，特异于HLA-A2和SEQIDNO4形成的复合物。19.根据权利要求17所述的离体的胞溶性T细胞，特异于HLA-B44和SEQIDNO7形成的复合物。20.根据权利要求17所述的离体的胞溶性T细胞，特异于HLA-B44和SEQIDNO8形成的复合物。21.鉴别一种异常细胞的方法，其中异常细胞在其表面呈递MHC分子和选自于SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8组成的组的酪氨酸酶衍生的肽的复合物，该方法包括将异常细胞样品与特异于所述复合物的胞溶性T细胞接触，并确定所述异常细胞的溶解，以确定呈递所述复合物的细胞。22.根据权利要求21所述方法，其中所述MHC分子是HLA-A2。23.根据权利要求21所述方法，其中所述MHC分子是HLA-B44。24.离体的肽，选自于由SEQIDNO4，SEQIDNO7和SEQIDNO8组成的组。全文摘要本发明涉及对异常细胞表面上存在的人白细胞抗原分子和酪氨酸酶衍生的肽的复合物进行鉴别。本发明还涉及对上述观察到的异常状态进行治疗和诊断的方法。文档编号A61K38/00GK1154144SQ95191855公开日1997年7月9日申请日期1995年2月16日优先权日1994年2月28日发明者托马斯·沃尔费尔,阿兰·范佩尔,文森特·布里查德,蒂尔瑞·布恩-法勒尔申请人:路德维格癌症研究所