蝶酸及其缀合物的合成和纯化的制作方法

专利名称：蝶酸及其缀合物的合成和纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及蝶酸和蝶酸衍生物的纯化，以及涉及与其它化合物 缀合的i茱酸和蝶酸的类似物和衍生物的纯化。本发明还涉及制备与 其它化合物缀合的蝶酸和蝶酸的类似物和衍生物的方法。本发明还 涉及用与其它化合物缀合的蝶酸和蝶酸的类似物和衍生物治疗患者 的方法。
背景
蝶酸是制备叶酸酯衍生物的 一 种常规原料，可将其与药物结合 以用作治疗上的缀合物(conjugates),所述缀合物包括以维生素受体为 基础的耙标作用缀合物。维生素-药物缀合物可被靶向作用于例如独 特表达、过度表达或优先表达维生素受体的癌细胞。例如， 一直使 用蝶酸作为制备一种缀合物的原料，所述缀合物包含一种通过丫羧基 连接的亚乙基二胺桥连接于荧光素的叶酸衍生物。这种缀合物在美 国专利申请序列号09/822，379中描迷，该专利公开内容结合到本发 明中作为参考。所述缀合物被用于以荧光素标记病原性细胞(如癌细 胞)，使癌细胞为抗原性的，以使其能被宿主免疫系统识别和清除。
蝶酸可通过各种常规方法制备，所述方法包括合成、叶酸的凝: 生物降解、叶酸的酶降解、叶酸的水解以及其它常规方法。 一般来
说，通过这些方法制备的蝶酸通常可被相当量的叶酸污染。例如，
经酶降解制备的蝶酸可含有25%的叶酸。因此，需要有效的方法除 去叶酸污染物以及源于蝶酸制备的其它杂质。
可使用合成方法制备维生素-药物缀合物，包括蝶酸的缀合物。 在某些情况下，那些合成方法还可以导致副产物、杂质或其它污染 物的形成。因此，需要合成和/或纯化方法来避免形成这些副产物、 杂质或其它污染物，或者除去这些副产物、杂质或源于维生素-药物 缀合物的其它污染物。
发明概述
本发明描述纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的方法。在通过层 析法纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的一个示例性实施方案中，本 发明所述的方法包括以下步骤(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组 合的溶液与离子交换层析载体(s叩port)接触；(b)用pH约为10或10 以上的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的第 一 种流分 (fraction); (c)将第一种流分的pH降低至约3或3以下；以及(d)沉 淀蝶酸、蝶酸衍生物或其组合。
在通过层析法纯化蝶酸、蝶酸衍生物及其组合的另 一 示例性实 施方案中，本发明所述的方法包括以下步骤(a)使包含蝶酸、蝶酸 衍生物或其组合的溶液与阴离子交换层析载体接触；和(b)洗脱包含 蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的笫一种流分。
本发明所述的方法还可任选包括洗脱包含叶酸、叶酸衍生物或 其组合的第二种流分的步骤(e)，其中第 一种流分和第二种流分基本 分离。实际的分离包括通过时间、通过预定的流分数目或者其它定 量或定性的判定而确定的分离，其表明在第一和第二种流分洗脱期 间，笫一和笫二种流分基本上不重叠。
脂、阴离子交换树脂、糖基树脂、糖基离子交换树脂、糖基阴离子 交换树脂等。本发明所述层析方法中的流动相包括^(旦不限于具有pH约为10或10以上、约11或11以上或者具有pH范围为约11-13的 水相。在一示例性变化方面，流动相不含或基本不含氨或其盐。本 发明所述层析方法中的流动相还可任选包括有机共溶剂，如丙酮、 四氢呋喃、乙腈、醇类(包括MeOH、 EtOH等)以及其它溶剂等。
在另 一示例性实施方案中，描述纯化包含蝶酸或其衍生物和焚 光素或其衍生物的缀合物的方法。在一方面，那些方法包括以下步 骤(a)使包含所述缀合物的溶液与第一种反相层析载体接触；(b)用 流动相洗脱包含所述缀合物的磷酸盐复合物(compex)的笫 一 种流 分，该流动相包含磷酸盐，且pH范围约为6-8; (c)使笫一种流分与 第二种反相层析载体接触；以及(d)用含水的流动相洗脱包含所述 缀合物的第二种流分，其中所述笫二种流分基本上无磷酸盐。
C8树脂、C18树脂、其封端变体(capped versions)等。本发明所述层 析方法中的流动相包括但不限于水相，其具有的pH为近中性或者稍 孩i中性以上，包括pH范围约7.1-7.7，如pH约为7.4。在一示例性 的变化方面，流动相包括一或多种磷酸盐。在另一示例性的变化方 面，流动相不含或基本不含磷酸盐。本发明所述层析方法中的流动 相还可任选包括有机共溶剂，如MeOH、 EtOH、丙酮、四氢p夫喃、 乙腈等。
在另 一示例性实施方案中，进行本发明所述方法得到纯化的化 合物和组合物，包括蝶酸、蝶酸衍生物及其组合、以及包括具有预 定纯度的包含蝶酸或其衍生物和荧光素或其衍生物的缀合物，其纯 度包括约95%或以上、98%或以上以及99%或以上的纯度。本发明 中所用的纯度测定可以基于重量百分比、摩尔百分比等计算。另外，
荧光素成分、双荧光素成分等。还应清楚的是纯度测定适用于根据 本发明所述方法纯化的化合物和组合物的溶液。在那些情况下，包 括重量百分比和摩尔百分比量度的纯度测定涉及不计溶剂的溶液的
组分。
在另一示例性实施方案中，描述制备蝶酸或其衍生物和荧光素 或其衍生物的缀合物的方法。
在另一示例性实施方案中，描述具有某些预定纯度要求的化合 物和组合物。在一方面，所述化合物和/或组合物包括蝶酸、蝶酸衍 生物及其组合。在另一方面，所述化合物和/或组合物包括蝶酸或其 衍生物与焚光素或其衍生物的缀合物。在一变化中，本发明所述的 示例性化合物和/或组合物的纯度要求包括约95%或以上、98%或以 上以及99%或以上的纯度，并可以基于重量百分数、摩尔百分数等 计。在另一变化中，本发明所述的示例性化合物和/或組合物的纯度
成分、双荧光素成分等)下的纯度测定。
在另一示例性实施方案中，描述治疗需要解除对调节或清除病 原性细胞感应的疾病的患者、哺乳动物或动物的方法。在一方面， 描述在患者、哺乳动物或动物中增强病原性细胞群的内源性免疫应 答介导的清除的方法。本发明所述示例性的方法包括给予需要解除 病情的患者、哺乳动物或动物有效量的包含配体-荧光素缀合物的组 合物的步骤。在另一示例性方面，本发明描述各种方法，其中当给 予需要解除病情的患者、哺乳动物或动物所述组合物时，所述组合 物包括预定最高水平的一或多种双荧光素组分(如不超过0.1%或 0.05。/。)或者无或基本上无一或多种双焚光素组分。
用于提供维生素-药物缀合物所迷的纯化方法联合使用。
图的简述


图1A表明在纯化蝶酸中，从DEAE纤维素柱(DE32)上洗脱的 流分在280 nm处的UV吸收。
图1B表明在纯化蝶酸中，从DEAE纤维素柱(DE32)上洗脱的
流分38的CI8反相HPLC图语(trace)。
图2表明分离的叶酸酯-焚光素缀合物对固体肿瘤生长的影响。
发明详述
本发明描述纯化蝶酸、蝶酸的衍生物和类似物和/或其组合的方 法。在一实施方案中，所述方法包括以下步骤(a)使包含蝶酸、蝶 酸的衍生物或类似物和/或其组合的溶液与离子交换层析载体接触；(b) 用pH约为10或10以上的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸的衍生物或类 似物和/或其组合的第一种流分；(c)将第一种流分的pH降低至约3 或3以下；以及(d)沉淀蝶酸、蝶酸的衍生物或类似物和/或其组合。
在一变化中，本发明所述的方法还可包括洗脱包含叶酸、叶酸 衍生物或其组合的第二种流分的步骤(e)，其中第 一种流分和第二种 流分基本分离。基本的分离可通过任何数目的客观定量或定性的标 准确定，包括但不限于经过时间、流分数目、基线评估或者其它评 估洗脱流分之间重叠度，由此评估第 一和/或第二种流分的可能交叉 污染的可能性和程度的方法。已观察到对于某些糖基层析载体或树 脂，叶酸流分在时间上先于蝶酸流分洗脱，后者在较晚时被洗脱。 例如，对于DEAE纤维素层析载体，已观察到叶酸流分在时间上先 于蝶酸流分洗脱，后者在较晚时被洗脱。然而，应清楚对于不同的 层析载体，包括不同的糖基层析栽体，应考虑到本发明所述的第一 种和笫二种流分的洗脱顺序可以改变。
在另一实施方案中，本发明所迷的方法包括以下步骤(a)使包 含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的溶液与阴离子交换层析载体接触； 和(b)洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或其组合的第一种流分。
在一种变化中，洗脱步骤包括具有pH约为11或以上或者pH 约为11.5或以上的流动相。在另一种变化中，pH范围约为11-13。 流动相的pH可通过加入各种碱来调节或获得，所迷44包括但不限于 NaOH、 K0H、 Na2C03、 NaHC03、 KHC03、 K2C03、顺4011等。
在一方面，本发明所述层析方法中的层析载体包括但不限于离
子交换树脂、阴离子.交换树脂、糖基树脂(sacchaiide-based resins)、 糖基离子交换树脂、糖基阴离子交换树脂等。糖基层析载体包括一 或多种纤维素、直链淀粉、琼脂糖、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶 (sephadex)树脂及其组合。在另一方面，糖基层析载体包括离子交换 树脂，如阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。示例性糖基离子交换 树脂包括二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素或者季胺(QA)纤维素固体载 体，如DE23、 DE32、 DE51、 DE52、 DE53和QA52,其均由Whatman 和/或Sigma获得。在一示例性变化中，层析载体是一种预溶胀的微 粒型DE52阴离子交换剂(Whatman类目号4057-200)。在另一示例性 变化中，层析载体是一种预溶胀的艰t粒型DE32阴离子交换剂。其它 固体载体包括DEAE交联葡聚糖凝胶、CM交联葡聚糖凝胶、交联 葡聚糖凝胶QA、琼脂糖凝胶QA等。
在另一实施方案中，流动相是包含水的反相流动相。在另一实 施方案中，流动相是包含水和盐的反相流动相。在另一实施方案中， 流动相是包含水和有才几溶剂的反相流动相。在另一实施方案中，流 动相是包含水、盐和有^^溶剂的反相流动相。在另一方面，流动相 基本上不含或者完全不含氨或其盐。
在另一实施方案中，流动相是包含水的在特定pH下(包括中性 或近中性的pH)的反相流动相。在一变化中，pH为稍高于中性，如 pH范围约为7.1-7.7。在一方面，流动相的pH的范围为约7.3-7.5, 或者pH在约7.4。在另一实施方案中，流动相是含水和盐的反相流 动相。在另一实施方案中，流动相是包含水和有机溶剂的反相流动 相。在另一实施方案中，流动相是包含水、盐和有机溶剂的反相流 动相。在另一方面，流动相基本上不含或者完全不含氨或其盐。
层析特性可利用相对固定组成或者相对变化组成的流动相，包 括但不限于无梯度模式(profiles)、阶跃函数、筒单梯度、复杂梯度、 线性梯度、对数梯度及其这些模式的组合等。
在另一实施方案中，本发明所迷方法中使用的流动相还可任选 包括作为組分的有机溶剂，如丙酮、四氢呋喃、乙腈、醇类(包括
MeOH、 EtOH等)以及其它溶剂等。当流动相包括两种組分时，如具 有碱性pH的水性组分和有机溶剂组分，可以以无梯度方式或者以梯 度方式，通过层析载体洗脱流动相。应清楚的是梯度方式可遵循各 种模式，包括线性、对数、双曲线、抛物线、指数、阶梯及其組合。
在另一实施方案中，柱层析中的洗脱液可通过包括但不限于下 列的任何常规技术监测，紫外(UV)吸收、荧光、折光率(RI)、液相层 析质谱(LCMS)、串联质谱法(MS/MS)等。例如，根据监测，将洗脱 液分成一或多个流分，混合含有所要求产物且具有指定阈值或阈值 以上的纯度的流分。所混合的流分包括在沉淀步骤中。
在沉淀步骤的另一实施方案中，可通过将溶液的pH降低至约3.5 或以下、约3或以下、约2.5或以下或者约2或以下，将包含在洗脱 液的流分或混合流分中的蝶酸或其类似物或衍生物沉淀出来。可通 过加入能够将pH降低至约3.5或以下、约3或以下、约2.5或以下 或者约2或以下的任何种类的酸或任何酸的组合降低pH。示例性的 酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸及其盐、磷酸及其盐、硝酸等。
在一方面，将沉淀和/或纯化的蝶酸或其类似物或衍生物纯化至 约95%纯度或以上、约96%纯度或以上、约97%纯度或以上、约98% 或纯度以上、约99%纯度或以上或者约100%的纯度。在另一方面， 所沉淀的蝶酸或其类似物或衍生物基本上不含叶酸。所沉淀的蝶酸
层析或光谱技术，如高压或高效液相层析(HPLC)、核f兹共振光谱、 TLC、 UV吸收光镨、焚光光谱等。
在另一方面，所沉淀或純化的蝶酸、蝶酸类似物和/或4莱酸衍生 物具有理解为基本纯的纯度，或者从一或多种不希望有的或不需要 的组分、杂质或污染物中基本提纯出来。例如，可将这些化合物的 纯度理解为具有小于某一百分率的一或多种组分，如约5%或以下的
杂质、约4°/。或以下的杂质、约3%或以下的杂质、约2%或以下的杂 质或者约1%或以下的杂质。类似地，可将这些化合物的纯度理解为 具有小于某一百分率的特定组分，如约5%或以下、约4%或以下、 约3%或以下、约2%或以下，或者约1%或以下的叶酸。
在另一实施方案中，蝶酸、蝶酸类似物以及蝶酸衍生物通过本 发明所述的合成方法制备。这些合成方法生成具有高的总百分纯度 的化合物，如约95%纯度或以上、约96%纯度或以上、约97%纯度 或以上、约98%纯度或以上、约99%纯度或以上或者约100%的纯度。 类似地，作为使用的合成方法的结果，无论单独使用或者与本发明 所述的纯化方法结合使用时，可将通过本发明所述合成方法制备的 这些蝶酸、蝶酸类似物以及蝶酸衍生物的纯度理解为具有小于某一 百分率的特定组分，如约5%或以下、约4%或以下、约3%或以下、 约2%或以下，或者约1 %或以下的叶酸。
应理解可以避免或除去所得到的蝶酸、蝶酸类似物、蝶酸书亍生 物或其组合中的特定组分。那些组分可通过使用本发明所述的合成
纯化方法组合获得的物质。
在一实施方案中，蝶酸或蝶酸的衍生物源于降解过程，如叶酸 或叶酸的衍生物的降解。在一方面，蝶酸或蝶酸的衍生物源于酶降 解过程，如叶酸或叶酸的衍生物的酶降解。在另一方面，虫莱酸或蝶 酸的衍生物源于纟鼓生物降解过程，如叶酸或叶酸的衍生物的樣t生物 降解。在另一方面，蝶酸或蝶酸的衍生物源于化学降解过程，如叶 酸或叶酸的衍生物的化学降解。在另一实施方案中，蝶酸或蝶酸的 衍生物源于化学合成。
在微生物降解过程的一实施方案中，通过将叶酸或其衍生物的 样本与粪产碱杆菌、假单胞菌(Psuedomonad)、假单胞ATCC 25301 、
产黄菌属、浆果产黄杆菌(flavobacterium baccalis)接触，可将叶酸或其书亍 生物水解为蝶酸。进行叶酸微生物降解的示例性条件在以下文献中 描述，Houlihan等，Anal. Biochem., 46: 1-6 (1972); Pratt et al., J Biol.Chem., 243:6367 (1968); Levy et al., J Biol, Chem., 242:2933 (1967); Scott, Methods in Enzymology, 66:657-60 (1980); Lemon et al., "Conversion of pterolyglutamic acid to pteroic acid by bacterial degradation" Archives of Biochemistry 19:311-16 (1948);这些/〉开内
容结合到本发明中作为参考。
在酶降解过程的 一 实施方案中，通过将叶酸或其衍生物的样本 与一或多种酶诸如羧肽酶(包括羧肽酶G、羧肽酶A)、酰胺酶、脂肪 酶、酯酶和蛋白酶及其组合接触，可将叶酸或其衍生物水解为蝶酸。 在羧肽酶G情况下，可在稍^喊性pH下，例如pH约7.3, ^使叶酸与 酶接触。进行叶酸酶降解的示例性条件在以下文献中描述，Harvison & Kalman, J. Med. Chem. 35:1227-33 (1992); Nomura et al., J. Org. Chem., 65:5016-21 (2000);美国专利No. 4,337,339，这些公开内容结合到本
发明中作为参考。
在化学降解过程的一实施方案中，通过在酸或碱性水解或者在
急化条件下，通常在水性介质，任选添加可溶混的有机共溶剂中， 通过接触叶酸或其衍生物的样本，可将叶酸或其衍生物水解为蝶酸。
在另一实施方案中，使用本发明所述方法纯化的蝶酸或蝶酸的 类似物或衍生物得自于常规降解或合成过程，并且受到叶酸或其类 似物或衍生物的污染。例如，将叶酸或其类似物或衍生物转化为虫莱 酸或其对应的类似物或衍生物的酶降解过程不可能发生完全转化。 因此，所得到的混合物可包括蝶酸或其衍生物、叶酸或其衍生物和/ 或酶降解过程或水解过程中形成的 一或多种部分降解或水解的中间 体产物或副产物。例如，叶酸或其衍生物的相对量在约1%-50%或者 约1%-25%的范围。
在蝶酸或i某酸衍生物的化学合成的一实施方案中，可使蝶酸或
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蝶酸的衍生物或类似物与另一分子偶合，形成维生素-药物缀合物。
在一方面，所述维生素-药物缀合物是美国专利申请序列号10/765,336 中描述的缀合物。在另一方面，所述维生素-药物缀合物例如是蝶酸 或蝶酸的类似物或衍生物与一种抗原成分的缀合物，并且包括在美 国专利申请序列号09/822,379中描述的缀合物，该专利结合到本发 明中作为参考。
在另一方面，所述维生素-药物缀合物是根据下式描述<formula>formula see original document page 23</formula>
其中V是维生素或其类似物或衍生物，L是具有约1-100个原子长度 的任选二价连接基团(linker)。所述原子选自碳、氮、氧、硅、磷、 硫等。这些原子各自任选被氢、卣素和/或一或多个官能团取代。示 例性官能团包括但不限于羟基、氰基、硝基、氧代、硫代、任选取 代的亚氨基、任选取代的羟基亚氨基、任选取代的肼基、叠氮基、 任选取代的烷基、任选取代的链烯基、任选取代的炔基、任选取代 的烷氧基、任选取代的烷硫基、任选取代的烷基磺酰基、任选取代 的烷基磺酰氧基、任选取代的烷基磺酰基氨基、任选取代的氨基、 任选取代的眵及其衍生物、任选取代的酮及其衍生物、羧酸及其衍 生物、任选取代的芳基、氨基酸的侧链、肽、其组合等。这些官能 团可结合在一起形成连接于所述原子的环状结构。这些官能团还可 与原子结合在一起形成环状结构。
在另一方面，所述维生素-药物缀合物是蝶酸或其类似物或衍生 物与荧光素或其类似物或衍生物的缀合物。在另一方面，所述维生 素-药物缀合物是式I化合物<formula>formula see original document page 24</formula> (I)
其中R1、 R2、 113和114各自独立是氢、烷基、酰基或适当选择的氮保 护基，或者W和W—起形成氮保护基；W是氢、烷基，或适当选 择的羧基保护基；m是0-4的整数；n是1-4的整数。在另一方面， 所述维生素-药物缀合物是化合物8a (式I化合物，其中R1、 R2、 R3、 R4和R5是氢，m是l,和n是l)。
流程1中表明蝶酸及其衍生物的荧光素缀合物的一示例性化学 合成法。
流程1
(a)酰胺偶合剂；(b) a-羧基的选择性脱保护；(c) H2NCH2(CH2)nNH2， n=l-4 (5); (d) 1. FITC (7); 2.任何RLR5的任选 脱保护。
其中R1、 R2、 113和114各自独立是氢、烷基、酰基或适当选择的氮保 护基，或者W和W—起形成氮保护基；W是氬、烷基，或适当选 择的羧基保护基；m是0-4的整数；和n是l-4的整数。
使保护的蝶酸类似物1与保护的氨基酸类似物2反应，形成酰 胺3。蝶酸1的R1、 R2、 113和114的适合保护基包括酰胺保护基(如乙 酰基、三氟乙酰基等)、氨基甲酸酯保护基(如tert-Boc、 Teoc、 Cbz、 Fmoc等)及其它。氨基酸类似物2的适合的保护基R5包括酯保护基(如 甲基、三甲基曱硅烷基乙基、叔丁基等)及其它。在一方面，当W是 叔丁基时，将得到的酰胺3用酸选择性保护，得到酰胺4。应清楚在 该方面，适当选择蝶酸类似物1和氨基类似物2上存在的保护基， 使得在Y-羧酸酯保护基存在下将a-羧酸酯保护基选择性脱去保护。
将酰胺3或对应的脱保护类似物4用式H2NCH2(CH2)nNH2 (其中 11=1-4)的亚烷基二胺处理，得到胺6。将该末端曱基酯移位，形成酰 胺键。将胺6用荧光素异硫氰酸酯(FITC, 7)处理，形成维生素-药物 缀合物8。
广泛的各种酰胺偶合剂和条件均可用于本发明所迷的合成中， 包括但不限于羧酸衍生物，如酰氯等；活性酯，如五氟苯基酯、雍 基苯并三唑酯等；偶合剂，如(苯并三唑-l-基氧基)三吡咯烷子基憐六 氟磷酸盐(PyBOP)、 BOP、 BOPCl、 DCC、 EDC、 HBTU、 TBTU、 PyBrOP 等。此处所述的酰胺偶合步骤的适合溶剂包括但不限于N,N-二曱基 甲酰胺(DMF)、 二曱亚砜(DMSO)、氯仿、二氯曱烷(DCM)、 N-曱基 吡咯烷酮(NMP)等。此处所述的酰胺偶合步骤可在多种温度下进行， 如约0。C-约50。C的温度范围，例如在室温下。
此处所述的脱保护步骤可按任何常规的方式进行，如使用Greene & Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis," 2d Ed., John Wiley & Sons, New York, 1"1(结合到本发明中作为参考)中所述的试剂和反应 条件。应理解的是对去保护试剂和条件进行选择以使得可进行脱保 护步骤，同时不会无意识地影响被保护的化合物上存在的其它官能团，包括其它的保护基。例如，在流程1中，保护基RS是在保护基 W存在下且不影响W下除去的。在一示例性实施方案中，保护基R5 是叔丁基酯，而保护基R4是三氟乙酰基酰胺。示例性脱去酸敏感性 保护基的脱保护剂包括但不限于三氟乙酸(TFA)、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。脱保护反应可在各种溶剂中进行，所述溶剂包括但不限 于水、DCM、 EtOAc、 AcOH等。应理解的是在反应条件中还可包括 阳离子清除剂以改善脱保护反应的速率和/或总收率，包括使用AcOH 作为溶剂。此处所述的脱保护反应可在多种温度下进行，如约0°C-约50。C的温度范围，例如在室温下。
流程1的步骤(c)可在各种溶剂中进行，包括但不限于THF、乙 醚、DMF、 DMSO、氯仿、DCM、 NMP等，并可在多种温度下进行， 如约0。C-约50°C的温度范围，例如室温。类似地，流程l的步骤(d) 可在各种溶剂中进行，包括但不限于THF、 DMF、 DMSO、氯仿、 CH2C12、 NMP、水等，并可在多种温度如约0。C-约50。C的温度范围， 例如室温下进行。可向步骤(d)所示反应中加入另外的碱，包括但不 限于通常由R'R2R3N代表的胺碱、Et3N、 N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、 吡啶、二曱基吡啶、三曱基吡啶、4-二曱氨基吡啶(DMAP)等。
应理解在与二胺H2NCH2(CH2)nNH2反应的步骤(c)中，可同时且 方便地除去某些保护基。例如，当W是酰胺保护基(如三氟乙酰基等) 时，可置换甲酯而形成y-谷氨酰胺的酰胺，并在N(10)上除去酰胺保 护基。在一变化中，选择RM吏在与二胺H2NCH2(CH2)nNH2的反应中 为稳定的。
在另一变化中，通过将i皮保护的蝶酸类似物1转化为对应的具 有离去基团的羧酸衍生物，实现蝶酸类似物1与氨基酸类似物2的 反应。可通过氨基酸类似物2的胺置换离去基团，形成酰胺3。应理 解的是可使用流程1中所示的合成法及其变化制备此处所述的蝶酸 类似物和蝶酸类似物的衍生物的焚光素缀合物。
流程2中显示另一种示例性化学合成蝶酸及其衍生物的缀合物的方法。
流程2
<formula>formula see original document page 27</formula>
(a)酰胺偶合剂；(b)氨基酸氨基的选择性保护；(c)酰胺偶合剂；(d) 亚烷基二胺的选择性脱保护；(e) 1. FITC (7); 2. R'-R5中任一个的任 选脱保护。
其中R1、 R2、 113和114各自独立是氢、烷基、酰基或适当选择的氮保 护基；W是氢、烷基或适当选择的羧基保护基；m是0-4的整数；n 是l-4的整数；和R6、 W和RS各自独立是氢或适当选择的氮保护基。 使被保护的氨基酸类似物9与被保护的亚烷基二胺10反应，形 成酰胺11。氨基酸类似物7的示例性保护基R6包括Fmoc、Cbz、tert-Boc 等。亚烷基二胺10的示例性保护基R 包括tert-Boc、 Fmoc、 Cbz等。 应清楚的是所选择的保护基能选择性除去一或多个存在的保留的保 护基，同时不改变被保护分子上保留的其它官能团的性质。将得到 的酰胺11脱保护，得到氨基酸胺12,使其与被保护的蝶酸类似物1 偶合，其中蝶酸类似物1的示例性保护基R"如本文所述，形成酰胺 13。将得到的酰胺13脱保护，得到亚烷基二胺胺6。在某些变化中， 根据羧基保护基R5性质不同，用于除去末端胺保护基R7和R8的条 件也可除去羧基保护基R5。例如，当RS是叔丁基时，R7是tert-Boc
保护基，RS是氢时，在偶极性溶剂中用酸处理可除去两种保护基。
将胺6用FITC处理，得到蝶酸-连接的FITC缀合物8。
如本文所述，广泛的各种酰胺偶合剂和条件也适用于流程2中 所述的合成中，包括但不限于羧酸衍生物，如酰氯等；活化的酯， 如五氟苯基酯、幾基苯并三唑酯等；偶合剂，如PyBOP、 BOP、 B0PC1、 DCC、 EDC、 HBTU、 TBTU、 PyBrOP等。此处所述的酰胺偶合步 骤的适合溶剂包括但不限于DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等。 此处所述的酰胺偶合步骤可在多种温度下进行，如约0。C-约50°C的 温度范围，例如在室温下。
此处所述的脱保护步骤可按任何常规的方式进行，如使用Greene & Wuts所述的试剂和反应条件。应理解的是对去保护试剂和条件进 行选择以使得可进行脱保护步骤，同时不会无意识地影响被保护的 化合物上存在的其它官能团，包括其它的保护基。例如，在流程2 中，保护基W是在保护基R5、 F7和RS存在下且不影响R5、 W和R8 下除去。在一示例性实施方案中，保护基W是Fmoc，保护基RS是 tert-Bu酯，保护基W是tert-Boc,而R8是氢。示例性脱去石咸敏感性 保护基的脱保护剂包括但不限于DBU、哌啶、吗啉、TBAF等。脱 保护反应可在各种溶剂中进行，所述溶剂包括但不限于水、THF、乙 醚、DMF、 NMP、 CH2C12、 EtOAc等。此处所述的脱保护反应可在 多种温度下进行，如约0。C-约50。C的温度范围，例如在室温下。
流程2的步骤(c)可类似于步骤(a),用偶合剂和此处所述的反应 条件进行。该步骤可各种溶剂中进行，包括但不限于THF、乙醚、 DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等，并可在多种温度下进行， 如约0。C-约50°C的温度范围，例如在室温下。类似地，流程1的步 骤(d)可在各种溶剂中进行，包括但不限于THF、 DMF、 DMSO、氯 仿、CH2C12、 NMP、水等，并可在多种温度下进行，如约0。C-约50。C 的温度范围，例如在室温下。可向步骤(d)所示的反应中加入另外的 碱，包括但不限于通常由R'R211 代表的胺碱、Et3N、 DIPEA、吡
啶、二曱基吡啶、三曱基吡啶、DMAP等。
脱保护步骤(d)可按任何常规方式进行。在一示例性实施方案中， 保护基R7是tert-Boc基，该基团在化学上对酸敏感，而其它保护基 对酸并不敏感，如作为三氟乙酰基酰胺的W或者作为曱酯的R5。在 另一示例性实施方案中，保护基RS是叔丁酯，保护基R7是tert-Boc 基团，这两个基团在化学上都对酸敏感，而其它保护基并不如此。 脱去这类酸敏感保护基的示例性脱保护剂包括但不限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。该脱保护反应可在各种溶剂中进行，包括 但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。应理解的是在反应条件中 还可包括阳离子清除剂以改善脱保护反应的速率和/或总收率，包括 使用AcOH作为溶剂。此处所述的脱保护反应可在多种温度下进行， 如约0。C-约50。C的温度范围，例如在室温下。
流程2中所述的合成法中可包括任选的脱保护步骤(e)，用以除 去化合物8上的任何保留的保护基。例如，当W是酰胺保护基而R5 是羧酸保护基时，可除去这些基团以制备化合物8所示的游离氨基 酸衍生物。在一示例性实施方案中，流程2中的偶合步骤(e)得到化 合物8的被保护形式，其中R1、 R2、 113和115是氢，W是三氟乙酰基。 通过在各种溶剂中，包括但不限于水、醇类、双相THF/水等，使被 保护的化合物8与碱包括但不限于NH40H(包括0.5M NH4OH)、 LiOH、 NaOH、 KOH、 K2C03、 NaHC03等接触，可同时除去基团R5。 例如，除去这些磁^丈感基团的反应条件的pH大于9。所述反应例如 在室温下进^f亍。
流程3中显示另一种示例性化学合成蝶酸及其衍生物的荧光素 缀合物的方法。
流程3<formula>formula see original document page 30</formula>
(a) FITC (7); (b)荧光素-丽2 (15); (c)氨基的脱保护；(d)酰胺偶合 剂；(e)羧酸基团的选择性脱保护；(f) 1.酰胺偶合剂；2. RLrs中任 一个的任选脱保护。
其中R1、 R2、 113和114各自独立是氢、烷基、酰基或适当选择的氮保 护基；W是氢、烷基或适当选择的羧基保护基；W是氢、烷基或适 当选择的羧基保护基；m是0-4的整数；n是l-4的整数；和R6、 R7 和R8各自独立是氢或适当选择的氮保护基。
被保护的亚烷基二胺16可通过以下任一方法制备(i)使亚烷 基二胺5与FITC (7)反应；(ii)使被保护的亚烷基二胺10与FITC (7) 反应；或者(iii)使被保护的氨基烷基异硫氰酸酯14与焚光素胺(15) 反应。将胺脱保护得到17。使碟酸衍生物1与三.重'(trlply)保护的氨 基酸18偶合，得到叶酸衍生物19。选择保护基rs和rs以使得各自
在不依赖于彼此的情况下被化学性地除去。除去保护基RM寻到羧酸 20，使其与胺17偶合，得到缀合物8。
如在流程3中对化合物5、 10、 14与化合物7和15反应所示的 那样，异硫氰酸酯与胺的反应(如果适合)可在各种溶剂中进行，包括 但不限于EtOH、 MeOH、 THF、 CH2C12、 DMF、 CHC13等。所述反 应可在多种温度下进行，如约0。C-约100。C的温度范围，例如在反
应中所用的溶剂的回流下进行。
类似于此处所述的脱保护反应，可按任何常规方式进行脱保护
步骤(c)。在一示例性实施方案中，保护基R7是tert-Boc基团，其在 化学上对酸敏感。脱保护这类酸敏感保护基的示例性脱保护剂包括 但不限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。该脱保护反应可在 各种溶剂中进行，包括但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。应 理解的是在反应条件中还可包括阳离子清除剂以改善脱保护反应的 速率和/或总收率，包括使用AcOH作为溶剂。此处所述脱保护反应 可在多种温度下进行，如约0。C-约50°C的温度范围，例如在室温下。
流程3的偶合步骤(d)和(f)可按类似于本发明所述步骤，用常规 偶合剂和反应条件进行。所述步骤可在各种溶剂中进行，包括但不 限于THF、乙醚、DMF、 DMSO、氯仿、CH2C12、 NMP等，并可在 多种温度下进行，如约0。C-约50。C的温度范围，例如在室温下。
类似于此处所述的脱保护反应，可按任何常规方式进行脱保护 步骤(e)。在一示例性实施方案中，保护基RS是tert-Bu酯，其在化学
限于TFA、 HC1、 HBr、 AcOH、 HC02H等。该脱保护反应可在各种 溶剂中进行，包括但不限于水、CH2C12、 EtOAc、 AcOH等。应理解 的是在反应条件中还可包括阳离子清除剂以改善脱保护反应的速率 和/或总收率，包括使用AcOH作为溶剂。此处所述的脱保护反应可 在多种温度下进行，如约0。C-约50°C的温度范围，例如在室温下。
流程3中所述的合成法中可包括任选的脱保护步骤(f),用以除 去化合物8上的任何保留的保护基。例如，当R"是酰胺保护基而R5 是羧酸保护基时，可除去这些基团以制备化合物8所示的游离氨基
酸衍生物。在一示例性实施方案中，流程3中的偶合步骤(f)得到化
合物8的被保护形式，其中R1、 112和113是氢，W是三氟乙酰基，R5 是曱基。通过在各种溶剂中，包括但不限于水、醇类、双相THF/水 等，使被保护的化合物8与包括但不限于NH40H(包括0.5MNH4OH)、 LiOH、 NaOH、 KOH、 &。03等的碱接触，可同时除去基团R4和R5。 例如，除去这些碱敏感的保护基团的反应条件的pH大于约9。所述 反应例如在室温下进行。
另外，流程3a中显示蝶酸及其衍生物的荧光素缀合物的示例性 化学合成方法。
流程3 a
(a)酰胺偶合剂；(b)氨基酸氨基的选择性保护；(c)酰胺偶合剂。
如上所示，使胺17与被保护的氨基酸类似物9偶合，形成酰胺 21。将酰胺21脱保护，得到胺22,使其与被保护的蝶酸类似物1偶 合，得到维生素-荧光素缀合物8。
应理解的是在流程1、 2和3及其变化中所示的合成还可用于制 备本文所述的蝶酸类似物以及蝶酸类似物的衍生物的荧光素缀合 物。i莱酸类似物以及蝶酸类似物的4汙生物包括但不限于亚叶酸、蝶 酰聚谷氨酸(pteropolyglutamic acid)、四氢口果呤、二氬叶酸酯、四氢叶 酸酯、氨基喋呤、曱氨喋呤、N化曱基叶酸酯、2-脱氨基羟基叶酸酯、
3，，5，-二氯-4-氨基-4-脱氧-N^曱基蝶酰基谷氨酸等，以及这些化合物 的脱氮杂和二脱氮杂类似物，如l-脱氮杂甲基叶酸、3-脱氮杂曱基叶 酸以及其它脱氮杂和二脱氮杂类似物，如l-脱氮杂、3-脱氮杂、5-脱 氮杂、8-脱氮杂和10-脱氮杂类似物，以及1,5-二脱氮杂、5,10-二脱 氮杂、8,10-二脱氮杂和5,8-二脱氮杂类似物。例如，根据此处所述的 过程和步骤，可制备包括除谷氨酸酯外，还包括一或多种氨基酸的 其它叶酸酯的类似物，或者代替谷氨酸酯的一或多种氨基酸的其它 叶酸酯的类似物。例如，在流程1、 2和3中，可将酪氨酸、半胱氨 酸、磺基丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸以及很多其它的天然和非天然 氨基酸的被保护形式取代这些流程中特别描述的被保护的谷氨酸酯 化合物。因此，本发明还包括叶酸类似物，其不同在于其作为不是 谷氨酸酯而是氨基酸的蝶酰基酰胺的叶酸酯。另外，应清楚的是还 可使用本文所述的合成法和过程，用蝶酸类似物和衍生物制备这些 酰胺。
还应清楚的是副产物、污染物、杂质和/或其它成分可在制备蝶 酸、叶酸、蝶酸和叶酸的类似物和书t生物以及4壬何这些化合物的缀 合物的过程中产生。这些副产物、污染物、杂质和/或其它成分可通 过本发明所述的纯化方法除去。在一实施方案中，所述其它成分是 叶酸。在另一实施方案中，所述其它成分是双荧光素衍生物，如所 述双荧光素衍生物。 一种示例性双荧光素衍生物是式II化合物
另一种示例性双荧光素衍生物是式m化合物 <formula>formula see original document page 34</formula>
其中n是l-4的整数。
还应清楚的是通过选择适当的合成路线或修饰合成路线，可避 免副产物、污染物或杂质。在一示例性方面，通过小心清除本发明 所述的各种合成方法和过程中的水，可基本或完全避免式II化合物。 在另一示例性方面，通过使用精确或稍小于l摩尔当量的FITC试剂， 可避免式H化合物。
在另一示例性方面，可按流程1中所示，通过使用精确1摩尔 当量或者稍小于1摩尔当量所述亚烷基二胺试剂5,可基本上或完全 避免式III化合物。在另一示例性方面，通过在加入FITC之前，在 引入所述亚烷基二胺试剂5之后，纯化反应产物使得基本除去任何 保留的所述亚烷基二胺试剂5，如纯化流程1中所示的中间体胺6以 基本上或完全除去所述亚烷基二胺试剂5，可避免式III化合物。
在另一示例性方面，可通过使用流程2中所示的合成当量的所 述亚烷基二胺(如单保护的亚烷基二胺10)，避免式III化合物。在另 一示例性方面，通过在与蝶酸、叶酸或者蝶酸或叶酸的类似物或衍 生物结合之前，按流程3所示制备FITC中间体16,可避免式III化 合物。在这个后一方面，应理解的是可通过使用精确的至少稍过量 或者例如基本超过1摩尔当量以上的所述亚烷基三胺试剂(如化合物 5),可避免式III化合物。还应理解的是在这个后一方面中，当用亚 烷基二胺试剂5制备时，可将所述产物化合物16或后来的产物(如17、 21或22)纯化，使得基本上或完全除去式III化合物。
例如，嬡酸成4U汙生物的缀A物可i甬过太劳曰；
合成，并结合本发明所述的任何方法通过，使用诸如本文所述的离 子交换层析载体来纯化。
在另一实施方案中，提供纯化包含蝶酸或其衍生物以及焚光素
或其衍生物的缀合物的方法。在一方面中，该方法包括以下步骤(a) 使包含所述缀合物的溶液与第一种反相层析载体接触；(b)用流动相 洗脱包含所述缀合物的磷酸盐复合物的第 一种流分，该流动相包括 预定pH的水；(c)使第一种流分与第二种反相层析载体接触；以及(d) 用含水的流动相洗脱包含所述缀合物的笫二种流分，其中所述第二 种流分基本上无或完全不含磷酸盐。洗脱步骤(b)可用由水和一或多 种磷酸盐制备的水性流动相进行。预定的pH范围可以为约6-8;约 7-8的范围；或者约7.1-7.5的范围，或者例如pH约为7.4。应理解 的是洗脱步骤(d)包括的流动相以基本上或完全不含磷酸盐为有利。
在一方面中，反相层析载体是一种修饰的硅胶(silica)载体，包括 但不限于C8硅胶、C18硅胶和修饰的C8和/或C18硅胶，包括覆盖 或失活的硅胶等，及其组合物。
生，然后再用于纯化或分离其它蝶酸或其类似物或衍生物的混合物。 再生包括用具有比用于分离的流动相较高的洗脱指数或洗脱力的溶 剂洗涤所述层析固体载体。例如，纯化可包括反相固体载体和包含 水(如纯水)或无机盐的水溶液的流动相。流动相还可包括有机溶剂， 如乙腈(ACN)、甲醇、四氢呋喃(THF)等。在这种示例性层析分离中， 流动相可以是水和乙腈的固定比例或可变比例的混合物，如90:10水 /乙腈、线性梯度的99:1至90:10水/乙腈等。然后，例如可通过用具 有较高洗脱指数的流动相冲洗，可将柱再生，所述流动相包括相对 于水的百分率4交高百分率的有机溶剂，如60:40或50:50水/乙腈。这 些示例性的实施方案并不起限制作用，可使用用于层析分离的任何 适合的流动相和用于柱再生的任何适合方法。
在另 一示例性实施方案中，本文描述可通过与多价阳离子(如石咸
土金属阳离子)络合，将包含蝶酸或其类似物或衍生物和焚光素或其 衍生物的缀合物纯化的方法。示例性阳离子包括但不限于镁、钩、 铍、锶、钡等。
可使用常规方法制备所述缀合物的盐，如钠和/或钾盐。例如， 通过在极性溶剂(如水)中，将所述钠或钾盐形式与多价阳离子盐溶液 混合，可进行阳离子交换。多价阳离子盐溶液可用常规盐制备，如 氯化镁、氯化4丐等。从该极性溶剂中，将得到的复合物沉淀或结晶。 应理解的是还可向该极性溶剂中加入共溶剂以促进缀合物的多价阳 离子盐的沉淀。
通过在适合的常规树脂上的离子交换层析法，可将缀合物的多 价阳离子盐再转化回中性形式或其它盐形式，如钠和钾盐。
在另 一 示例性实施方案中，提供一种治疗具有病原性细胞群(如 癌细胞)的宿主或病原性有机体的方法。例如，该方法使用分离的配 体-焚光素缀合物，其能够与癌细胞或其它病原因子高亲和性结合。 该方法通过病原性细胞表现的抗原性，致使宿主免疫系统识别和清 除它们，引起病原性细胞群的免疫应答-介导的清除的增强。在该方 法中，可按本文所述合成所述配体-荧光素缀合物，以避免至少一种
双荧光素衍生物的形成，和/或可按以上所述纯化以除去至少 一种双 荧光素书1"生物。
根据此处所述的方法和组合物，术语"分离的配体-荧光素缀合 物"指已被纯化或处理除去至少一种双荧光素衍生物的配体-荧光素 缀合物，或者指已被合成避免形成至少 一种双荧光素衍生物的配体-焚光素缀合物，或者指通过这两种方法得到的配体_荧光素缀合物。
在另 一示例性实施方案中，该方法通过使用分离的配体-荧光素 缀合物以及能够刺激内源性免疫应答的另外的治疗因子、杀细胞剂、 化疗剂、肺瘤渗透增强剂、细胞毒性免疫细胞或者抗菌剂，可利用 联合疗法增强病原性细胞群的免疫应答-介导的清除。
例如，可利用所述方法在具有病原性细胞群的宿主动物中增强
病原性细胞群的内源性免疫应答-介导的清除。该方法可用于能引起 各种病变(如癌和感染性疾病)的病原性细胞群。因此，病原性细胞群 可以是致瘤的癌细胞群，包括良性和恶性肿瘤，或者其可以是非致 瘤性的。癌细胞群可以自发产生或者通过例如宿主动物种系或体细 胞突变中存在的突变的此类过程产生，或者其可通过化学性-、病毒
性-或放射性诱发产生。可利用所述方法治疗诸如下列的癌癌、肉 瘤、淋巴瘤、何杰金氏病、黑素瘤、间皮瘤、伯基特氏淋巴瘤、鼻 咽癌、白血球过多症和骨髓瘤。癌细胞群可包括但不限于口腔、曱 状腺、内分泌、皮肤、胃、食管、喉、胰脏、结肠、膀胱、骨、印 巢、子宫颈、子宫、乳房、睾丸、前列腺、直肠、肾、肝和肺癌。
例如，病原性细胞群还可以是一种外源性病原体或含外源性病 原体的细胞群，如病毒。该方法还可用于诸如细菌、真菌、病毒、 支原体和寄生虫类外源性病原体上。可用该方法治疗的感染因子是
为革兰氏阴性或革兰氏阳性球菌或杆菌的细菌的有机体，DNA和 RNA病毒，包括但不限于DNA病毒，如乳头瘤病毒、细小病毒、 &装病毒、疱渗病毒和痘苗病毒，以及RNA病毒，如沙粒病毒、冠形 病毒、鼻病毒、呼吸合胞体病毒、流感病毒、小RNA病毒、副粘病 毒、呼肠病毒、逆转录病毒和杆状病毒。先前已在细菌性细胞上鉴 定出叶酸酯体(Kumar等，J. Biol. Chem.. 262， 7171-79 (1987))。
关键是对抗生素产生抗性的细菌，如抗生素抗性的链球菌种和 葡萄球菌种，或者是对抗生素敏感，但用抗生素治疗易引起复发的感 染，从而最终产生抗性有机体的细菌。可用所分离的配体-焚光素缀 合物结合比正常给予患者较低剂量的抗生素治疗这些有机体，以避 免这些抗生素抗性菌林的发展。该方法还适用于能引起动物疾病的 任何真菌、支原体、寄生虫或其它感染性有机体。可用本发明方法 治疗的真菌的实例包括如霉或酵母菌样生长的真菌，包括例如能引 起例如下列疾病的真菌裤菌病、组织胞浆菌病、酵母菌病、曲霉
病、隐球菌病、孢子丝菌病、球孢子菌病、巴西芽生菌病
(paracoccidio画idomycosis)和念;朱菌病。
还可利用该方法治疗寄生虫感染，包括但不限于躯体内绦虫、 血吸虫、组织虫回虫、变形虫和疰原虫属(尸/a;ymo(i/ww)、锥虫属 (Tyypafwasoma)、 利4十曼原、虫属(丄e/s/2wam'a)和弓，艮虫属(roxo/ /oswa) 引起的感染。涉及的寄生虫是那些表达叶酸受体并结合叶酸酯或蝶 酸或者叶酸酯或蝶酸的衍生物的寄生虫。
还可使用已知其抗生素活性并且对细菌细胞壁前体特异性结合 的青霉素类和头孢菌素类作为制备本方法使用的分离的配体-荧光素 缀合物的配体。所分离的配体-焚光素缀合物可直接作用于包含内源 性病原体的细胞群，其中病原体特异性抗原被优先地表达在包含病 原体的细胞表面，并起作为带有与抗原特异性结合的配体的配体受 体的作用。
例如，该方法可用于人临床医学和兽医应用。因此，包含病原 性生物种群以及用所分离的配体-荧光素缀合物治疗的宿主动物可以 是人，或者在兽医应用情况下，可以是实验室、农业、驯养或野生 动物。该方法可适用于宿主动物，包括但不限于人、实验室动物， 如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仑鼠等)、兔、猴、猩猩、驯养动物 (如狗、猫和兔)、农业用动物(如牛、马、猪、羊、山羊)以及被关养 的野生动物(如熊、熊猫、狮、虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、 海豚和鲸)。
例如，可将所述分离的配体-荧光素缀合物非肠道给予宿主动 物，例如皮内、皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射给予。在另一实 施方案中，可将所迷缀合物通过其它医学上可用的过程给予宿主动 物，并可使用任何有效剂量和适合的治疗剂型，包括延长释放的剂 型。可将该方法与以下疗法联合使用手术除瘤法、放射疗法、化 疗法或生物学疗法，如其它免疫疗法，包括但不限于单克隆抗体疗 法、用免疫调节剂治疗、免疫效应细胞的过继转移疗法、用造血生长因子、细胞因子和疫苗治疗。
例如，适合的配体包括叶酸、叶酸的类似物和彩f生物以及其它 的结合叶酸受体的分子，包括蝶酸及其衍生物和其它维生素。叶酸 酯和蝶酸衍生物包括结合叶酸受体的喋啶，如四氬蝶呤、二氬叶酸 酯、四氢叶酸酯及其脱氮杂和二脱氮杂类似物。术语"脱氮杂，，和 "二脱氮杂"类似物指本领域认可的具有代替天然存在的叶酸结构
中的1或2个氮原子的碳原子的类似物。例如，脱氮杂类似物包括l-脱氮杂、3-脱氮杂、5-脱氮杂、8-脱氮杂和10-脱氮杂类似物。二脱 氮杂类似物包括例如1,5-二脱氮杂、5,10-二脱氮杂、8,10-二脱氮杂 和5,8-二脱氮杂类似物。上述类似物结合叶酸受体。可在本发明所述 方法中使用的其它衍生物是结合叶酸受体的类似物氨基喋呤、氨曱 蝶呤(曱氨喋呤)、N^曱基叶酸酯、2-去氨基-羟基叶酸酯、去氮杂类 似物，如1-去氮杂甲基叶酸或3-去氮杂曱基叶酸和3',5'-二氯-4-氨基 -4-脱氧-N^甲基蝶酰基谷氨酸(二氯曱氨喋呤)。
可用作配体的其它适合的维生素包括烟酸、泛酸、核黄素、碌u
胺素、生物素、维生素Bu以及脂溶性维生素A、 D、 E和K(参见美 国专利Nos. 5,108,921、 5，416,016、 5,635,382和5,688,488，结合到本
发明中作为参考)。这些维生素以及结合其配体的类似物和衍生物构 成可与本发明所述步骤中的焚光素偶合的配体。
其它适合的配体包括从库筛选中鉴定的肽配体、肿瘤特异性肽、 肿瘤特异性适体、肿瘤特异性碳水化合物、肿瘤特异性单克隆或多 克隆抗体、抗体的Fab或scFv(即单链可变区域)片段，例如指向EphA2 或其它特定表达或者独特地易进入转移的癌细胞上的蛋白质的抗体 的Fab片段、源于组成化合物库(combinatorial libraries)的小有机分 子、成长因子，如EGF、 FGF、胰岛素和胰岛素样生长因子，和同 源多肽、生长激素抑制素及其类似物、转铁蛋白、脂蛋白复合物、 胆汁酸盐、选择蛋白、类固醇激素、含Arg-Gly-Asp的肽、类碎见黄醇、 各种半乳凝素、Y-阿片受体配体、缩胆嚢素A受体配体、血管紧缩素ati或AT2受体的特异性配体、过氧化物酶体增生物激活受体y 配体、(3-内酰胺抗生素、小有机分子，包括抗微生物药和其它特异性 与优先表达在肿瘤细胞表面上或感染的有机体表面上的受体结合的 分子，或者任何这些分子的片段。
对于与感染性有机体结合的配体，其关键是本领域已知能优先 结合微生物的任何分子，如抗生素或其它药物。所述方法还适用于 作为诸如抗微生物药物的分子的配体、设计以适于特定受体的结合 "袋"的配体、以受体的晶体结构为基础的配体或者作为其它细胞 表面蛋白的受体的配体，并且其中这些受体优先表达在肿瘤、细菌、 病毒、支原体、真菌、寄生虫或其它病原菌的表面上。还应考虑的 是可利用与任何肿瘤抗原或优先表达在肿瘤细胞表面上的其它分子 结合的配体。由于在病原性细胞上受体对配体的优先表达、易于与 配体结合，所述配体应具有特异性清除宿主动物中病原性细胞群的
能力。本发明还包括组合使用各分离的配体-荧光素缀合物以最大限 度地清除病原性细胞。
素及其衍生物应该能够诱发宿主动物中抗体的产生，并应能够与被 动给予的抗体结合。在一示例性实施方案中，宿主动物能通过对非 天然抗原(即焚光素)的免疫产生一种新的免疫性。自动免疫接种包括 在正常的接种疫苗安排之外，多次注射非天然抗原，以诱发这种新 的免疫性。因此，可用所述分离的配体-荧光素缀合物针对宿主动物 中的病原性细胞群先前已获得体液或细胞免疫性，以清除外来细胞 或病原性生物。
在其中宿主动物对非天然抗原(即荧光素)通过免疫接种产生一种 新的免疫性的实施方案中，可将宿主动物用连接有能提供荧光素、 半抗原、致免疫的载体的荧光素预先免疫，以建立所述新的免疫性。 也可将技术熟练人员已知的任何辅助剂，如弗氏佐剂、皂草苷佐剂、 Alum (Pierce Chemical Co.)等，与所述载体-焚光素缀合物一起给
予，以增强对荧光素的新的免疫。例如，可使用的载体包括匙孔虫
(keyhole limpet)血蓝蛋白(KLH)、鲍属软体动物瘤状(haliotis tuberculata) 血蓝蛋白(HtH)、失活的白喉毒素、失活的破伤风毒素、结核分支杆 菌(Myco^"enww fwZ ercw/ow力的纯蛋白衍生物(PPD)、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白(OVA)、 g-球蛋白、曱状腺球蛋白、肽抗原和合成 载体，如聚-L-赖氨酸、树状聚合物和脂质体。
通过使用任何本领域认可的形成复合物的方法，可将载体(如 KLH或BSA)与荧光素结合。这可包括载体与缀合物的共价、离子或 氢键结合，即或者直接或者间接通过一连接基团，如二价连接基团 连接。例如，所述荧光素-载体缀合物可以通过在所迷缀合物的各成 分上的酸、醛、羟基、氨基或肼基(hydrazo)之间形成酰胺、酯或亚胺 基键而通过共价键形成。在其中使用连接基团的实施方案中，所述 连接基团可含有约1-30个碳原子或者约2-20个碳原子。可使用低分 子量连接剂(即那些具有大约分子量为约20-500的连接剂)。连接剂 还可包括将载体与荧光素间接连接的方法，如通过中间连接剂、间 隔臂或桥接分子连接。
可通过熟练技术人员已知的任何方法，将载体-荧光素缀合物纯 化，以除去至少一种双荧光素污染物。例如，可使用超滤步骤除去 载体-荧光素缀合物中的荧光素污染物或杂质。本发明还包括包含这 些从双焚光素污染物中纯化的载体-荧光素缀合物的药用组合物。
在另一示例性实施方案中，可将直接对抗荧光素的抗体给予宿 主动物，以建立一种被动免疫力。所述抗体可以是从血清中收集的 天然抗体或者是单克隆抗体，其可以是或不可以是基因工程抗体，
包括人源化抗体。利用特定量的抗体试剂产生一种被动免疫力以及 使用其中被动性给予的抗体作用于荧光素的所分离的配体-荧光素缀 合物，为用于当患者诱发的抗体滴度不在临床上有效时提供一套标 准试剂的益处。可将所述被动给予的抗体与所述分离的配体-荧光素 缀合物"共同给予"，共同给予被定义为在给予所分离的配体-荧光
素缀合物之前、同时或之后给予抗体。
所述分离的配体-荧光素缀合物增强病原性细胞群的内源性免疫 应答介导的清除。所述内源性免疫应答可包括体液应答、细胞介导 的免疫应答和任何其它对宿主动物的内源性免疫应答，包括补体介
导的细胞溶解、抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)、 导致吞 噬的抗体调理素作用、导致编程性细胞死亡、抗增殖或分化的信号 对结合抗体的受体群集(clustering)、以及所传递半抗原的直接免疫细 胞的识别。还应考虑到该内源性免疫应答可使用调节诸如免疫细胞 繁殖和迁移此类过程的细胞因子的分泌作用。所述内源性免疫应答 可包括诸如以下此类免疫细胞类型的参与，如B细胞、T细胞(包括 辅助细胞和细胞毒性T细胞)、巨噬细胞、天然杀伤细胞、中性粒细 胞、LAK细胞等。
应注意到的是所诱发的抗体或者被动给予的抗体通过使所述分 离的配体-荧光素缀合物，优先结合这些侵袭的细胞或有机体而再作 用于肿瘤细胞或感染的有机体，并且病原性细胞将被补体介导的细 胞溶解、ADCC、抗体依赖性吞噬或者受体的抗体聚集杀死。该细胞 毒性过程还可包括其它类型的免疫应答，如细胞介导的免疫性，以 及当所吸引的存在抗原的细胞吞噬所述有害细胞，并且对清除带有 抗原的细胞或有机体的免疫系统呈现天然肺瘤抗原或外来病原体的 抗原时出现的次级应答。
可将至少 一种包含治疗因子的另 一种组合物与以上详述的方法 联合给予宿主，以增强病原性细胞群的内源性免疫应答介导的清除， 或者可给予一种以上的另外的治疗因子。所述治疗因子选自能够刺 激内源性免疫应答的化合物、化学治疗剂、抗微生物剂或者其它能 够补充所给予的分离的配体-荧光素缀合物的效能的治疗因子。此处 所述的方法可通过给予宿主除上述的缀合物外能够刺激内源性免疫 应答的选自下列的化合物或组合物进行，包括但不限于细胞因子或 免疫细胞生长因子，如白介素1-18、干细胞因子、基本的FGF、 EGF、
G-CSF、 GM-CSF、 FLK-2配体、HILDA、 MIP-la、 TGF画a、 TGF-卩、 M-CSF、 IFN-a、 IFN-j3、 IFN-y、可溶性CD23、 LIF及其组合。
在一示例性实施方案中，可4吏用治疗有效的这些细胞因子的组 合。还可使用治疗有效的这些细胞因子的组合。在一实施方案中， 例如，IL-2的治疗有效量在每日多剂量给药方案中，可使用的剂量 范围为约0.1 MHJ/mV剂量/日-60 MlU/n^/剂量/日，而IFN-a例如在 每日多剂量给药方案中，可使用的剂量范围为约0.1 MlU/m2/剂量/日 -10 MlU/m2/剂量/日(MIU =百万国际单位；m2 -人均大约体表面积)。 在另一实施方案中，使用临床有效量的IL-12和IFN-a,而在另一实 施方案中，使用临床有效量的IL-15和IFN-a。在另一实施方案中， 联合使用IL-2、 IFN-a或IFN-y和GM-CSF。所使用的治疗因子，如 IL-2、 IL-12、 IL-15、 IFN-a、 IFN-y和GM-CSF(包括其组合)，可以 是活性的天然杀伤细胞和/或T细胞。另外，所述治疗因子或其组合， 包括与干扰素和GM-CSF联合使用的白介素，可以是活性的其它免 疫效应细胞，如巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、NK细胞、NKT细 胞、T细胞、LAK细胞等。还可包括使用任何其它有效的细胞因子 组合，包括其它白介素和干扰素以及集落刺激因子的组合。
适于本发明方法使用的本身具有细胞毒性且能增强肿瘤穿透性 的化学治疗剂包括肾上腺类皮质激素、烷化剂、抗雄激素药、抗雌 激素药、雄激素、雌激素、抗代谢剂(如阿糖胞苷、噤呤类似物、嘧 啶类似物和曱氨喋呤)、白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂和其它铂 化合物，他莫昔芬、紫杉酚、环磚酰胺、植物生物碱、泼尼松、羟 基脲、替尼泊苷、抗生素(如丝裂霉素C和博来霉素)、氮芥、硝基脲、 长春新》威、长春石威、炎症和促炎症反应剂以及j壬何其它本领域^人定 的化疗剂。可与此处所述的缀合物给药辅助性给予的其它治疗剂包 括青霉素类、头孢菌素类、万古霉素、红霉素、克林霉素、利福平、 氯霉素、氨基糖苷类、庆大霉素、两性霉素B、阿昔洛韦、三氟尿苷、 更昔洛韦、齐多夫定、金刚烷胺、利巴韦#木和任何其它本领域7>认
的抗菌化合物。
在一示例性实施方案中，病原性细胞群的清除包括减少或清除 病原性有机体的肿瘤基质，从而产生治疗反应。在肿瘤情况下，所 述清除可以是清除原发性肿瘤细胞或者已转移或者处于从原发性肿 瘤中分离的过程中的细胞。本发明还包括一种预防疗法，即在通过 包括手术除瘤法、放射疗法、化疗法或生物学疗法的任何治疗途径 除去肺瘤后，防止肿瘤复发的方法。该预防性疗法可以用所述分离 的配体-焚光素缀合物初期治疗，如以每日多剂量方案治疗，和/或在 初期治疗之后的数日或数月后再进行另外的治疗或一 系列的治疗。
在另一示例性实施方案中，提供药用组合物，其包含一定量的 能有效"标记"宿主动物中病原性细胞群，并通过内源性免疫反应 或者通过共同给予的抗体来特异性地清除该细胞群的一种分离的配 体-荧光素缀合物。在另一实施方案中，所述组合物还包括一定量的 有效增强病原性细胞清除的其它因子，其选自杀细胞剂、肿瘤渗透 促进剂、化学治疗剂、抗微生物剂、细胞毒性免疫细胞和能够刺激 内源性免疫应答的化合物。药用组合物包含治疗有效量的分离的配
体-荧光素缀合物和治疗因子，所述因子可包含细胞因子，如IL-2、 IL-12或IL-15或细胞因子的组合(包括IL-2、 IL-12或IL-15)，和干
扰素，如IFN-a或IFN-Y以及干扰素、白介素，以及集落刺激因子， 如GM-CSF的组合。
所分离的配体-荧光素缀合物的单一 日剂量可依据宿主条件、所 治疗的疾病状态、其给药途径及其组织分布以及其它疗法(如放射性 治疗)的联合使用的可能性等明显变化。所给予患者的有效量取决于 患者的体表面积、体重及医生对患者病情的判断。有效的剂量范围 为约1 ng/kg-l mg/kg,约1昭/kg-500 pg/kg,或约1昭/kg-100吗/kg。
可使用任何有效的给予所述分离的配体-荧光素缀合物和所述治 疗因子的方案，使得再直接诱发对所述肿瘤细胞或感染的有机体的 抗体或者诱发对荧光素的体液应答。例如，可将所述分离的配体-荧
光素缀合物和治疗因子以单剂量给药，或者可将它们以多剂量的每 日给药方案分开给药。另外，可使用交错给药方案(例如每周1-3日) 作为每日治疗的 一种备选方案，现认为这种间断性或交错性的每曰 给药方案视为等同于每日的治疗。在一实施方案中，用多次注射分 离的配体-荧光素缀合物和所述治疗因子治疗宿主，以清除病原性细
胞群。在另一实施方案中，给宿主多次(优选约2至最多50次)注射 所述分离的配体-荧光素缀合物，例如以12-72小时的间隔或者以48-72小时的间隔。可在初次注射后，以数日或数月的间隔给患者另外 注射分离的配体-荧光素缀合物，这种另外注射可预防疾病的复发。 或者，初始注射的所述分离的配体-荧光素缀合物可预防疾病的复发。
例如，可在给予所分离的配体-焚光素缀合物之前、之后或同时， 给予宿主动物治疗因子，可将治疗因子作为包含所述缀合物的相同 组合物的一部分给予，或者可作为所分离的配体-焚光素缀合物之外 的不同组合物的部分给予。本方法中可使用含有包含治疗有效剂量 的治疗因子的任何这类治疗组合物。另外，可使用一种类型以上的 分离的配体-荧光素缀合物。例如，可联合使用蝶酸-焚光素缀合物和 核黄素-荧光素缀合物。在化疗剂和抗菌剂情况下，可将次最适量 (suboptimal dose)的治疗因子随同分离的配体焚光素缀合物以联合疗 法的方式给予，以避免宿主动物对化疗剂或抗微生物剂抗性的发展。
例如，可将分离的配体-荧光素缀合物和治疗因子经非肠道注 射，这种注射可以是腹膜内注射、皮下注射、肌内注射、静脉注射 或鞘内注射。还可用緩慢泵传递所分离的配体-焚光素缀合物和治疗 因子。非肠道剂型的实例包括在等渗盐水、5%葡萄糖或其它熟知的 药学上可接受的液体载体(如液体醇类、二醇类、酯类或酰胺类)中的 活性剂的水性溶液。非肠道剂型可以是能重新配制的冻干剂型，其 包括 一 定剂量的分离的配体-荧光素缀合物和治疗因子。在本发明实 施方案的一个方面中，可以给予任何许多本领域已知的延长释放剂 型，例如，如美国专利Nos. 4,713，249; 5,266,333和5,417,982中所
述的可生物降解的碳水化合物基质，所述专利结合到本发明中作为 参考。
在另一示例性实施方案中，提供包含一定量的分离的载体-荧光 素缀合物的药用组合物，当用所述载体-荧光素缀合物预先免疫宿主 动物时，其能有效建立一种对缀合物中荧光素部分的新免疫性。可 使用任何上述剂量或剂量形式的所述载体-荧光素缀合物，并可根据 任何上述给药方案给予。
实施例
除另外指明外，所有反应均在室温下进行；所有蒸发均在减压 或真空下进行；如果适合，各实施例化合物均通过NMR、 13C NMR、元素分析、分析性HPLC、 UV吸收和/或荧光进行分析。
实施例1.由蝶酰谷氨酸酯合成化合物8a<formula>formula see original document page 46</formula>流程4
步骤(a).将N"-保护的蝶酸la (119 g, 0.25 mol)和谷氨酸ot-叔丁 基酯,"曱基二酯(2a, 76g, 0.30mol)在DMF (4L)中的溶液用PyBop
(171g, 0.325 mol)和DIPEA (109mL, 0.60mol)处理。18 h后，将混合 物蒸发，得到二酯3a，为一种从1:1 ACN/曱基叔丁基醚(MTBE)中得 到的沉淀物。
步骤(b).在聚(4-乙烯基吡啶)存在下，用1:1 TFA/无水DCM化 学选择性除去二酯3a的叔丁基保护基，得到a-酸,？甲基酯类似物4a, 为一种从1:1石油醚/MTBE中得到的沉淀物。
步骤(c).将a-酸j-曱基酯类似物4a和乙二胺(5a)的混合物搅拌 2小时，形成EDA-叶酸酯类似物6a。 N"-三氟乙酰胺保护基在反应 过程中同时被除去。使用DEAE-纤维素固体载体，如DE52 (Whatman 批号4057-200),通过柱层析，可任选纯化化合物6a以除去残留的乙 二胺(5a)。
步骤(d).在DIPEA和1,1,3,3-四曱基胍(TMG)存在下，在DMSO 中，使EDA-叶酸酯类似物6a与焚光素异硫氰酸酯(FITC， 7)缩合， 得到8a (218 g)，其作为得自1:1 ACN/MTBE中的沉淀物被收集。叶 酸酯-FITC 8a经反相柱层析纯化(Biotage C18柱，100 mM磷酸钠緩 冲液/乙腈为流动相)。经UV吸收(280nm)检测含有8a的流分，混合。 蒸发挥发性溶剂，将残留物经反相柱层析脱盐(Biotage C18柱，水/乙 腈为流动相)。蒸发挥发性溶剂，冷冻干燥残留物，得到47g(22。/。总 收率)的8a。 HPLC (Nova-Pak C18柱，10 mM乙酸铵/乙腈为流动相) 表明该物质纯度大于98。/。，经UV或荧光未检测到双荧光素衍生物IIIa (n=l)。
实施例2.由谷氨一酰基乙二胺合成8a
流程5
步骤(a).将被保护的谷氨酸9a和被保护的乙二胺10a在THF中 的混合物用PyBOP和二异丙基乙胺(DIPEA)处理。通过用EtOAc提 取反应混合物分离酰胺lla。蒸发合并的有机相，得到酰胺lla。
步骤(b).在室温下，在二氯甲烷中，将酰胺lla用二氮杂双环 十一烷(DBU)处理，除去Fmoc保护基。蒸发混合物得到胺12a,可 任选将其纯化。另外按以下所示，可按一锅法，不经纯化以单一操 作进行步骤(b)-(d)。
步骤(c).将步骤(b)中的残留物或者任选含胺12a的纯化形式溶 解于DMF中，使用PyBOP和DIPEA使其与N气三氟乙酰基蝶酸(la) 偶合。蒸发反应混合物得到叶酸酯类似物13a,可任选将其纯化。另 外按以下所示，可按一锅法，不经纯化以单一操作进行步骤(c)-(d)。
步骤(d).将步骤(c)中的残留物或者任选含叶酸酯类似物13a的 纯化形式溶解于二氯曱烷中，然后用三氟乙酸(TFA)和作为阳离子清 除剂的聚(4-乙烯基吡啶)处理，同时除去Boc和叔丁基保护基。双沉 淀(Doubleprecipitation)(丁基叔丁基醚，然后1:1曱基叔'丁基醚/CH3CN) 得到为浅黄色固体的胺6b。
步骤(e).将胺6b与荧光素异硫氰酸酯(7)缩合，得到对应的8a 的N化三氟乙酰胺保护的类似物，收集沉淀。将沉淀溶解于水中，将
pH升高至约10或以上，使得W。-三氟乙酰基保护基水解，得到8a。 叶酸酯-FITC 8a经反相HPLC纯化(XTerra柱，90:10 10 mM磷 酸钠緩冲液/乙腈为流动相)。将含8a的各流分经UV吸收(280nm)检 测并混合。蒸发挥发性溶剂。残留物经反相HPLC脱盐(XTerra柱， 50:50水/乙腈为流动相)。蒸发挥发性溶剂，将残留物冷冻干燥，得 到为橙色固体的8a。
实施例3.由乙二胺异硫氰酸酯合成8a
流程6
<formula>formula see original document page 49</formula>
步骤(a).将Boc-保护的氨基乙基异硫氰酸酯(14a, 1.5 mmol)和荧 光素胺(fluoresceinamine)(15,异构体-I, 0.3 mmol)在EtOH中的混合物 加热回流24 h。蒸发EtOH溶剂，将残留物溶解于水中，得到pH约 为10。将水层用EtOAc洗涤，通过加入酸，将水溶液的pH调节至 4.0，得到沉淀物Boc-保护的胺16a,冷冻干燥(70%收率)。
步骤(b).将Boc-保护的胺16a悬浮于无水CH2C12中，加入聚-(4-乙烯基吡啶)，然后慢慢加入三氟乙酸。将得到的澄清黄色溶液搅拌 3小时。将反应混合物过滤，用1:1曱基叔丁基醚(MTBE)/CH2Cl2沉
淀。将沉淀用MTBE洗涤，在高真空下干燥，定量收率得到胺17a。
步骤(c).将PyBop (1.01 mmol)和谷氨酸(O-t-Bu)OMe (1.01 mmol) 顺序加入到N"-TFA-蝶酸(0.84 mmol)在DMF中的悬浮液中。将得到 的澄清溶液用二异丙基乙胺(DIPEA, 2.02 rmolM)处理，搅拌3 h。减 压除去DMF，将不纯的19a用1:1 CH3CN/MTBE沉淀。将沉淀用1:1 CH3CN/MTBE洗涤，高真空下干燥，定量收率得到19a。
步骤(d).将化合物19a混悬于无水CH2C12中，顺次加入聚-(4-乙 烯基吡啶)和三氟乙酸。将得到的澄清黄色溶液搅拌2小时，过滤， 将不纯的20a用1:1 MTBE/CH2Cl2沉淀。将沉淀物用MTBE洗涤， 高真空下干燥，得到20a(66。/。收率)。
步骤(e).将PyBop (0.052 mmol)和DIPEA (0.20 mmol)同时加入 到叶酸类似物20a (0.05 mmol)和EDA-荧光素17a (0.05 mmol)在无水 DMF的溶液中。将得到的溶液搅拌2h,将不纯的23a用MTBE沉淀。 将沉淀用MTBE洗涤，高真空下干燥，定量收率得到23a。
步骤(f).将化合物23a (0.05 mmol)用0.5 M N^CC^ (pH-10.6)的 水冷溶液处理。将得到的亮橙黄色溶液搅拌4 h，然后通过加入1 M HC1将反应混合物pH调节至约7.6-7.8。经制备HPLC柱纯化(洗脱 液5.0 mM磷酸钠/ACN),得到含化合物8a的纯流分。减压除去 ACN，将浓缩液冷冻干燥，得到为橙色粉末的8a(60。/。收率)。
实施例4. DEAE纤维素阴离子交换固体载体的预处理
在将DEAE纤维素阴离子交换固体载体(例如DE32)装载于柱中 之前，将该固体栽体用0.5 M HC1溶液浆化为15体积。约0.5小时 后，倾出上清液，将该固体载体用水洗涤至洗液约为pH 4。将该固 体载体用0.5 M NaOH溶液浆化为15体积。约0.5小时后，倾出上 清液，将该固体载体用水洗涤至洗液约为pH8。
实施例5.用DE32从叶酸中纯化蝶酸
将干的微粒型DE32阴离子交换树脂(DEAE纤维素，Whatman 目录号6055-010)按实施例4中所迷预处理。真空下，将在去离子水
中的预处理的树脂的浆状液脱气至少1小时，均匀的装载于一玻璃
柱(25 X 900 mm)中，然后检查该柱使得捕集的气泡降到最低。将柱 用流动相(l.O M NaC1/0.01 M NaOH, pH 11.5)平衡。将含有蝶酸和叶 酸(l.O g)的混合物部分溶解于pH约为6的1.0 M NaCl (1 mL)中。将 pH调节至11.5之后，该混合物完全溶解。将得到的溶液装载于柱上， 用流动相(l.O M NaC1/0.01 M NaOH)洗脱。参见图1A,经UV吸收 (280nm)监测洗脱液。确定洗脱的叶酸在流分13-31中，而洗脱的蝶 酸在流分35-81中。参见图1B,通过反相HPLC测定，即在Nova-Pak C18, 3.9 X 150 mm柱上，以1 mL/min的流速用99:1至1:1 A/B梯度 洗脱(其中A是0.1% TFA-H20溶液，B是0.1% TFA-CH3CN溶液)， 在280 nm处检测，流分35-75中各含有蝶酸(纯度大于99%)。合并 流分35-75，通过加入1.0MHC1，将合并的流分的pH调节至约为2。 将得到的沉淀浆状物离心，倾出上清液。将残留物在悬浮于水中， 离心，倾出上清液(3次)。将残留物冷冻干燥，得到0.40g蝶酸。 实施例6.用DE52从叶酸中纯化蝶酸
将预溶胀的微粒性DE52阴离子交换树脂(DEAE纤维素， Whatman目录号4057-200， 6 kg)与去离子水(12 L)混合。真空下，将 得到的浆状液脱气至少1小时，均匀地装栽于一玻璃柱(IOO X 1200 mm)中，然后检查该柱使得捕集的气泡降到最低。将柱用流动相(l.O M NaCl， 0.01 M NaOH, pH 11.5)平衡。将含有约25%叶酸的粗品蝶酸的 样本(40 g)溶解于水(500 mL)中，然后通过加入NaOH溶液将pH调 节至11.5。将该溶液过滤，装载于柱上，用流动相洗脱。通过反相 HPLC监测各流分。合并含纯度大于约95%的蝶酸的各流分，通过加 入1.0 M HC1溶液调节pH约为3，而将蝶酸从合并的各流分中沉淀。 冷冻干燥沉淀得到蝶酸(20g,经分析型反相HPLC测定，纯度〉98%)。
将柱通过用2个柱床体积的流动相洗脱再生。将卡者存约一周或 一周以上的柱用防腐剂处理，如0.2%苯扎氯铵溶液处理。
实施例7.从荧光素中纯化叶酸酯-荧光素缀合物
按实施例6中所述，将预溶胀的孩^立性DE52阴离子树脂(DEAE 纤维素，Whatman目录号4057-200, 1.8 kg)预处理。真空下，将在 去离子水(4 L)中的预处理的树脂的浆状液脱气至少1小时，均匀地 装载于一玻璃柱(75 X 600 mm)中，然后检查该柱使得捕集的气泡降 到最低。将柱用流动相(l.O M NaCl， NaOH, pH 9.0)平衡。将含有约 10%荧光素和其它杂质的粗品叶酸酯-荧光素缀合物(47.9 g)的样本溶 解于水(600 mL)中，然后通过加入1.0 M NaOH溶液将pH调节至9.0。 将该溶液过滤，装载于柱上，用流动相洗脱。通过反相HPLC监测 各流分。合并含纯度大于约95%的叶酸酯-焚光素缀合物的各流分， 通过加入1.0 M HC1溶液调节pH约为3，而将叶酸酯-荧光素缀合物 从合并的流分中沉淀。冷冻干燥沉淀得到8 a (41.8 g)。
实施例8.经HPLC纯化8a
按实施例1中所述制备不纯的8a (4g)的样本，经制备HPLC纯 化，使用XTEREA RP18, 30 x 300 mm 10 pm柱(Waters),以35 ml/min 流速，用100:0至91:9 A/B(其中A是100 mM磷酸钠(pH 7.4)溶液， B是ACN)梯度洗脱30 min进行。洗脱化合物8a，收集流分，同时 在这些条件下双荧光素-衍生物没有洗脱，因而未被检测到。通过同 时带有UV检测器和荧光检测器的分析型反相HPLC监测各洗脱的 流分。经UV检测纯度大于98%的流分不含有任何经UV或荧光检 测的EDA-双焚光素或双荧光素杂质(阈值小于0.1%)，合并各流分。 在低于35"C的温度下蒸发ACN。通过用1:1 A/B洗脱2个或2个以 上的柱床体积再生柱。
将得到的含磷酸盐的8a的溶液在用100y。注射用水(WFI)平衡的 柱上经反相HPLC纯化，先通过用WFI洗脱30 min洗去磷酸盐，接 着以35 mL/min的流速用100:0至91:9 WFI/ACN梯度洗脱30 min洗 脱8a。也通过同时带有UV检测器和荧光检测器的分析型反相HPLC 监测各流分。收集经UV检测纯度大于98%并且经荧光检测含有小 于0.05% EDA-双荧光素或双焚光素杂质的各流分，冷冻干燥得到粉
末拷的8a。
实施例9.分离的叶酸酯-荧光素缀合物对实体瘤生长的的影响 使用市售的皂草苷佐剂(GPI-0100; Galenica),将6-8周龄(约20-22 克)雌性Balb/c小鼠(8只/组)在带有荧光素-标记的匙孔虫血蓝蛋白 (KLH)的多个位点皮下免疫。在确信所有小鼠中抗荧光素抗体滴度很 高后(通过小鼠血清样本的ELISA测定结果证实)，在用KLH-荧光素 先前免疫之后，在各动物肩处皮下注射l x 106 M 109细胞(一种同 系基因型(syngeneic)肺癌细胞系，表达高水平的叶酸受体；第0曰)。 肿瘤细胞植入后用叶酸酯-荧光素的免疫接种由500、 2000或5000 nmol/kg的叶酸酯-荧光素(通过y羧基-连接的乙二胺桥缀合)组成，以 24小时间隔给予19个腹膜内剂量(第1-19日)完成。给予对照组动物 注射磷酸盐緩冲盐水(PBS)。为刺激免疫系统，给予所有小鼠三周的 一系列5日注射(一周5次)的20,000 IU/日的重组人IL-2。还给予所 有小鼠三周的一系列3次注射的25,000 U/日的重组人IFN-a。然后通 过使用测径器监测肺瘤体积(mm"来评估该免疫的有效性。图2中所 示的肿瘤生长曲线表明当将动物用IL-2和IFN-ot组合的叶酸酯-荧光 素处理时，实体瘤的生长明显受到抑制。
实施例10.用DE52纯化EDA-叶酸酯(6a)
将预溶胀的孩么粒性DE52阴离子交换树脂(DEAE纤维素，SIGMA) 与去离子水(12 L)混合。真空下，将该浆状液脱气至少1小时，均匀 地装载于一玻璃柱(IOO X 1200 mm)中，然后检查该柱使得捕集的气 泡降到最低。将柱用pH 10.5的NaOH溶液平衡。将污染有乙二胺5a 的EDA-叶酸酯6a的样本部分溶解于中性pH水中，然后通过加入 NaOH溶液将该溶液的pH调节至10.5之后完全溶解。装载该pH调 节的溶液后，将柱先用3个柱床体积的pH 10.5的NaOH溶液洗脱， 然后用2个柱床体积的1.0 M NaCl/NaOH溶液(pH 10.5)洗脱。收集 和合并用1.0 M NaCl/NaOH (pH 10.5)溶液洗脱时得到的黄色流分。 通过加入HC1溶液将pH调节至约为7,从合并的流分中沉淀EDA-
叶酸酯6a。冷冻干燥后，将小部分的6a与荧光素偶合，然后用带有 焚光检测器的HPLC分析。未检测到式II和III的EDA-双焚光素化合物。
实施例11.化合物8a的钩或镁盐的纯化
将8a的钠盐(84%纯度)用10-50摩尔当量的氯化镁或氯化4丐在 水中处理，得到沉淀。将混合物在90-100°C下加热后，将沉淀溶解， 得到黄色溶液，将其过滤，慢慢冷却至室温。将得到的黄色固体过 滤，用水洗涤，冷冻干燥，得到纯度为93-97%的8a。可通过离子交 换，将所述钙或镁盐转化为钠盐。
权利要求
1.一种纯化蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸类似物或其组合的方法，该方法包括以下步骤(a)使包含蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸类似物或其组合的溶液与离子交换层析载体接触；(b)用pH约为10或10以上的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物的第一种流分；(c)将第一种流分的pH降低至约3或3以下；和(d)沉淀蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物。
2. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基离子交换树脂的离子交换层析载体接触。
3. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基离子交换树脂的离子交换层析载体接触，所述糖基离子交换树 脂选自纤维素、直链淀粉、琼脂糖、琼脂糖凝胶、交联葡聚糖凝胶 及其组合。
4. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基离子交换树脂的离子交换层析载体接触，所述糖基离子交换树 脂包含纤维素、直链淀粉或其组合。
5. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基阴离子交换树脂的离子交换层析载体接触。
6. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基阴离子交换树脂的离子交换层析载体接触，所述糖基阴离子交 换树脂包括纤维素、直链淀粉或其组合。
7. 权利要求1的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与包含 糖基阴离子交换树脂的离子交换层析载体接触，所述糖基阴离子交 换树脂选自交联葡聚糖凝胶DEAE、交联葡聚糖凝胶QA、 PEI纤维 素、QA纤维素、DEAE纤维素及其组合。
8. 权利要求l的方法，其中所迷接触步骤包括接触还包含叶酸、 叶酸衍生物或其组合的溶液。
9. 权利要求8的方法，其还包括洗脱包含叶酸或叶酸衍生物的 第二种流分的步骤(e),其中第一种流分和第二种流分被基本分离。
10. 权利要求8或9的方法，其中所述接触步骤包括使该溶液与 包含糖基阴离子交换树脂的离子交换层析载体接触，所述糖基阴离 子交换树脂选自交联葡聚糖凝胶DEAE、交联葡聚糖凝胶QA、 PEI 纤维素、QA纤维素、DEAE纤维素及其组合。
11. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述洗脱步骤包括用pH 约为11或11以上的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似 物的第一种流分。
12. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述洗脱步骤包括用pH 范围约为11-13的流动相洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物的 第一种流分。
13. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述洗脱步骤包括用基 本上无氨或其盐的流动相洗脱。
14. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述沉淀步骤包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物，沉淀物的纯度约为95%重量或以 上。
15. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述沉淀步骤包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物，沉淀物的纯度约为98%重量或以 上。
16. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述沉淀步骤包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物，沉淀物的纯度约为99%重量或以 上。
17. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述沉淀步每聚包括沉淀 蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物，沉淀物基本上不含叶酸。
18. 权利要求1-9的任一项的方法，其中所述接触步骤包括使包含蝶酸的溶液与离子交换层析载体接触。
19.权利要求1-9的任一项的方法，其中所述接触步骤包括使下 式的蝶酸衍生物 <formula>see original document page 4</formula>与离子交换层析载体接触。
20.权利要求1-9的任一项的方法，其中所述接触步骤包括使下 式的蝶酸衍生物 <formula>see original document page 4</formula>与离子交换层析载体接触。
21. —种纯化蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸类似物或其组合的方法， 该方法包括以下步骤(a) 使包含蝶酸、蝶酸衍生物、蝶酸类似物或其组合的溶液与阴 离子交换层析载体接触；和(b) 洗脱包含蝶酸、蝶酸衍生物或蝶酸类似物的第一种流分。
22. 权利要求21的方法，其中所述接触步骤包括使蝶酸、蝶酸 衍生物或蝶酸类似物与选自下列的阴离子交换层析载体接触交联 葡聚糖凝胶DEAE、交联葡聚糖凝胶QA、 PEI纤维素、QA纤维素、 DEAE纤维素及其组合。
23. —种纯化包含蝶酸、其衍生物或蝶酸类似物和荧光素或荧光 素^f汙生物的缀合物的方法，该方法包括以下步骤(a)使包含所述缀合物的溶液与笫 一种反相层析载体接触；(b) 用流动相洗脱包含所述缀合物的磷酸盐复合物的笫 一种流分，所述流动相包含-粦酸盐，且pH范围约为6-8;(c) 使所述缀合物的磷酸盐复合物的溶液与第二种反相层析载体接触；和(d) 用含水的流动相洗脱包含所述缀合物的第二种流分，其中所述笫二种流分基本上无磷酸盐。
24.权利要求23的方法，其中所述缀合物为下式的化合物
25. 权利要求23或24的方法，其中洗脱步骤(b)包括使用pH约 为7.4的流动相。
26. 权利要求23或24的方法，其中接触步骤(a)包括使所述缀合物与包含C18硅胶载体的笫一种反相层析载体接触。
27. 权利要求23或24的方法，其中洗脱步骤(b)和洗脱步骤(d)各自包括用还包含独立选自下列的所选有机溶剂的流动相洗脱乙腈、甲醇、四氲呋喃及其组合。
28. 权利要求23或24的方法，其中洗脱步骤(b)和洗脱步骤(d)各自包括用还包含乙腈的流动相洗脱。
29. 权利要求28的方法，其中洗脱步骤(b)包括用包含磷酸盐和乙腈的流动相按梯度进行洗脱，其中在预定时间段内，乙腈的相对 百分比增加，而磷酸盐的相对百分比降低。
30. 权利要求28的方法，其中洗脱步骤(d)包括用包含水和乙腈的流动相4耍梯度进行洗脱，其中在预定时间段内，乙腈的相对百分 比增加，而水的相对百分比降4氐。
31. —种制备下式化合物的方法，<formula>see original document page 6</formula>该方法包括以下步骤:使下式化合物<formula>see original document page 6</formula>与下式化合物反应<formula>see original document page 6</formula>其中R和R2各自独立选自氢和氮保护基，或者R和I^一起形成氮 保护基；113和114各自独立选自氢和氮保护基；W是氬或羧酸保护基; n是选自0、 1、 2、 3和4的整数；m是选自1、 2、 3和4的整数； 以及RS和W各自独立选自氬和氮保护基，或者116和R —起形成氮 保护基。
32. 权利要求31的方法，其中RS和R7的至少一个是氮保护基。
33. 权利要求31或32的方法，其中R"是氮保护基。
34. —种制备下式化合物的方法，<formula>see original document page 7</formula>与下式化合物反应<formula>see original document page 7</formula>其中R1和R2各自独立选自氢和氮保护基，或者R1和R2—起形成氮保护基；R3和R4各自独立选自氢和氮保护基；R5是氬或羧酸保护基; n是选自0、 1、 2、 3和4的整数；m是选自1、 2、 3和4的整数；R6 和R7各自独立选自氪和氮保护基，或者R6和R7 —起形成氮保护基; 以及R9是烷基。
35. 权利要求34的方法，其中R5是氬，及R9是曱基。
36. 权利要求34的方法，其中R6和R17的至少一个是氮保护基。
37. —种制备下式化合物的方法，<formula>see original document page 7</formula>该方法包括以下步骤 (a)使下式化合物:<formula>see original document page 8</formula>与下式化合物反应<formula>see original document page 8</formula>其中Ri和W各自独立选自氢和氮保护基，或者W和RS—起形成氮 保护基；113和114各自独立选自氢和氮保护基；W是氬或羧酸保护基; n是选自0、 1、 2、 3和4的整数；以及m是选自1、 2、 3和4的整数。
38. 权利要求37的方法，其中RS是烷基。
39. —种下式化合物<formula>see original document page 8</formula>及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物，其中分离出来的该化 合物形式具有至少约95%摩尔或至少约95%重量的纯度。
40.权利要求39的化合物，其中所述纯度为至少约98%摩尔或 至少约98%重量。
41. 权利要求39的化合物，其中所述纯度为至少约99%摩尔或 至少约99%重量。
42. 权利要求39的化合物，其以具有不超过约0.1%摩尔或不超 过约0.1%重量的一或多种双荧光素组分的形式被进一步分离。
43. 权利要求39的化合物，其以具有不超过约0.05%摩尔或不 超过约0.05%重量的一或多种双焚光素组分的形式被进一步分离。
44. 权利要求39-43中任一项的化合物，其以基本上不含一或多 种双荧光素组分的形式被进一步分离。
45. 权利要求39-43中任一项的化合物，其以基本不含有下式的 组分的形式被进一步分离
46.权利要求39-43中任一项的化合物，其以基本不含有下式的 组分的形式被进一 步分离
47. —种组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物，其中该化合物相当于 至少约95%摩尔的组合物或至少约95%重量的组合物。
48.权利要求47的组合物，其中所述化合物相当于至少约98%摩尔的组合物或至少约98%重量的组合物。
49. 权利要求47的组合物，其中所述化合物相当于至少约99% 摩尔的组合物或至少约99%重量的组合物。
50. 权利要求47的组合物，其中所述组合物基本不含叶酸。
51. 权利要求47-50中任一项的组合物，其中所述化合物通过包 括使包含所述化合物的溶液与DEAE纤維素接触的步骤的方法制备。
52. —种组合物，其包含下式化合物及其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物，其中该化合物相当于 至少约90%摩尔的组合物或至少约95%重量的组合物。
53. 权利要求52的组合物，其中所述化合物相当于至少约95% 摩尔的组合物或至少约98%重量的组合物。
54. 权利要求52的組合物，其中所述化合物相当于至少约99% 摩尔的组合物或至少约99%重量的组合物。
55. 权利要求52的组合物，其中所述组合物包括不超过约0.1%重量的一或多种双荧光素组分。
56. 权利要求52的組合物，其中所迷组合物包括不超过约0.05%重量的一或多种双焚光素组分。
57. 权利要求52的组合物，其中所述组合物基本上不含一或多种双荧光素组分。
58. 权利要求52-56中任一项的组合物，其中所述组合物基本上不含下式的组分<formula>see original document page 11</formula>
59.权利要求52-56中任一项的组合物，其中所述组合物基本上 不含下式的组分<formula>see original document page 11</formula>
60. —种组合物，其包含下式化合物<formula>see original document page 11</formula>其中所述组合物包含不超过0.1%重量的一或多种双荧光素组分。
61. 权利要求60的组合物，其中所迷组合物包含不超过约0.05% 重量的一或多种双荧光素组分。
62. 权利要求60或61的组合物，其基本上不含有一或多种双荧 光素组分。
63. 权利要求60或61的组合物，.其基本上不含下式的组分ii<formula>see original document page 12</formula>
64.权利要求60或61的组合物，其基本上不含下式的组分
65. —种在哺乳动物中增强内源性免疫应答介导的清除病原性细胞群的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的组合物的步骤，所述组合物包含配体-荧光素缀合物以及不超过约0.1%重量的一或多 种双荧光素组分。
66. 权利要求65的方法，其中所述给予步骤包括给予包含配体-荧光素缀合物以及不超过约0.05%重量的一或多种双荧光素组分的组合物。
67. 权利要求65的方法，其中所述给予步骤包括给予包含配体-荧光素缀合物并且基本不含一或多种双荧光素组分的组合物。
68. 权利要求65或66的方法，其中所述给予步骤包括给予包含配体-荧光素缀合物并且基本不含下式化合物的组合物
69.权利要求65或66的方法，其中所述给予步骤包括给予包含 配体，荧光素缀合物并且基本不含下式化合物的组合物<formula>see original document page 13</formula>
70. —种在宿主动物中增强内源性免疫应答介导的清除病原性细 胞群的方法，该方法包括给予所述宿主动物有效量的权利要求43-50 中任一项的化合物的步骤。
71. —种在宿主动物中增强内源性免疫应答介导的清除病原性细 胞群的方法，该方法包括给予所述宿主动物有效量的权利要求56-68 中任一项的组合物的步骤。
72. —种在宿主动物中增强内源性免疫应答介导的清除病原性细 胞群的方法，该方法包括给予所述宿主动物有效量的配体-荧光素缀 合物的步骤，其中所述缀合物根据权利要求1-9或39-43中任一项制 备。
73. —种药用组合物，其包含有效量的权利要求39-43中任一项 的化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
74. —种药用組合物，其包含有效量的权利要求47-50或52-57 中任一项的组合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
全文摘要
本发明描述纯化蝶酸、蝶酸类似物及蝶酸衍生物的方法。本发明还描述合成和纯化维生素缀合物的方法，包括叶酸FITC缀合物、叶酸类似物以及叶酸和叶酸类似物的衍生物。本发明还描述蝶酸、蝶酸衍生物和类似物及其缀合物的纯化形式。
文档编号C07D475/08GK101175757SQ200680016287
公开日2008年5月7日 申请日期2006年3月14日 优先权日2005年3月16日
发明者C·P·利蒙, H·K·桑塔普拉姆, I·R·弗拉霍夫, 李春红, 许乐村 申请人:恩多塞特公司