专利名称：纯化(多)肽的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于方便纯化(多)肽的制备的修饰方法，还涉及一种利用该修饰方法的纯化工艺。
近些年来，采用t-Boc或F-moc策略的固相肽合成技术有了很大的改进。复杂的合成方法可以制备约100个或更多残基的多肽1-4。然而，由于在肽合成的每一个循环都有可能发生不完全连接和链终止，导致缺失序列和截短序列的形成。
这些以及可能发生的副反应(主要发生在从树脂上最后切离过程中)妨碍了直接从其它杂质中分离所需求的肽。长合成多肽的纯化是用于生物学研究和用于人及动物的产品生产中的主要问题，因为它们必需是高纯度的。
尤其是，当合成的序列包含30个或更多个残基时，所需求的产物与缺失的肽、截短的肽或修饰过的肽等杂质的物理性质如大小、电荷、疏水性等差异太小，无法得到充分的纯化。另外，如反相HPLC的现代的高效分离技术常常受到收率低、载样量小的限制，使得这些技术耗时多，花费高。
人们已经试验了多种不同的方法来克服这种限制。有人将一种153个残基的IL-1合成蛋白质5和一种99个残基的SIV蛋白质酶合成蛋白质6生物素化，然后在一种抗生物素蛋白质-琼脂糖柱上分离生物素化的肽链。
Ball等人7最近提出了一种纯化方法，该方法基于加入一种可逆的保护基团，使得肽链的最后一个残基具有亲脂性、酸性或碱性。
有人利用合成序列中存在的特定残基优化了更为特异的层析方法。例如，含半胱氨酸的肽通过与固定化的汞衍生物8或活化的硫醇9反应而得到的纯化，且固定化金属离子亲和层析方法(IMAC)10也已成功地用于含组氨酸或色氨酸的肽的纯化11。
重组蛋白质中有目的地加入组氨酸尾巴、B细胞表位或者GST组分，然后可利用这些尾部结构进行亲和层析。
一般地，一种基于合成肽的物理化学性质的纯化方案必须根据每一个特定的样品进行优化，而这是一种耗时多、花费高的过程。因此，为了获得通用的纯化方法，开发了许多技术15。然而，迄今为止所报道的纯化方法都不尽如人意，因为这些方法需要花费大量的时间和/或终纯化产物中存留共价衍生的肽，而这就可能影响产品的生物和物理化学性质，及其在动物和人中的应用。
因此，本发明的目的就是要通过提供一种用于方便其纯化的多肽的修饰方法来改进已知的方法，并且改进(多)肽的纯化工艺，该方法及工艺普遍适用，具有高回收率且易于操作。
通过一种修饰方法实现了本发明的目的，该修饰方法包括在(多)肽链合成过程中，向其末端插入至少一个可特异性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解，从而使得特异性裂解精确发生于可特异性裂解的氨基酸处。
一种利用该修饰方法的纯化工艺包括下列步骤a)合成所需求的(多)肽；b)在(多)肽的末端加入至少一种可特异性裂解的氨基酸，并且，(多)肽中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解；b)用一种标记序列延长(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延长的多肽；c)使用一种标记特异性的纯化方法纯化延长肽；且d)通过一种特异于所加入氨基酸的裂解方法从延长(多)肽中去除标记序列和所加入的氨基酸，以得到纯化的多肽。
特异性裂解方法优选是化学裂解法，下面将做进一步的说明。
本发明的方法和工艺适用于每一种(多)肽，因为它不依赖于其氨基酸组成。而且，在特定优选实施方案中，该方法和工艺花费不多且效率很高。
在一种优选实施方案中，加入亲和标记(例如，6个组氨酸残基序列或者其它方便纯化的化合物)之前，使用甲硫氨酸残基作为添加的氨基酸。在经过例如标记特异性的亲和层析等适当的纯化步骤以后，使用在甲硫氨酸残基处特异性裂解的CNBr消化法以切除组氨酸标记。CNBr消化法是一种花费不多而效率很高的方法。
在一种优选实施方案中，标记包括至少一个组氨酸残基序列(优选6个或6个以上)和一个甲硫氨酸残基。也可以任选地加入一种或多种其它氨基酸。
如果所需求的多肽序列中含有甲硫氨酸残基，那么当用溴化氰除去标记时，它们也将被裂解。然而，根据本发明就可以避免这种情况的发生，方法是在(多)肽合成过程中使用修饰过的甲硫氨酸残基。这种修饰过的甲硫氨酸残基的一个例子为甲硫氨酸亚砜。
本发明方法和工艺的另一实施方案中，标记是一种如聚乙二醇的大分子。在这种情况下标记特异性的纯化方法是凝胶过滤层析法。
本发明的方法和工艺同样适用于由重组DNA技术生产的多肽。在优选实施方案中，所需求的多肽中原有的而不在标记中的甲硫氨酸残基经裂解保护，例如用如缬氨酸、甘氨酸等其它氨基酸取代或者被删除。
在本申请中，“标记”是指在所需求肽的合成过程中或者在其合成之后加入到其上的一种可去除的分子。一个“标记”可以是在多肽合成过程中加入的一种氨基酸序列，也可以是一种易于从组分混合物中纯化出来的其它分子。后者的一个例子是聚乙二醇(PEG)。
在本申请中，术语“肽”、“多肽”、和“(多)肽”可以替换使用。
下面给出一个实施例来说明本发明。很显然，熟练技术人员完全可以根据本实施例设计出落在本发明专利保护范围内的其它方法。本实施例公开了一种通用的纯化方法，它基于下面的组合1)一种加帽(capping)方法，2)在天然序列的合成过程中使用甲硫氨酸亚砜作为经保护的甲硫氨酸，并且3)使用1个甲硫氨酸、2个甘氨酸残基和用于亲和层析的6个组氨酸终序列来延长所需求的肽。在充分的纯化步骤后，组氨酸标记用溴化氰裂解，然后将甲硫氨酸亚砜最终还原为甲硫氨酸。采用这种简单、直接的策略，利用传统的层析方法就可以在短时间内高产量地将69个残基的多肽“PbCs242-310”纯化至均质，该多肽覆盖Plasmodiumberghei的CS蛋白质的C-末端区。实施例1．材料与方法1.1试剂与溶剂用于肽合成的化学药品和溶剂购自Calbiochem-Novabiochem AG(Laufelfingen，瑞士)和Fluka(Buchs，瑞士)。1.2肽的合成与分析为说明本发明，采用Applied Biosystem 431A肽合成仪以固相F-Moc化学法化学合成了一种命名为“PbCs242-310”的多肽12，其覆盖Plosmodium berghei CS蛋白质的C-末端区。该多肽的制备在一种F-moc-叔丁基丝氨酸-对-烷氧基苯甲醇树脂(Wang树脂)上进行，反应规模为0.1mmol时，该树脂的取代度为0.43mmol/g。合成在如下条件下进行使用5倍过量的F-moc氨基酸衍生物；DCCI和HOBt作为活化剂；开始的34个氨基酸连接时间为60分钟，后面的残基连接时间加倍。每一个反应循环结束时用乙酸酐进行加帽。侧链保护基团包括用五甲基代苯并二氢吡喃磺酰基基团保护Arg；用-S-叔丁基基团保护Cys；用三苯甲基基团保护Asn、Gln和His；用叔丁氧羰基基团保护Lys和Trp；用叔丁基基团保护Asp、Glu、Ser、Thr和Tyr。Met-306以F-moc-甲硫氨酸亚砜的形式插入以防止其以后被溴化氰裂解。
下一步，用序列His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Met-将该肽向N-末端方向延长，反应条件与上所述相同，只是在连接了第二个Gly以后省略加帽步骤。这样得到的多肽命名为“组氨酸标记的PbCs 242-310”。
在室温下将肽-树脂用溶解在TFA中的2.5％H2O、5％三乙基硅烷处理2小时，以得到肽的粗制品。然后将此合成肽用体积排阻液相层析法进行纯化(使用70×2.5cm的Sephadex G50柱，流动相为50％的乙酸/水)。肽的纯度用RP-HPLC分析使用250×4.6mm的C4W-Porex柱，使用60分钟内溶解在0.1％TFA/水中的10-90％CH3CN梯度，流速为1.0ml/分钟。氨基酸组成按Knecht和Chang的方法测定13。1.3固定化金属离子亲和层析(IMAC)和CNBr裂解首先将多肽用基于组氨酸标记的亲和层析法纯化。然后再用溴化氰除去标记。
用Ni-NTA琼脂糖树脂制备一种Ni柱(Giagen公司，Chatsworth，美国)，并用缓冲液A(8M尿素、0.1M Na2HPO4、0.01MTris，用H3PO4调pH至8.0)平衡。将经过体积排阻纯化的“组氨酸标记的PbCs242-310”多肽溶解于缓冲液A中，以15ml/小时的流速上柱。用缓冲液A洗柱，再用含50mM咪唑的缓冲液B以30ml/小时的流速洗柱。然后用含250mM咪唑的缓冲液B将“组氨酸”标记的多肽洗脱下来。其中，缓冲液B含8M尿素、0.1MNa2HPO4、0.01MTris，用H3PO4调pH至6.3。
将此洗脱液经过一种50×25cm的Sephadex G25柱(流动相为50％乙酸/水)脱盐并冷冻干燥。再将其以20mg/ml的浓度溶于70％TFA中，用摩尔数过量100倍的CNBr在室温处理8小时以除去组氨酸标记。
将经消化的产物冷冻干燥，溶解在缓冲液A中，再次上样于Ni-NTA琼脂糖柱。组氨酸标记保留在Ni-柱上，柱流出物中则含有“PbCs 242-310”多肽。然后，流出物经过50×2.5cm的Sephadex G25柱(流动相为50％乙酸/水)脱盐并冷冻干燥。1.4甲硫氨酸亚砜的还原将经过CNBr处理和IMAC纯化的产物用pH8.0的10％巯基乙醇处理，使甲硫氨酸亚砜转变为甲硫氨酸，同时使S-叔丁基半胱氨酸转变为半胱氨酸，然后再用凝胶过滤法进一步纯化(250×4.4mm的Sephadex G25柱)。1.5质谱分析进行质谱分析时所用仪器为一种飞行时间质谱仪LDI 1700型MassMonitor(Linear Scientific Inc.,Reno,NV，美国)。将5微升1mg/ml的多肽溶液与5μl反式-3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸(芥子酸)混合。其中，芥子酸为20mg/ml的乙腈溶液(Linear Scientific Inc.Reno,NV，美国)。取1μl上述混和液置于质谱仪探头的尖端，并轻轻抽真空使之干燥。然后用一种N2-激光仪的3纳秒激光脉冲(波长337nm)照射该样品。用一种数字示波仪测定飞行时间并按肽MALDITOFMS校对标准(Linear Scientific Inc.,Reno,NV，美国)转换为质谱结果。其中，数字示波仪系列号为9304(Le Croy Research System,Corp.,SpringValley,NY)。2．结果69个残基的多肽“PbCs242-310”相应于P.berghei CS蛋白质的C-末端区12。如“材料与方法”部分所述，“组氨酸标记的PbCs242-310”是通过自动化方法进行合成的，其中每一次连接反应之后都包括一个加帽的步骤。
将600mg相应的肽树脂用H2O/三乙基硅烷/TFA处理后，得到150mg以上的多肽粗品。
对此多肽粗品的质谱分析表明，其中含有分子量(MW)为9301的所需求成分，还含有低分子量的其它组分(
图1)。
将90mg多肽粗品于25ml的Ni-NTA琼脂糖柱用固定化金属离子亲和层析法(IMAC)进行纯化(图2)。用体积排阻液相层析法脱盐后得到35mg“组氨酸标记的PbCs242-310”。对洗脱物(35mg)和流出物(55mg)280nm处测量的光吸收结果表明该纯化工艺的收率为100％。
然后，将经过Ni柱纯化的产物用CNBr裂解以除去6×His标记。
消化产物再次上样于Ni柱以除去未裂解的肽，并用pH8.0的10％巯基乙醇处理以还原在合成中插入的甲硫氨酸亚砜和半胱氨酸残基的保护基团。为确证甲硫氨酸亚砜已被完全还原，再一次将产物用CNBr处理，并用质谱法检查裂解的效率。
用体积排阻层析法进行进一步纯化，得到19mg纯化的PbCs 242-310。
图3显示所得产物的质谱分析结果。图4比较了肽粗品及纯化的肽的分析层析曲线。可以看出，两次层析的保留时间之间的差异是因为纯化的产物中不含高度荷电的His标记。基于对214nm的吸收峰面积进行积分，表明该纯化的“PbCs 242-310”约为95％纯。该CS多肽的氨基酸组成也与预期的结果相符(表1)。表1氨基酸分析
3．讨论由于有了高效的、自动化的肽链合成方法，生物活性肽的化学合成已经成为一种广泛使用和迅速发展的技术。对于大多数的应用，合成产物的粗品必须经过纯化以除去其中的残基反应剂、不正确的序列以及化学修饰过的肽。这通常使用三氟乙酸/乙腈水溶液作流动相的反相HPLC来完成。虽然肽合成已实现高度自动化，但纯化主要还是靠手工操作，因此耗时多、花费大、效率也不很高。
本实施例表明，本发明的工艺可以得到如图3所示的高纯度，而且易于操作、普遍适用。
如本文所述，由于所需求的序列中含有Met残基造成的特异性裂解问题，可以根据本发明通过使用甲硫氨酸亚砜很容易地解决，因为甲硫氨酸亚砜可以抵抗CNBr裂解，且可用巯基乙酸定量地还原14。
由上所述，本发明的方法已成功地应用于多肽“PbCs 242-310”的纯化。该肽含69个残基，相应于P.berghei CS蛋白质的C-末端区12。虽然，如图1质谱分析结果所示，从树脂上切离下来的粗品中含有许多肽杂质，本发明者还是能够在相对较短的时间内，高效率地将目的肽纯化到均质。整个纯化方案得到了19mg纯化的PbCs 242-310，相当于粗品的约20％。
总之，表明了CNBr裂解同时以亚砜形式保护相关Met残基，并结合使用一种高效的亲和标记方法，构成了一种纯化化学合成的长链多肽的高效而通用的方法。4．图例说明图1肽粗品的质谱图2IMAC纯化的层析曲线图3纯化的肽的质谱图4肽粗品及纯化的肽的层析曲线参考文献1．Chong,P.,Sia,C.,Tam,E.,Kandil,A.& Klein,M.国际肽及蛋白质研究杂志(International Journal of Peptide & Protein Ressarch)41,21-27(1993).
2．Haaheim,L.R.,Maskell,J.P.,Mascagni,P.& Coates,A.R.斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scandinavian Jouranl of Immunology)34,341-350(1991).
3．Roggero,M.A.，等人。分子免疫学(Molecular Immunology)32,1301-1309(1995).
4．Smith,D.D.，等人.国际肽及蛋白质研究杂志(InternationalJournal of Peptide & Protein Research)44,183-191(1994).
5．Lobl,T.J.,Deibel,M.J.& Yem,A.W.分析生物化学(Analytical Biochemistry)170,502-511(1988).
6．Tomasselli,A.G.，等人.生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)267,10232-10237(1992).
7．Ball,H.L.& Mascagni,P.国际肽与蛋白质研究杂志(International Journal of Peptide & Protein Research)40,370-379(1992).
8．Krieger,D.E.,E rickson,B.W.& Merrifield,R.B.美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America)73,3160-3164(1976).
9．Lindeberg,G.,Tengborn,J.,Bennich,H.& Ragnarsson,U.J.层析(Chromatography)156,366-369(1978).
10．Porath,J.,Carlsson,J.,Olsson,I.& Belfrage,G.自然(Nature)258,598-599(1975).
11．Lindeberg,G.,Bennich,H.& Engstrom,A.国际肽及蛋白质研究杂志(International Journal of Peptide & Protein Ressarch)38,253-259(1991).
12．Lanar,D.E.分子生物化学寄生物学(Mol.Biochem Parasitol.)39,151-154(1990).
13．Knecht,R.& Chang,J.Y.分析化学(Analyt.Chem.)58,2375-2379(1986).
14．Houghten,R.A.& Li,C.H.酶学方法(Methods in enzymology)91,549-559(1991).
15．Barany,G.& Merrifield,R.B.《肽·分析·合成·生物学》(Peptides,analysis,synthesis,biology)1-163-165(Academic Press,London,1980).
权利要求
1．用于方便纯化(多)肽的多肽修饰方法，该修饰方法包括在(多)肽合成过程中，向(多)肽链末端插入至少一种可特异性裂解的氨基酸，并且该(多)肽序列中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解，从而使得特异性裂解精确地发生在可特异性裂解的氨基酸处。
2．利用权利要求1的修饰方法的纯化(多)肽的制备工艺，该工艺包括下列步骤a)合成所需求的(多)肽；b)向该(多)肽末端加入至少一种可特异性裂解的氨基酸，同时，该(多)肽中若具有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解；c)用一种标记序列延长(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延长的多肽；d)使用一种标记特异性的纯化方法纯化延长的肽；且e)通过一种特异于所加入的氨基酸的裂解方法从延长的肽中去除标记序列和所加入的氨基酸，以得到纯化的(多)肽。
3．如权利要求1或2中的工艺，其中的特异性裂解方法是一种化学裂解法。
4．如权利要求1、2或3中的工艺，其中所加入的氨基酸为甲硫氨酸；其中(多)肽中的甲硫氨酸在(多)肽合成过程中用一种可去除的保护基团进行化学修饰以保护它不被溴化氰裂解，且其中的氨基酸特异性裂解方法由溴化氰裂解。
5．如权利要求4中的工艺，其中的保护基团为亚砜。
6．如权利要求2-5中的工艺，其中的标记序列由HiS-His-His-His-His-His-Gly-Gly-组成。
7．如权利要求2-6中的工艺，其中，标记特异性的纯化方法为基于对标记序列的亲和性的层析方法。
8．如权利要求2-5中的工艺，其中的标记是诸如聚乙二醇之类的一种大分子。
9．如权利要求8中的工艺，其中的标记特异性的纯化方法为凝胶过滤层析法。
10．如权利要求1-9中的工艺，其中所需求的(多)肽通过重组DNA技术在一种活体宿主中生产，(多)肽中与该多肽末端至少一种可特异性裂解的氨基酸相同的氨基酸被删除或进行防裂解保护，例如用另外一种氨基酸取代。
11．如权利要求10中的工艺，其中，那些原存于所需求的(多)肽中而不在标记中的甲硫氨酸被删除或者进行防裂解保护，例如可以使用诸如缬氨酸、甘氨酸或被修饰的甲硫氨酸等其它氨基酸来取代。
12．如权利要求10或11中的工艺，其中，活体宿主为一种真核宿主或者一种原核宿主，诸如大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供了一种用于方便纯化(多)肽的多肽修饰方法。该修饰方法包括:在(多)肽合成过程中,向其末端插入至少一种可特异性裂解的氨基酸,并且多肽序列中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解,从而使得特异性裂解精确地发生在可特异性裂解的氨基酸处。本发明还涉及一种利用此修饰方法的纯化(多)肽的制备工艺。该工艺包括下列步骤:合成所需求的(多)肽;向该(多)肽的末端加入至少一种可特异性裂解的氨基酸,并且,该(多)肽中若有同种氨基酸时要加以保护使其不被裂解;并用一种标记序列延长(多)肽和加入到其上的氨基酸以得到延长的多肽;使用一种标记特异性的纯化方法纯化此延长(多)肽;通过一种特异于所加入氨基酸的裂解方法,从延长(多)肽中去除标记序列和所加入的氨基酸,以得到纯化的(多)肽。
文档编号C07K1/04GK1233255SQ97198637
公开日1999年10月27日 申请日期1997年9月9日 优先权日1996年9月9日
发明者M·罗吉洛, G·克拉丁, C·雷蒙德, N·法塞尔 申请人:Rmf迪克塔恩有限公司