专利名称：糖肽类的纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的和改进的纯化糖肽类，特别是糖肽类抗生素的方法。该方法包括使该糖肽的溶液与离子交换色谱法材料接触。这种方法的产物具有令人意外的高纯度。
背景技术：
基于其化学结构，糖肽类抗生素可以分为四组(根据Yao，R.C.and Crandall，L.W.，Glycopeptides，Classification，Occurrence，andDiscovery in Glycopeptide antibiotics，ed.Nagarajan，R.，MarcelDekker，Inc.，N.Y，N.Y.，Chapter 1，pp.1-27(1994))-I组(或万古霉素型)在1和3位有脂族氨基酸；-II组(或阿伏帕星型)在1和3位有芳香族氨基酸残基；-III组(或利托菌素型)，如果在1和3位没有连接芳香族氨基酸的醚键，则与II组类似；以及-IV组(或替考拉宁型)具有与III组相同的氨基酸排列，加上附着于氨基糖上的脂肪酸残基。
在US 4,845,194A和EP 836 619 B1中列出了糖肽类抗生素的例子，其中使用了关于糖肽类抗生素的术语dalbaheptide。可以按照本领域中所公开的方法，例如通过发酵，来生产糖肽类。
替考拉宁是由垣霉素游动放线菌(Actinoplanes teichomyceticus)产生的糖肽类抗生素，并且是在旨在发现抑制细菌细胞壁合成的新微生物来源的分子的科学研究计划期间被发现的(Goldstein，B，等，Teicoplanin in Glycopeptide Antibiotics，ed.Nagarajan，R.，MarcelDekker，Inc.，N.Y，N.Y.，Chapter 8，pp.273-307(1994))。1978年对其进行了首次描述并且10年后在意大利将其引入临床实践中(Parenti，F.等，J.Chemotherapy，Vol.12，pp.5-14，(2000))。
已经公开了纯化糖肽类抗生素的许多方法。根据在EP 479086 B1中公开的方法，为了增加替考拉宁A2的提取效率，在过滤之前，将发酵液的pH调整到10和11.5之间。将发酵液的滤液加载到聚酰胺树脂上并且用过量的丙酮将替考拉宁从洗脱物中沉淀并放置3小时。滗析上清液并且过滤其余部分。用丙酮洗涤得到的滤饼，以回收替考拉宁A2。该方法有溶剂蓄积的问题，因为它在多个步骤中使用了过量的丙酮。
美国专利4,845,194公开了回收万古霉素型糖肽类抗生素(例如替考拉宁和万古霉素)的方法，其中将有2％或更少交联的阳离子交换树脂加到发酵液中以将替考拉宁吸附到树脂上，并且使用100目筛从树脂中分离菌丝体。然后，用纯化水洗涤树脂，然后洗脱回收替考拉宁。
韩国专利公开No.2000-0066479公开了生产替考拉宁A2的方法，其中将发酵液调整到pH 11并离心，并且将上清液吸附到合成吸附树脂例如XAD-16、HP-20和活性炭或硅胶上，用50到80％甲醇溶液洗脱并在减压下进行回收以获得粗粉形式的替考拉宁。将粗制替考拉宁溶解于醋酸钠溶液中并通过糖亲和色谱法进行纯化。
美国专利申请20040024177 A1公开了纯化替考拉宁A2的方法，该方法包括(i)使用合成吸附剂纯化菌株发酵液的滤液的最初预纯化步骤；(ii)使用具有高度交联的阳离子交换树脂、催化树脂或螯合树脂纯化最初预纯化溶液的第二预纯化步骤；(iii)使用反相树脂纯化第二预纯化溶液的最终纯化步骤；和(iv)形成粉末的步骤。
发明概述对可以用于大量生产高纯度的糖肽类抗生素的方法仍然存在需求。根据本发明，通过离子交换色谱法的新方法，获得高纯度的糖肽类抗生素是可能的。
本发明的发明人已令人意外地发现，通过使用一种方法获得高纯度的糖肽，特别是糖肽类抗生素是可能的，该方法包括对含糖肽的溶液进行离子交换色谱法，该溶液具有增加的盐浓度和/或增加的溶液电导率。不希望被理论束缚，预期这种方法可以用来纯化共享共同结构，也就是dalbaheptide结构的所有糖肽。
根据这种发现，提供了一种使用离子交换色谱法纯化糖肽，特别是dalbaheptide型糖肽的方法，该方法包括将该糖肽的溶液中的盐浓度升高(并从而升高溶液的电导率)至高于至今所公开的水平，同时允许糖肽与离子交换树脂结合。
发明详述本发明涉及一种纯化糖肽类抗生素或其衍生物(或含有该糖肽类抗生素或其衍生物的溶液)的方法，该方法包括a)将该糖肽的溶液中的盐浓度调节到至少0.2M，和/或将该糖肽的溶液的电导率调节到至少20mS/cm；b)使该糖肽的溶液与离子交换材料接触；c)任选地洗涤该离子交换材料；以及d)使用洗脱剂从该离子交换材料中除去该糖肽。
优选地，糖肽类抗生素是寡肽(举例来说七肽)抗生素，其特征在于多环肽核，该肽核任选地被糖基团，例如选自由下列组成的组的抗生素取代dalbaheptide，I组的糖肽(万古霉素型)；II组的糖肽(阿伏帕星型)；III组的糖肽(利托菌素型)；IV组的糖肽(替考拉宁型)；这些中任意的衍生物；这些中任意的各个因子；以及其组合。包括于该定义中的糖肽类的例子可以在Raymond C.Rao和Louise W.Crandall，″Glycopeptides Classification，Occurrence，andDiscovery″，(″Drugs and the Pharmaceutical Sciences″第63卷，Ramakrishnan Nagarajan编辑，Marcal Dekker，Inc.出版)中发现。糖肽类的其它例子被公开在美国专利Nos.4,639,433、4,643,987、4,497,802、4,698,327、5,591,714、5,840,684和5,843,889；EP 0 802 199、EP 0 801 075、EP 0667 353、WO 97/28812、WO 97/38702、WO98/52589、WO 98/52592和J.Amer.Chem.Soc.，1996，118，13107-13108；J.Amer.Chem.Soc.，1997，119，12041-12047；和J.Amer.Chem.Soc.，1994，116，4573-4590中。代表性的糖肽类包括鉴定为A477、A35512、A40926、A41030、A42867、A47934、A80407、A82846、A83850、A84575、AB-65、阿克拉宁、类放线菌素、阿达星、阿伏帕星、远青霉素、Balhimycin、Chloroorientiein、氯多孢菌素、Decaplanin、N-去甲万古霉素、伊瑞霉素、Galacardin、Helvecardin、伊肽菌素、凯勃孢囊菌素、LL-AM374、甘露糖肽素、MM45289、MM47756、MM47761、MM49721、MM47766、MM55260、MM55266、MM55270、MM56597、MM56598、OA-7653、Orenticin、寡子菌素、利托菌素、瑞斯托霉素、Synmonicin、替考拉宁、UK-68597、UK-69542、UK-72051、万古霉素等的那些，以及这些中任意的衍生物。目前最令人感兴趣的待纯化的糖肽类抗生素是替考拉宁复合物(包括A2因子)，其由发酵液产生。
更优选地，糖肽选自由A40926、A84575、阿达星、凯勃孢囊菌素、MM55266、寡子菌素、万古霉素、替考拉宁复合物及其因子和这些的衍生物组成的组。
术语“衍生物”包括仍含有环状肽骨架(举例来说dalbaheptide骨架)，但与上述糖肽类具有如下不同的糖肽类直接或间接地与骨架结合的取代基被除去或用其它的取代基替换。衍生物的例子是完全或部分去糖基化的糖肽，例如糖苷配基和本领域中，例如在WO 0198328A、WO 0183521 A、WO 03018607 A、WO 03018608 A、WO 03029270A、EP 201 251 A、US 20040087494 A1、US 5,164,484 A、US 5,916,873A中和在这些专利文献的任意文献中引用的参考文献中公开的衍生物。
预期可以使用阴离子和阳离子交换材料二者，但目前优选离子交换材料是阴离子交换树脂，优选其中主链具有聚合亲水性质的阴离子交换树脂，例如Macroprep High Q Support(BioRad)。
糖肽溶液的电导率优选在15mS/cm以上，更优选在20mS/cm以上，25mS/cm以上，或30mS/cm以上。电导率可以在40mS/cm以上。
优选在离子交换过程中的盐浓度高于大约0.25M，例如高于0.30M或甚至高于0.35M或0.45M，并且优选在离子交换过程中的盐浓度低于大约2.0M，例如低于1.5M，低于1.0M或甚至低于0.7M。目前优选盐浓度在0.4到0.7M的范围内。NaCl调节可以通过测量所加的盐来进行。
与本发明联系可以用于调节溶液的盐浓度和/或电导率的盐类的例子是碱金属盐类，例如选自由下列阴离子Cl-、HSO3-、BrO3-、Br-、NO3-、ClO3-、HSO4-、HCO3-、IO3-、HPO4-、甲酸根、乙酸根和丙酸根之—的钠、钾或锂盐组成的组。目前，优选NaCl。可以使用不同盐的混合物。
可以使用(特别是与阴离子交换树脂联系)的洗脱剂的例子是酸，例如选自由下列组成的组的酸A)弱有机酸，优选乙酸或柠檬酸；或B)由弱有机酸和相应的碱组成的缓冲液，优选低于pH 4.5；和盐，例如上面限定的盐(包括其混合物)的溶液。
目前优选洗脱剂是乙酸，和/或该酸的浓度高于0.1M(例如高于0.3M、0.5M、0.8M)，并且目前优选其高于1.0M。然而，酸的浓度应低于6.0M，更优选低于4.0M。可以使用不同酸的混合物。如果将盐的水溶液用作洗脱剂，盐的浓度应优选地高于1.5M。适当的是，洗脱剂是乙酸，和/或该酸的浓度从0.1M到6.0M，更优选从1.0M到4.0M。可以使用不同酸的混合物。
本发明的具体实施方式
涉及如上方法，其进一步包括下列步骤a)获得包含产生糖肽类抗生素的微生物的粗制发酵液；b)调节该粗制发酵液的pH到pH 8和pH 12之间；和c)使发酵液与产生糖肽类抗生素的微生物(菌丝团)分离，举例来说通过离心或过滤，从而获得包含糖肽类抗生素的溶液。
优选将pH调节到9-11，并且在0到25℃之间的温度下；更优选在5和15℃之间的温度下进行分离。
为获得更纯的糖肽，本发明的方法可以含有一个或多个纯化步骤，例如选自由下列组成的组的纯化步骤a)反相色谱法，举例来说HPLC；b)吸收色谱法；c)过滤；d)反渗透；e)通过用活性炭或吸收树脂处理的脱色；f)阳离子交换色谱法；h)沉淀；i)离心；j)亲和色谱法；和k)液-液萃取，或例如选自上面的(a)到(i)。
可以用本领域技术人员已知的方式，举例来说通过冷冻干燥，从纯化的溶液中分离固体糖肽。
在描述本发明的上下文中(特别是在下列权利要求的上下文中)，术语“a”和“an”和“the”及类似所指的对象的使用应解释为覆盖单数和复数二者，除非在此另外指出或清楚地与上下文相矛盾。除非另外提到，术语“含有”、“具有”、“包括”和“包含”应解释为开放式术语(也就是，含义是“包括，但不限于”)。除非在此另外指出，在此列举的数值范围仅仅打算用作个别提及落入该范围内的每个单独的数值的速记方法，并且将每个单独的数值合并入说明书中，好象在此个别地列举它。
在此定义的所有数值应解释为“大约”值，例如“2.0M”应理解为“大约2.0M”。
在此描述的所有方法可以以任意适当的顺序进行，除非在此另外指出或另外清楚地与上下文相矛盾。在此提供的任意和全部例子，或例举性语言(举例来说，“例如”)的使用，仅仅打算更好地阐明本发明并且不造成对本发明范围的限制，除非另外要求保护。在说明书中没有语言应解释为，表示任何未要求保护的要素对实践本发明来说是必要的。
实验实施例1获得替考拉宁的水溶液实施例1a包含替考拉宁的发酵液是以本身已知的方式，例如在美国专利4,239,751中所公开的，通过发酵垣霉素游动放线菌的培养物获得的。
将来自实验室发酵罐的5L包含替考拉宁的全部培养发酵液调节到pH9.5(通过添加1M NaOH)并且在搅拌下进行培养(brought)。在室温，该溶液通过100μm深的滤器(Polygard，Millipore)进行过滤，然后在12-14℃进行超滤(500000Da，Biomax，Millipore)。残余的替考拉宁通过以批方式用4*0.5L水透滤(diafiltration)生物质进行回收。在最终澄清的溶液中，大约80％的存在于发酵液中的替考拉宁得到回收。
实施例1b将在实施例1a中获得的500ml替考拉宁发酵液用1M NaOH调节到pH9.5，并且通过在10℃实验室离心机中离心获得无细胞的溶液。在最终澄清的溶液中，大约85％的存在于发酵液中的替考拉宁得到回收。
实施例2离子交换色谱法纯化实施例2a替考拉宁因子A2(T A2)的阴离子交换色谱法纯化通过添加1M HCl，将来自实施例1a的包含0.5g产物的澄清替考拉宁溶液调节到pH 8。添加NaCl至终浓度0.5M，得到大约50mS/cm的电导率。将甲基丙烯酸酯共聚物阴离子交换树脂Macro-prep High Qsupport(Bio Rad)填充到色谱柱(内径(i.d.)1.6cm，床高12cm，容量24ml)中，并且将制备的替考拉宁溶液以3.4ml/分钟的流速加到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脱产物之前，用48ml 0.5M NaCl溶液清洗柱。在洗脱池中回收了0.42g替考拉宁，并且通过操作，相同池的HPLC纯度确实从大约70面积％增加到90面积％TA2，同时清除充分量的有色成分。
任选地，含有高NaCl浓度(也就是直到2M)的清洗步骤包括在色谱法过程中，得到还更高纯度和更少颜色的最终产物池，只有较小的替考拉宁损失。
实施例2bTA2的阴离子交换色谱法纯化通过加1M HCI，将来自实施例1a的包含0.5g产物的澄清替考拉宁溶液调节到pH8。添加NaCl至终浓度0.5M，产生大约50mS/cm的电导率。将基于琼脂糖的阴离子交换树脂Q Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)填充到色谱柱(内径(i.d.)1.6cm，床高12cm，容量24ml)中，并且将制备的替考拉宁溶液以3.4ml/分钟的流速加到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脱产物之前，用48ml 0.5M NaCl-溶液清洗柱。在洗脱池中回收了0.35g替考拉宁，并且相同池的HPLC纯度确实增加到大约85面积％TA2。
实施例2c用于纯化TA2的阴离子交换色谱法在来自实施例1a的包含0.5g产物的澄清替考拉宁溶液中，添加NaHCO3至0.7M浓度，并且通过加1M HCl将溶液的pH调节到pH 8。其后，如在实施例2b中所描述，将该溶液应用到柱上。用48ml 0.7MNaHCO3-溶液清洗柱并用192ml 3M乙酸洗脱。在洗脱池中回收纯化的替考拉宁。
实施例2d用于纯化万古霉素的阴离子交换色谱法包含万古霉素的粗制发酵液可以根据美国专利No.5,223,413的程序进行生产并通过离心进行澄清。添加NaCl到包含0.5g产物的澄清万古霉素溶液中，至浓度为0.5M并且将溶液的pH调节到pH 10(用1M NaOH)。其后，如在实施例2a中所描述，将万古霉素溶液应用到柱上。用48ml 0.5M NaCl-溶液清洗柱然后用192ml 0.5M乙酸洗脱目的物(target)。在洗脱池中回收纯化的万古霉素。
实施例2e阳离子交换色谱法通过添加1M HCl，将来自实施例1a的包含0.5g产物的澄清替考拉宁溶液调节到pH 2.8。添加NaCl至终浓度为0.3M NaCl。将该溶液应用到用甲基丙烯酸酯共聚物阳离子交换树脂，也就是Macro-prep High S support(Bio Rad)填充的柱(i.d.1.6cm，床高12cm，容量24ml)上。用48ml 0.3M NaCl-溶液清洗柱然后用192ml 0.2MpH6.0的醋酸钠洗脱目的物。在洗脱池中回收纯化的替考拉宁。
实施例3根据实施例1a中所描述的，通过发酵生产替考拉宁并使之澄清。将包含1.0g替考拉宁的等量澄清培养液与不同量的NaCl(见下表1)混合，以得到溶液中从0到1M的NaCl。在溶解后，如在实施例2a中所描述，将样品以3.4ml/分钟的流速应用到柱上。在用192ml 3M乙酸洗脱目的物之后，用与applisate中的相等摩尔浓度的48ml NaCl-溶液清洗柱。通过标准的HPLC方法，测定替考拉宁的结合能力和HPLC纯度。选择该池，使得面积％TA2为大约90％。
现将结果总结于下表1中表1
*应用0.5g产物代替1.0g替考拉宁，也获得数值0.34并获得了数值0.36
实施例4进一步纯化澄清的(例如过滤的或离心的)发酵液可以在应用离子交换步骤之前进行纯化，和/或来自离子交换步骤的溶液可以通过应用一种或多种纯化方法，例如本身已知或如下面描述的方法进一步纯化实施例4a阴离子交换前的替考拉宁的预纯化-装载到疏水性主链上通过添加1M HCl，将来自实施例1a的包含0.5g产物的澄清替考拉宁溶液调节到pH 8，并以0.7ml/分钟的流速将其应用到用粗网眼脂族交联的聚合物(XAD7HP，Rohm & Haas)填充的柱(内径(i.d.)1.6cm，高10cm，容量20ml)上。在结合后，在通过用100ml的50/50乙醇和水混合物洗脱回收替考拉宁之前，用80ml水清洗柱。在40℃，80毫巴，使用旋转式蒸发器装置，对得到的洗脱物进行蒸发。如在实施例2a中所描述的，对得到的无乙醇的溶液进行处理。
实施例4b通过加载到疏水作用树脂上，进一步纯化离子交换池中的TA2用疏水作用树脂，也就是Octyl Sepharose Fast Flow(AmershamBiosciences)填充直径1.6cm和床高10cm(容量20ml)的柱。将来自实施例2a的洗脱池添加硫酸铵至0.1M的浓度，并在pH 2.5并且以2.5ml/分钟的流速加载到该柱上。用40ml 0.1M硫酸铵溶液清洗柱并用120ml水洗脱。在该操作中，回收了纯化的并且颜色较少的替考拉宁溶液。
实施例4c通过加载到阳离子交换树脂上，进一步纯化离子交换池中的TA2将来自实施例2a-2c之一的包含0.35-0.45g替考拉宁的产物的pH2.5的乙酸溶液，以2.5ml/分钟的流速应用到阳离子交换树脂(Macro-prep High S support(Bio Rad)，内径1.6cm，高10cm，容量20ml)上。用40ml 0.1M乙酸溶液清洗柱，接着用120ml 0.2M pH6.0的醋酸钠洗脱目的物。在洗脱池中回收纯化的替考拉宁。
实施例4d通过活性炭过滤对离子交换池中的TA2脱色在通过固定的活性炭过滤器(millistak+，13cm2filterarea，Millipore)过滤之前，将在实施例2a中收集的洗脱池添加75ml乙醇成50/50vol％混合物。该过滤器用25ml 50/50vol％水/乙醇混合物冲洗。在几乎无色的产物溶液中回收替考拉宁。
实施例4e通过大小排阻色谱法对离子交换池中的TA2脱色将来自实施例2a的10ml洗脱池以1ml/分钟的流速加载到30ml大小排阻柱(Superdex 30 prepgrade，Amersham Biosciences)上。样品中大于替考拉宁的有色成分在替考拉宁之前被洗脱并由此被除去。
实施例4f通过添加有机溶剂，沉淀离子交换池中的TA2通过添加1370ml丙酮至终浓度为95％，使来自实施例2a的洗脱池内的替考拉宁从溶液中沉淀。通过过滤收获沉淀并且随后用10ml丙酮清洗滤饼两次。其后在40℃真空炉中干燥滤饼。在干燥的滤饼中回收纯化的替考拉宁。
在此描述了本发明优选的具体实施方式
，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。那些优选具体实施方式
的变化对本领域的普通技术人员来说，在阅读了上文描述后可变得显而易见。熟练的技术人员能提升在此公开的方法。发明人预期熟练的技术人员适当的时候应用这类变化，并且发明人打算以与在此具体描述的不同的实施方式实施本发明。因此，本发明包括按适用法律所允许的、在此附加的权利要求中列举的主题的所有修改和等价物。此外，本发明包括在所有可能的变化中的上面所述要素的任意组合，除非在此另外指出或另外清楚地与上下文相矛盾。上面提到的专利文献和科学论文中的每一篇通过参考在此将其全部并入本申请。
权利要求
1.一种纯化糖肽类抗生素的方法，该方法包括a)将所述糖肽的溶液中的盐浓度调节到至少0.2M，和/或将所述糖肽的溶液的电导率调节到至少20mS/cm；b)使所述糖肽的溶液与离子交换材料接触；c)任选地洗涤所述离子交换材料；以及d)使用洗脱剂，从所述离子交换材料除去所述糖肽。
2.根据权利要求1的方法，其中将所述糖肽的溶液的电导率调节至20mS/cm以上。
3.根据任意前述权利要求的方法，其中所述糖肽类抗生素选自由下列物质组成的组dalbaheptide，I组的糖肽(万古霉素型)；II组的糖肽(阿伏帕星型)；III组的糖肽(利托菌素型)；IV组的糖肽(替考拉宁型)；这些中任意的各个因子；这些中任意的衍生物；及其组合。
4.根据任意前述权利要求的方法，其中所述糖肽类抗生素选自由替考拉宁和万古霉素组成的组。
5.根据任意前述权利要求的方法，其中所述离子交换材料是阴离子交换树脂，优选其中主链具有聚合亲水性质的阴离子交换树脂。
6.根据任意前述权利要求的方法，其中所述糖肽的溶液的电导率在30mS/cm以上。
7.根据任意前述权利要求的方法，其中在离子交换过程中盐浓度高于大约0.3M。
8.根据任意前述权利要求的方法，其中在离子交换过程中盐浓度低于大约1.5M。
9.根据任意前述权利要求的方法，其中添加盐，例如选自由下列盐组成的组的碱金属盐下列阴离子Cl-、HSO3-、BrO3-、Br-、NO3-、ClO3-、HSO4-、HCO3-、IO3-、HPO4-、甲酸根、乙酸根和丙酸根之一的钠、钾或锂盐；优选NaCl；用于调节溶液的盐浓度和/或电导率。
10.根据前述权利要求的方法，其中所述洗脱剂是酸或盐的溶液。
11.根据前述权利要求的方法，其中所述洗脱剂是酸，其选自由下列物质组成的组A)弱有机酸，优选乙酸或柠檬酸；以及B)由弱有机酸和相应的碱组成的缓冲液，优选地低于pH4.5；并且优选其中该酸的浓度在0.1M至5.0M的范围内。
12.含有糖肽类抗生素的溶液，其中该溶液的盐浓度为至少0.2M，和/或其中所述糖肽的溶液的电导率为至少20mS/cm。
13.权利要求12中要求保护的溶液，其中所述糖肽类抗生素选自由替考拉宁和万古霉素组成的组。
14.一种从权利要求12中要求保护的溶液中沉淀TA2的方法，该方法包括向其中添加有机溶剂，例如丙酮。
15.权利要求14中要求保护的方法，其中所述溶液是无色的。
全文摘要
一种新的和改进的纯化糖肽类，特别是糖肽类抗生素的方法。该方法包括使该糖肽的溶液与离子交换色谱法材料接触。这种方法的产物具有令人意外的高纯度。
文档编号C07K9/00GK101031582SQ200580032804
公开日2007年9月5日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年10月27日
发明者L·阿斯文, K·兰道格, K·阿斯多普赫斯 申请人:阿尔法马股份公司