专利名称：来自mage－2的分离的肽的制作方法
相关申请本申请是现已授权的1994年3月24日申请的系列号08/217,188的部分继续申请。
本发明的领域本发明涉及免疫遗传学和肽化学。更具体地说。本发明涉及以各种方式使用的，包括作为免疫原和作为HLA-A2分子的配体使用的十一肽，十肽和九肽。更具体地说，本发明涉及来自基因MAGE-2编码的肿瘤排斥抗原前体的且由MHC-1型分子HLA-A2提供的所谓的“肿瘤排斥抗原”。
背景和现有技术现已用许多不同的方式对宿主生物识别或不能识别的癌细胞进行了研究。对该领域的了解利用了对基础免疫学和肿瘤学的一些了解。
对小鼠肿瘤的早期研究揭示了当一些显示分子移植进同源动物时会导致肿瘤细胞排斥。这些分子被受体动物的T-细胞识别，并激发裂解移植细胞的溶胞性T-细胞反应。采用诸如甲基胆蒽的化学致癌剂体外诱导的肿瘤首先获得了这一证据。发现由肿瘤表达且诱导T-细胞反应的该抗原对各种肿瘤是不同的。参见Prehn等，国家癌症研究所杂志18:769-778(1957)；klein等，癌症研究20:1561-1572(1960)；Gross，癌症研究，3:326-333(1943)，Basombrio，癌症研究，30:2458-2462(1970)关于用化学致癌剂诱导肿瘤和细胞表面抗原区别的一般性教导。这类抗原被称为“肿瘤特异性移植抗原”或“TSTA”。当以化学致癌剂诱导观察到存在该抗原后，经紫外线辐射体外诱导肿瘤时也获得相似的结果。参见Kripke，国家癌症研究所杂志53:333-1336(1974)。
尽管对上文所述类型的肿瘤观察到T-细胞介导的免疫反应，但据认为自发肿瘤一般无免疫原性。因此据认为在携带肿瘤的受试者中不存在激发与肿瘤反应的抗原。参见Hewitt等，Brit，癌症杂志33:241-259(1976)。
存在tum-抗原细胞系的家族是经过诱变小鼠肿瘤细胞或细胞系获得的免疫原性变异体，如Boont，实验医学杂志，152:1184-1193(1980)所述，其说明书作为参考文献引用。详细来说，经过突变在同源小鼠中不产生免疫反应，但形成肿瘤的肿瘤细胞(即，“tum+”细胞)获得tum-抗原。当诱变这些tum+细胞时，它们受同源小鼠排斥并且不能形成肿瘤(从而变为“tum-”)。参见Boon等，美国科学院院刊74:272(1977)，其说明书作为参考文献引用。己显示许多肿瘤类型表现出这种现象。参见，例如，Frost等，癌症研究，43:125(1983)。
Tum-变异体不能形成进行性肿瘤似乎是因为它们起动了免疫排斥过程。支持该假设的证据包括肿瘤“tum-”变异体，即在正常情况下不形成肿瘤的变异体在以亚致死辐射抑制免疫系统的小鼠中具有形成肿瘤的能力，van Pel等，美国科学院院刊76:5282-5285(1979)；以及如下的观察结果，即腹膜内注射的肥大细胞瘤P815的tum-细胞在12-15天内指数繁殖且然后在淋巴细胞和巨噬细胞流入期间仅几天后即被清除(Uyttenhove等，实验医学杂志，152:1175-1183(1980))。进一步的证据包括如下的观察结果，即小鼠可获得免疫记忆，使其能抵抗随后对相同tum-变异体的攻击，即使在随后的细胞攻击时给予免疫抑制剂量的辐射时也是如此(Boon等，美国科学院院刊，74:272-275(1977)；Van Pel等，出处同上；Uyttenhove等，出处同上)。随后的研究发现，当对自发肿瘤进行诱变时，产生不发生反应的免疫原性变异体。事实上，这些变异体能诱导抗原始肿瘤的免疫保持性反应。参见Van Pel等，实验医学杂志，157:1992-2001(1983)。因此，已表明可诱导在肿瘤中出现所谓的“肿瘤排斥抗原”，它是同源排斥反应的靶子。将外源基因转染进自发性肿瘤时已获得了相似的结果。这方面参见Fearon等，癌症研究，48:2975-1980(1988)。
已识别了一类抗原，它们存在于肿瘤细胞的表面并且被溶胞性T细胞识别，导致裂解。这类抗原下文称为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。TRA可以或不能诱导抗体反应。研究这些抗原的程序是经过体外溶胞性T细胞进行鉴定研究，即，经过特定溶胞性T细胞(下文称为“CTL”)亚类鉴定该抗原的研究。当识别存在的肿瘤排斥抗原时，该亚类增生，并且存在肿瘤排斥抗原的细胞被裂解。鉴定研究已鉴定了特异性裂解表达肿瘤排斥抗原的细胞的CTL克隆。该研究的例子可参见Levy等，癌症研究进展，24:1-59(1977)；Boon等，实验医学杂志，152:1184-1193(1980)；Brunner等，免疫学杂志，124:1627-1634(1980)；Maryanskit，欧洲免疫学杂志，124:1627-1634(1980)；Maryanski等，欧洲免疫学杂志，12:406-412(1982)；Palladino等，癌症研究，47:5074-5079(1987)。这类分析需要CTLs识别的其它类抗原，包括次要组织相容性抗原、雄性特异性H-Y抗原，和在本文中讨论的称为“tum-”抗原的一类抗原。
上文所述的受试者材料举例性的肿瘤称为P815。参见Deplaen等，美国科学院院刊85:2274-2278(1988)；Szikora等，EMBO J9:10141-1050(1990)和Sibille等，实验方法杂志，172:35-45(1990)，其公开内容作为参考文献引用。P815肿瘤是用甲基胆蒽在DBA/2小鼠中诱导并作为体外肿瘤和细胞系培养的肥大细胞瘤。诱变后P815细胞系产生了许多tum-变异体，包括称为P91A(Deplaen，出处同上)、35B(Szikora，出处同上)和P198(Sibille，出处同上)的变异体。与肿瘤排斥抗原相反，且作为一种关键性区别的是，tum-抗原仅在诱变肿瘤细胞后存在。肿瘤排斥抗原存在于未诱变的给定肿瘤的细胞上。因此，参见参考文献，细胞系可以是tum+，如称为“P1”的细胞系，且可被诱导产生tum-变异体。由于tum-表型不同于亲本细胞系，因此预期与其tum+亲本细胞系相比在tum-细胞系的DNA中有区别，且该区别可用于定位tum-细胞中的感兴趣的基因。结果，发现诸如P91A、35B和P198的tum-变异体基因与其正常等位基因的区别在于在该基因的编码区存在点突变。见Szikora和Sibille，出处同上，和Lurquin等，细胞58:293-303(1989)。用本发明的TRA证实并非如此。这些论文还证实来自tum-抗原的肽由CTLs识别的Ld分子提供。P91A由Ld提供，P35由Dd提供，P198由Kd提供。
与本申请属于同一受让人的1992年5月22日申请的PCT申请PCT/US92/04354教导了称为MAGE家族的编码人肿瘤排斥抗原前体的基因家族。一些这类基因也在van der Bruggen等，科学254:1643(1991)中描述。现已清楚的是MAGE家族的各种基因在肿瘤细胞中表达，且可用作诊断该肿瘤及用于本文所述其它目的的标记。参见Traversari等，免疫遗传学35:145(1992)；van der Bruggen等，科学，254:1643(1991)和De Plaen等，免疫遗传学40:360(1994)。现在已充分公开了在细胞表面加工和提供蛋白质的机制。本领域进展的粗略综述参见Barinaga，“获得一些骨架MHC如何结合肽”，科学，257:880(1992)也见Fremont等，科学257:919(1992)；Matsumura等，科学257:927(1992)；Latron等，科学257:964(1992)。这些文章总的来说表明了结合MHC/HLA分子的肽需要9个氨基酸长(“九肽”)且表明了该九肽的第一个和第9个残基的重要性。
对MAGE基因家族的研究现已表明了特定的九肽事实上存在于有些肿瘤细胞的表面，且九肽的存在需要提供的分子是HLA-A1。MAGE-1肿瘤排斥抗原(“TRA”或“九肽”)的复合物导致存在该复合物的细胞被溶胞性T细胞(“CTL”)裂解。
应注意，对于一同提交的属于Traversari等的申请系列号08/217,187和属于Townsend的系列号08/217,186，其研究均针对来自MAGE的其它肽。
例如，在1992年8月31日申请的美国专利申请系列号07/938,334和在1993年6月7日申请的美国专利申请系列号073,103中提供的研究发现，当比较各种MAGE基因的同源区与编码相关九肽的MAGE-1基因区域时，有很大的同源性。事实上，这些观察导致所公开的并在权利要求中所要求的本发明的一个方面，它是一个九肽家族，其中均具有相同的N末端和C末端氨基酸。这些九肽描述为单独或与载体肽偶联用于各种目的，包括其用作免疫原。九肽具有构成抗原表位的足够大小，对其产生的抗体描述为单独或作为更大多肽的一部分用于鉴定九肽。
这些参考文献，特别是系列号073,103显示了HLA-A1和MAGE-3之间的联系；然而，仅有大约26％的白种人群体和17％的黑种人群体的细胞表面存在HLA-A1分子。因此，更多地了解由其它类型的MHC分子提供的肽是有用的，这使得合适部分的人群可从上文所讨论的研究中受益。
现已发现，在下面说明书中阐述的MAGE-2产生的肽提供的抗原鉴定了与MHCⅠ型分子HLA-A2复合的肽。该发现的细节，包括治疗和诊断用途在下面说明书中所述的本发明的主题内。
附图的简要描述
图1是显示包括HLA-A2.1的0.5倍最大正调节量的肽浓度计算的举例图。
图2代表以51Cr释放试验测定的HPV克隆对各种材料的反应的比较数据。
图3A-3D显示了阳性大量培养物测定的结果。优选实施方案的详细描述。实施例1实验条件所有实验均在室温下进行，除非另有说明。所有Fmoc保护的氨基酸、合成多聚体、肽和TFA均贮存在-20℃。肽合成以固相方法在自动多肽合成仪(Abimed AMS 422)上合成肽(参见Gausepohl和Frank，生物技术，1990年9月；Gausepohl等，E.Gtralt和D.Andreu(编辑)，肽，1990:206-207(1990))。
以各种不同的过程制备肽，每一过程同时合成48种不同的肽。
以Tentagel S AC(Rapp等，固相肽合成的革新和前景，205-210(1990)；sheppard和williams，国际肽和蛋白质研究杂志，20:451-454(1982))，聚乙二醇间隔臂在聚苯乙烯基质上的移植聚合体作为树脂(每种肽40-60mg，上样10μmol Fmoc氨基酸)。
经过向各反应容器中加入90μl在NMP中的0.67MBOP(Gausepohl等，肽241-243(1988)；Castro等，Tett.Lett.14:1219-1222(1975)),20μl在NMP中的NMM2/1(v/v)和100μl在NMP(超出6倍)中的0.60M的合适的Fmoc氨基酸(Fields和Noble，国际肽和蛋白质研究杂志，35:161-214(1990))的溶液进行重复偶联。在70％的反应时间时，向各反应容器中加入大约50μl二氯甲烷。
经过向各反应容器中加入3次0.8ml哌啶/DMA1/4(v/v)进行Fmoc-去保护。
随合成的进行，偶联和去保护时间增加，开始分别为30分钟和3分钟3次。
偶联和Fmoc-去保护后用1.2ml DMA进行6次洗涤。获得所需序列并去掉最后的Fmoc保护后，分别用DMA、二氯甲烷、二氯甲烷/乙醚1/1(v/v)和乙醚充分洗涤肽基树脂并干燥。肽裂解和分离经过以5分钟的间隔向各反应容器中6次加入200μl TFA/水19/1(v/v)而从树脂裂解肽并去掉侧链保护基团，从而产生游离羧基肽。对于含Trp肽，使用TFA/水/巯基乙烷18/1/1/(v/v/v)。
首次TFA加入2小时后，经过加入10ml乙醚/戊烷1/1(v/v)并冷却到-20℃从合并的过滤物中沉淀肽。离心(-20℃,2500g，10分钟)分离肽。
用乙醚/戊烷1/1(v/v)处理沉淀并以相同的离心程序分离后，在45℃干燥肽15分钟。
将各种肽溶解于2ml水(或2ml 10％体积的乙酸)中，溶液在液氮中冷冻3分钟，且边离心(1300rpm,8-16h)边冻干。分析和纯化以反相HPLC测定肽的纯度；将大约50nmol的等份试样溶于100μl 30％体积的乙酸中。对30μl该溶液应用备有三种溶剂的RP-HPLC系统A水，B乙腈，C2％体积的TFA水溶液。
在30分钟内从90％A、5％B、5％C到20％A、75％B、5％C进行梯度洗脱(1.0ml/分钟)。在214nm处检测。
以质谱法在PDMS上分析随机所取的样品。经过在PDMS上经质谱法和在HP Aminoquant上进行水解后的定量氨基酸分析来分析所有31种结合肽。在所有分析的样品中，计算和测定质量间的差异在所用仪器厂商限定的实验误差(O.1％)范围内。所有氨基酸组成与预期一样。实施例2肽在已冻干的所有71种MAGE-2肽中，称重lmg并溶于10μlDMSO中。在所有溶解的肽中，在0.9％NaCl中制备0.5mg/ml的稀释溶液并用在蒸馏水中稀释的5％乙酸(CH3COOH,Merck Darmastadt，德国)或在蒸馏水中稀释的1N NaOH(Marck Darstadt，德国)，将pH中和至pH7。细胞在补充有100IU/ml青霉素(Biocades Pharma,Leiderdorp,TheNetherlands)、100μg/ml卡那霉素(Sigma St.Louis,USA)、2mM谷氨酰胺(ICN Biomedicals Inc.Costa Mesa,CA,USA)和10％的胎牛血清(FCS,Hyclone Laboratories Inc.Logan,Utah,USA)的Iscove’s改良的Dulbecco’s培养基(Biochrom KG Seromed Berlin，德国)中培养174CEM.T2细胞。在37℃、5％CO2的加湿空气中以2.5×105/ml的密度培养细胞。肽结合将174CEM.T2细胞在无FCS的培养基中洗涤2次并放入无血清培养基中至2×106个细胞/ml的密度。将40μl该悬液与10μl在0.9％NaCl中的单独肽稀释液(范围为500μg/ml至15.6μg/ml)中的2倍系列稀释液一起加入V型底96孔平板(Greiner GmbH,Frichenhausen，德国)中。终浓度范围为每8×104个174CEM.T2细胞200μg/ml到3.1μg/ml肽。轻轻搅拌该溶液3分钟，之后在37℃,5％CO2的加湿空气中培养16小时。然后用100μl 0.9％NaCl、0.5％牛血清白蛋白(Sigma St.Louis,USA)、0.02％NaN3(MerckDarmstadt，德国)洗涤细胞一次。经过一轮1200rpm离心后，将沉淀重悬于50μl饱和量的HLA-A2.1特异性小鼠单克隆抗体BB7.2中4℃ 30分钟。然后将细胞洗涤2次并与1∶40稀释且总体积为25μ1的与异硫氰酸荧光素(Tago Inc.Burlingame,CA,USA)连接的羊抗小鼠IgG的F(ab)2片段温育30分钟。
最后一次温育后，将细胞洗涤2次并在FACScan流式细胞光度计(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ.USA)中的488纳米处测量荧光。使用荧光指数对肽浓度的布点图测定HLA-A2.1对174CEM.T2细胞达到0.5倍最大正调节量时的浓度。结果在表Ⅰ中显示。表Ⅰ．满足HLA-A2.1基序(Falk等1991,Hunt等，1992和Nijman等，1993编辑)的来自人黑色素瘤相关性蛋白质MAGE-2的肽的结合亲和性。肽号 序列 残基 诱导0.5倍最大F1的肽浓度GLEARGEALGL15- 25 ＞100μg/mlGLEARGEAL 15- 23 60μg/ml4ALGLVGAQA 22- 30 ＞100μg/mlGLVGAQAPA 24- 32 65μg/mlDLESEFQAA 100-108 ＞100μg/mlDLESEFQAAI100-109 ＞100μg/mlAISRKMVELV108-117 ＞100μg/mlAISRKMVEL 108-116 ＞100μg/ml2 KMVELVHFL 112-120 40μg/mlKMVELVEFLL112-121 ＞100μg/mlKMVELVEFLLL 112-122 ＞100μg/mlLLLKYRAREPV 120-130 ＞100μg/mlLLKYRAREPV121-120 ＞100μg/ml3 VLRNCQDFFFPV 139-149 ＞100μg/ml4 VIFSKASEYL149-158 35μg/mlYLQLVFGIEV157-166 35μg/mlYLQLVFGIEVV 157-167 ＞100μg/ml5 QLVFGIEVV 159-167 25μg/ml6 QLVFGIEVVEV 159-169 30μg/mlGIEVVEVVPI163-172 ＞100μg/mlPISELYLLV 171-179 55μg/mlELYILVTCL 174-182 ＞100μg/mlELYILVTCLGL 174-184 ＞100μg/mlYILVTCLGL 176-184 ＞100μg/mlCLGLSYDGL 181-189 65μg/mlCLGLSYDGLL181-190 ＞100μg/mlVMPKTGLLI 195-203 ＞100μg/mlVMPKTGLLII195-204 ＞100μg/mlVMPKTGLLIIV 195-205 ＞100μg/mlGLLIIVLAI 200-208 ＞100μg/mlGLLIIVLAII200-209 ＞100μg/mlGLLIIVLAIIA 200-210 ＞100μg/mlLLIIVLAII 201-209 ＞100μg/mlLLIIVLIIA 201-210 ＞100μg/mlLLIIVLAIIAI 201-211 ＞100μg/mlLIIVLAIIA 202-210 ＞100μg/ml7 LIIVLAIIAI202-211 ＞100μg/mlIIVLAIIAI 203-211 20μg/mlIIAIEGDCA 208-216 ＞100μg/mlKIWEELSML 220-228 ＞100μg/ml8 KIWEELSMLEV 220-230 25μg/mlLMQDLVQENYL 246-256 ＞100μg/mlFLWGPRALI 271-279 65μg/ml9 ALIETSYVKV277-286 20μg/mlALIETSYVKVL 277-287 ＞100μg/ml10LIETSYVKV 278-286 30μg/mlLIETSYVKVL278-287 55μg/mlTLKIGGEPHI290-299 ＞100μg/mlEISYPPLEERA 298-308 ＞100μg/ml
174CEM.T2细胞系表达“空出”且不稳定的HLA-A2.1分子，当一种肽与这些分子的肽容纳沟结合时可稳定这些分子。不易降解的稳定的HLA-A2.1分子是与所分析的肽结合的结果。这导致HLA-A2.1分子在细胞表面的表达增加。荧光指数是HLA-A2.1分子正调节量的测量值。荧光指数根据下面的公式计算MF=平均荧光
背景荧光的荧光指数为0。结果为了鉴定能结合174CEM.T2细胞所表达的HLA-A2.1分子的MAGE-2肽，根据van der Bruggen等，科学254:1643-1647(1991)的方法检查MAGE-2r氨基酸序列。检查了所有满足公开的HLA-A2.1结合基序的9、10或11个氨基酸的肽(表Ⅰ)。
只有表Ⅲ中SEQ ID NOS:1-11的肽能以低肽浓度正调节HLA-A2.1分子的表达，表明它们与实施例2所述的HLA-A2.1分子结合。50个其它的肽中没有一个能做到这点。荧光测量的结果在表Ⅰ和Ⅱ中给出。使用FI对各个单独的肽的肽浓度的布点图测定174CEM.T2细胞上的HLA-A2.1分子的0.5倍最大正调节量。
这些实验表明，只有有限部分的满足HLA-A2.1基序的肽具有以高亲和性结合这种HLA分子的能力且因而很可能是被人CTL识别的MAGE-2蛋白质的候选肽，其中人CTL仅识别与HLA分子结合的肽。
表Ⅱ满足延伸的HLA-A2.1基序的(RuPPert等，细胞，74:929-937)的来自人黑色素瘤相关性蛋白质MAGE-2的其它肽的结合亲和性。表Ⅱ肽号序列 残基诱导0.5倍最大F1的肽浓度QTASSSSTL 37-45 ＞100μg/mlQTASSSSTLV 37-46 ＞100μg/mlSTLVEVTLGEV 43-53 45μg/mlVTLGEVPAA 48-56 ＞100μg/mlVTKAEMLESV 130-13970μg/mlVTKAEMLESVL130-140＞100μg/mlVTCLGLSYDGL179-189＞100μg/mlKTGLLIIVL 198-20665μg/mlKTGLLIIVLA 198-20780μg/mlKTGLLIIVLAI198-208＞100μg/mlHTLKIGGEPHI289-299100μg/ml表Ⅲ．来自黑色素瘤蛋白质MAGE-2的肽与HLA-A2.1的结合肽号 氨基酸序列 区域SEQID NO1 STLVEVTLGEV 残基 43-53 1LVEVTLGEV 残基 45-53 22 KMVELVHFL 残基 112-120 33 VIFSKASEYL残基 149-158 44 YLQLVFGIEV残基 157-166 55 QLVFGIEVV 残基 159-167 66 QLVFGIEVVEV 残基 159-169 77 IIVLAIIAI 残基 203-211 88 KIWEELSMLEV 残基 220-230 99 ALIETSYVKV残基 277-2861010LIETSYVKV 残基278-286 11
大多数HLA-A2.1结合肽是根据Falk等，自然351:290-296(1991)；Hunt等，科学255:1261-1263(1992)；和Nijman等，免疫学治疗杂志，14:121-126(1993)的方法使用HLA-A2.1基序发现的。使用Ruppert等，细胞74:929-937(1993)的延伸的HLA-A2.1基序仅发现了一个其它的HLA-A2.1肽。实施例3．本实施例显示了一级免疫反应的体外诱导。作为对诱导一般性一级反应，包括MAGE-2肽的可能性的证实，显示了使用加工缺陷型细胞系174CEM.T2对HPV肽的这类反应。
经过在含有相关肽的培养基中培养T2细胞可增加HLA-A2.1细胞(T2)的表达。T2细胞提供与HLA-A2.1结合的大量相关肽，因而它是较好的提供抗原的细胞(APC)。在最近描述的反应诱导方法中(Kast等，免疫治疗杂志，14:115-120(1993)),T2细胞系用作APC且post-Ficoll单核细胞用作效应器细胞。方法1)肽装载到T2上的HLA-A2.1上。
将浓度为每毫升2×106细胞的T2细胞在T25瓶(BectonDickinson,Falcon,Plymouth England)中的含谷氨酰胺(2mM,ICN生化公司，Costa Meisa,USA)、抗生系(100IU/ml青霉素(Brocadespharma,Leiderdorp,The Netherlands)、100μg/ml卡那霉素(Sigma,St.Louis,USA))和浓度为80μg/ml的选定肽MLDLQPETT(SEQ IDNO:62)的无血清IMDM(=Iscoves改良的Dulbecco培养基BiochromKG,Seromed Berlin，德国)中37℃培养13小时。
2)丝裂霉素C处理来自HPV(APC)的生产T2抗原的细胞离心这些培养的生产T2抗原的细胞，随后以20×106个细胞/ml的密度在无血清RPMI(Gibco Paisley Scotland)培养基中用丝裂酶素C(50μg/ml)在37℃处理1小时。此后在RPMI中洗涤T2细胞3次。
3)准备一级免疫反应诱导向96孔U型底平板(Costar,Cambridge,USA)的所有孔中加入在50μl无血清、完全RPMI培养基(谷氨酰胺(2mM,ICN生化公司，Costa Mersa,USA)、青霉素(100IU/ml,Brocades Pharma,Leiderdopr,The Netherlands)、卡那霉素(100μ/ml,Sigma,St.Louis,USA))和浓度为80μg/ml的肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:21)中的100,000个丝裂霉素C-处理的T2细胞。
4)效应器细胞效应器细胞是HLA-A2.1亚型供体的单核外周血淋巴细胞(PBL)。用Ficoll方法(Ficoll preparation:Lymphoprep ofNycomedpharma,Oslo,Norway)从淡黄色层分离PBL并在RPMI中洗涤2次。分离和洗涤后，将PBL重悬于含30％人合并的血清(HPS)的完全RPMI培养基中(试验HPS在混合的淋巴细胞培养物中的抑制活性)。
5)用于一级免疫反应的培养向已加有T2细胞的96孔U型平板的各孔中加入在50μl培养基中的400,000PBL(培养基在上文第4段中描述)并在含5％CO2和90％湿度的培养箱中37℃培养7天。
6)再刺激(第7天)
在培养上文所述的PBL、肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:21)和T2细胞后第7天，用肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)再刺激PBL。为此，收获96孔中的所有细胞和培养基。以Ficoll方法分离活细胞并在RPMI中洗涤。在新的96孔-U型底平板中，将50,000个活细胞与50μl含15％HPS的完全RPMI培养基一起接种进各孔中。每孔加入20,000个自体的辐射的(3000rad)PBLs和50,000个自体的辐射(10000rad)的EBV-转化的B-淋巴细胞与50μl含15％HPS的完全RPMI培养基和浓度为80μg/ml的肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)。细胞在含5％CO2和90％湿度的培养箱中37℃培养7天。
7)再刺激(第14天)在培养PBL、肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)和T2细胞后的第14天，用肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)再刺激PBL。为此重复上文第6点的方法。
8)以限制稀释法克隆在培养PBL、肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)和T2细胞后第21天，收获96孔中的细胞和培养基。以Ficoll方法分离活细胞并在含15％HPS的完全RPMI中洗涤。经限制稀释克隆这批活细胞的培养物。向新的96孔U型底平板(Costar,Cambridge,USA)各孔中加入50μl含15％HPS的完全RPMI培养基及100个活细胞(=HPV16集体抗MLDLQPETT(SEQ ID NO:62))。对于其它新的96孔-U型底平板，除了各孔中的细胞数外，完全重复该步骤随后的平板含有每孔10,1或0.3个细胞的细胞稀释度。向所有孔中加入4个不同供体的20,000个合并且辐射(3000)过的PBL和3个不同HLA-A2.1供体(VU-4/518/JY)的10,000个合并且辐射(10,000rad)过的EBV-转化的B-细胞以及50μl含15％HPS的完全RPMI培养基和浓度为40μg/ml的肽MLDLQPETT(SE1 IDNO:62)、浓度为2μg/ml(Pharmacia,Uppsala,Sweden)的白细胞凝集素、浓度为120IU/ml的人重组IL-2(Eurocetus,Amsterdam,The Netherlands)。
9)扩展(Expand)克隆以100μl的终体积向各孔中加入-25,000个活细胞，-20,000个辐射过的PBL-合并物(上文描述)-10,000个辐射过的EBV-合并物(上文描述)-2μg肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62)-6IU重组IL-2。
用65个克隆和一批培养物样品作效应器细胞和以T2(含或不含相关肽MLDLQPETT(SEQ ID NO:62))作靶细胞在第49天进行细胞毒性分析。背景杀死定义为用无关(但结合HLA-A2.1)肽GILGFVFTL(SEQ ID NO:64)培养的T2细胞杀死的量。该流感基质蛋白产生的肽是HLA-A2.1限制性流感特异性CTL的表位且在本领域中是已知的。
HPV集体抗SEQ ID NO:62效应器细胞似乎对杀死SEQ IDNO:62敏感性细胞具有特异性。
用HPV集体培养物细胞进行限制性稀释试验，23天后，用5个克隆进行细胞毒性试验。代表性克隆的结果在图2中显示。实施例4已报道了几组需要肽与HLA-A*0201分子结合。例如，Falk等，自然351:290(1991)；Nijman等，欧洲免疫学杂志，23:1215(1993)；Ruppert等，细胞，74:929(1993)(均作为参考文献引用)已阐述了最重要(锚着)和重要(显性)残基。使用这些论文的数据，以Drihout等，人类免疫学，43:1(1995):D’Amaro等，人类免疫学，43:13(1995)，(均作为参考文献引用)所述的筛选程序筛选了MAGE-2推断的氨基酸序列中推断的结合肽。如果存在一个锚着残基和一个显性残基或两个锚着残基，则认为肽满足了参考基序。使用熟知的固相合成技术合成所有这些肽，然后根据作为参考文献引用的van der Burg等，人类免疫学，44:189-198(1995)的内容在肽结合竞争试验中进行试验。简单地说，对于HLA-A*0201为纯合的、且作为EBV转化的B细胞系的细胞系JY经过与冰冷的柠檬酸缓冲液(pH3.2)接触90秒剥离结合肽。(缓冲液为等体积的0.263M柠檬酸和0.123M Na2HPO4)。然后用IMDM洗涤剥离的细胞且随后用补充了1.5μg/mlβ-微球蛋白的IMDM重悬。使用在半胱氨酸残基上用荧光素标记的参考肽，即Phe Leu ProSer Asp Cys Phe Pro Ser Val(SEQ ID NO:63)。在该试验中，将150nMSEQ ID NO:63放于96孔U型底平板的各孔中，并滴定所加入的试验肽的量。将剥离的JY细胞样品(7×105个细胞)与肽在4℃温育24小时。然后用含1％牛血清白蛋白的PBS洗涤细胞，随后用含10％低聚甲醛的PBS固定并分析对荧光标记的参考肽结合的抑制。
使用下式测定抑制
“MF背景”指无参考肽时获得的平均荧光值。“MF参考肽”指仅用150nM参考肽温育后获得的平均荧光值。经过以半对数形式对一些肽的系列稀释结果作布点图可计算50％的抑制(“IC50”)。下面表Ⅳ提供了一些这类数据。当试验的肽是前面实施例中所提到的一种时，规定一个序列鉴定号。星号(*)表明IC50大于100μM，SEQ ID NOS:71,72和73均是现有技术中已知的结合HLA-A*0201分子的肽。
表ⅣIC50SEQ ID NO:1 ＊SEQ ID NO:3 7SEQ ID NO:4 ＊SEQ ID NO:5 7SEQ ID NO:6 47SEQ ID NO:7 26SEQ ID NO:8 *SEQ ID NO:9 10SEQ ID NO:10*SEQ ID NO:11*SEQ ID NO:13*SEQ ID NO:1530SEQ ID NO:2780SEQ ID NO:3142SEQ ID NO:47 6sEQ ID NO:48*Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val (SEQ ID NO:64) 17Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val (SEQ ID NO:65) *Lys Ala Ser Glu Tyr Leu Gln Leu Val (SEQ ID NO:66) 14Gln Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile (SEQ ID NO:67) 82Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu (SEQ ID NO:68) 27Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr (SEQ ID NO:69) 9Phe Leu Pro Ser Asp Asp Phe Pro Ser Val (SEQ ID NO:70) 1Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu (SEQ ID NO:71) 3Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val (SEQ ID NO:72) 9应注意，当使用低浓度时，除了对照外，只有7个肽能抑制参考肽的结合，即，SEQ ID NOS:3,5,9,47,64,66和69。然后在进一步的实验中试验了这些肽。实施例5在4℃下进行实施例4的实验，以排除温度作为影响复合物稳定性的因素。在37℃的人生理学温度下进行第二组实验。基本上按照van der Burg等，免疫学杂志，156(1)33087的方法进行。按实施例4所述用土根碱处理JY细胞以终止蛋白质合成。这防止了细胞在其表面提供新合成的HLA-A*0201分子。然后，经过使用弱酸处理剥离细胞提供的肽。随后将它们与200μg/ml浓度的试验肽接触。然后用冷的Iscover氏改良的Dulbecco’s培养基(IMDM)洗涤结合肽的细胞并在起始时间=0时在37℃下在IMDM中温育2,4和6小时。经过用可从美国典型培养物保藏中心获得的HLA-A2构象特异性单克隆抗体BB7.2和GaM-Fitc染色细胞可测量存在的HLA-A*0201肽复合物的量。接触步骤按FACScan分析法进行。然后，使用下式计算荧光指数
其中，MF背景是无肽时获得的值。各样品试验2次，以所列的各时间点计算平均FI。经过找到t=0时的FI，然后应用下式计算残留的HLA-A2分子的百分数％剩余(t=n)=(FIt=n/FIt=0)×100已知肽与MHC的解离是一个线型过程。还已知肽形成长期稳定复合物的能力与体外肽的免疫原性相关。(参见，例如，van der Burg等，出处同上)。因此，在50％的分子衰变时测量肽的稳定性，从t=2时开始测量。对于与剩余的HLA-A2分子百分数进行布点作图的系列测量值进行线型回归分析可计算DT50。在上面所列的7个肽中，SER ID NOS:3,5和9在37℃以超过6小时的DT50诱导肽-HLA-A*0201复合物。其它肽显示较低水平的亲和力。表Ⅴ肽 IC50DT50SEQ ID NO:3 7 ＞6SEQ ID NO:5 7 ＞6SEQ ID NO:910 ＞6SEQ ID NO:4763SEQ ID NO:64 174SEQ ID NO:66 14 3.5SEQ ID NO:6995试验肽SEQ ID NOS:71和72均具有大于6的DT50值。实施例6试验了上文所列的肽的免疫原性。在这些实验中，使用转基因HLA-A*0201Kb小鼠。这些小鼠表达嵌合的HLA-A*0201Kb基因产物，其中HLA-A*0201的α3结构域被鼠H-2Kbα3结构域取代。所得的分子结合HLA-A*0201分子，并与鼠CD8+细胞相互作用。
使用2-3只动物一组的小鼠。用在不完全Freund氏佐剂中乳化的50μg肽与140μg作为参考文献引用的MiUich等，美国科学院院刊85:1610(1988)所述的HBV核心抗原产生的T辅助表位混合物在侧面注射各小鼠。14天后用相同混合物加强注射动物。最后一次注射后11-14天处死小鼠，将其脾细胞通过尼龙绒，在静止的T25组织培养瓶中用补充了青霉素、8％热灭的FCS和20μM 2-巯基乙醇的IMDM中用1×107个彻底洗涤后的结合了同源肽的LPS诱导的淋巴母细胞体外再刺激3×107个细胞样品。在5％CO2加湿的空气中37℃下培养培养物6天，然后试验这些集体培养物的细胞裂解活性。它包含根据，例如，De Waal等，免疫学杂志，125:2665(1983)；Bouma等，人类免疫学，35:85(1992)所述的标准51Cr或荧光铕稀放分析。简单地说，在37℃下用10μg/ml肽结合标记的靶细胞至少20分钟。然后用等量的靶细胞温育滴定量的效应器细胞至少4小时。以每组6个测量自发释放和最大释放。当在结合有特异性肽的靶细胞的细胞毒性分析中的裂解与未结合的靶细胞的背景裂解相比，以两者E/T比率至少高10％时，认为反应为阳性。图3A-3D提供了SEQ ID NO:3,5和9，以及试验肽SEQ ID NO:71的阳性集体培养物的结果。剩下的肽不具有免疫原性。实施例7随后在TNF释放分析中试验上文所述的集体CTL培养物。具体地说，使用Seed等，美国科学院院刊84:3365(1987)的熟知的DEAE-葡聚糖氯套方法用克隆进pcDNAⅠ/Amp的HLA-A*0201Kb、MAGE-2和/或酪氨酸酶cDNA转染COS-7细胞。48小时后，弃去培养基，在TNF释放试验中使用COS-7细胞作为刺激细胞。简单地说，向转染的COS-7细胞中加入5×103个鼠集体培养物细胞，或2×103个人CTL。24小时后，收获上清并使用TNF敏感性WEHI164克隆13细胞测定的TNF内容物。
来自用肽SEQ ID NOS:3和5免疫的小鼠的集体培养物显示出识别用HLA-A*0201Kb和MAGE-2转染的COS-7细胞，表明这两个肽由HLA-A*0201加工和提供。
数据表明，SEQ ID NOS:1-11的肽是鉴定序列的单肽。然而，这些肽的同源物，同工型或遗传变异体可能存在于细胞环境内或外。本发明包含能结合HLA-A2分子的上述的所有这些同源物，同工型或遗传变异体。
作为该肽同源物的多肽具体包括具有相对于表Ⅱ所述氨基酸序列至少大约40％保守、优选至少大约60％保守、更优选至少大约75％保守的氨基酸序列的那些多肽。
本领域的普通技术人员应明白上文所示肽的其它变异体应包括在本发明范围内。这特别是包括与上述合成肽区别仅在于保守氨基酸取代的任何变异体。具体地说，包括以A(丙氨酸)，S(丝氨酸)，α-氨基丁酸和其它氨基酸取代C(半胱氨酸)，因为已知含半胱氨酸的肽在合成和处理期间容易(被空气)氧化。Taylor，分子生物学杂志188:233-258(1986)阐述了许多这类保守的氨基酸取代。
上文显示的本文的肽或其片段包括氨基酸序列上的任何变异，不管是保守氨基酸取代，缺失还是其它加工，前提是这类肽能结合HLA-A2分子。当所说的多肽结合HLA-A2.1分子时，肽片段可以是具有小到5个或更多个氨基酸的序列的小肽，所说的序列是表Ⅱ中公开的那些序列，前提是所说的多肽能结合HLA-A2.1分子。
特别是比所示的肽更大的多肽也包括在本发明的范围内，前提是所说的多肽在HLA-A2.1阳性个体中诱导MAGE-2特异性CTL反应且含有表Ⅱ所述的一种(部分)氨基酸序列或其保守取代。该多肽可具有9到12，更优选9到11或甚至9到10个氨基酸的长度。
本发明包括以各种方法，不论是遗传工程、固相技术肽合成，还是其它方法产生的多肽的应用。上述肽可在末端进行各种化学修饰且仍在本发明的范围内。其它的化学修饰也是可能的，特别是环状和二聚体构象。术语“衍生物”覆盖所有这类修饰的肽。
发现本发明的多肽可用于预防、诊断和/或治疗或防止涉及包括黑色素瘤细胞和其它癌细胞的MAGE-2表达细胞的疾病。
对于所有应用，可按免疫原性形式施用肽。由于该肽相当短，因此它必需与提供免疫原性的结合载体物质，如脂类或其它物质混合、复合、偶连或化合，或者使用佐剂。
当然，本发明的肽的预防或治疗剂量的大小随病人类型(年龄、性别、体重等)，所需治疗的症状的严重性、本发明的特定肽及其用药途径的不同而变化。可采用任何合适的用药途径以获得本发明所鉴定的多肽的有效量以及药剂学领域熟知的任何剂量形式。另外也可经过控制释放工具和/或传递装置施用该多肽。它们也可与其它活性物质，如，特别是T-细胞激活剂类白细胞介素-2等结合用药。
本发明的肽也可用于其它目的，如诊断学用途。例如，它们可用于检查用根据本发明的肽免疫接种是否成功。这可通过试验所说的肽是否能激活被接种人的T细胞而在体外进行。
如上所述，本发明还包含对HLA-A2分子复合物，如HLA-A*0201和特定肽具有特异性的分离的溶胞性T细胞克隆(“CTLs”)及体内产生它们的方法。在说明书中的“产生”基本上指经过HLA-A2分子提供特定的肽刺激CTLs的增生。例如，通过选用需要其它CTL的受试者可做到这一点。
不是所有的肽和HLA-A2分子的复合物均导致CTL增生；然而，肽对其靶HLA-A*0201分子的特异性仍然使其可用作诊断标记以便将细胞分类成HLA-A2阳性或阴性。
本发明的其它方面对技术人员而言是显而易见的，在此不必重复。
已采用的术语和表达用作描述术语而不是限制，在使用这些术语和表达时不打算排除所显示和所描述的特征的任何等价物或其部分，因为应认识到在本发明范围内可作出各种修改。(1)一般信息(ⅰ)申请人(ⅱ)发明名称来自MAGE-2的分离的肽，对肽和HLA-A2分子复合物特异性的溶胞性T细胞及其应用(ⅲ)序列数69
(ⅳ)联系地址(A)联系人Felfe&Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约城(D)州纽约州(E)国家美国(F)邮编10022(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型5.25inch软盘，360kb存储量(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(ⅵ)最近申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅵ)在先申请数据(A)申请号08/217,188(B)申请日1994年3月24日(ⅷ)律师/代理人信息；(A)姓名Hanson,Norman D.
(B)登记号30,946(C)参考/文摘号LUD5447(ⅸ)电信信息(A)电话(212)688-9200(B)电传(212)838-3884(2)序列鉴定号1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Ser Thr Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val1 5 10(2)序列鉴定号2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Leu Val Glu Val Thr Leu Gly Glu Val1 5(2)序列鉴定号3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu1 5(2)序列鉴定号4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Glu Tyr Leu1 5 10(2)序列鉴定号5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Tyr Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val1 5 10(2)序列鉴定号6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val Val1 5(2)序列鉴定号7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val Val Glu Val1 5 10(2)序列鉴定号8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala Ile1 5(2)序列鉴定号9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Met Leu Glu Val1 5 10(2)序列鉴定号10的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Ala Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val1 5 10(2)序列鉴定号11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val1 5(2)序列鉴定号12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu1 5 10(2)序列鉴定号13的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Gly Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu1 5(2)序列鉴定号14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala1 5(2)序列鉴定号15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala1 5(2)序列鉴定号16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala1 5(2)序列鉴定号17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Ile1 5 10(2)序列鉴定号18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:Ala Ile Ser Arg Lys Met Val Glu Leu Val1 5 10(2)序列鉴定号19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:Ala Ile Ser Arg Lys Met Val Glu Leu1 5(2)序列鉴定号20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu Leu1 5 10(2)序列鉴定号2l的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu1 5 10(2)序列鉴定号22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:22:Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val1 5 10(2)序列鉴定号23的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val1 5 10(2)序列鉴定号24的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:Val Leu Arg Asn Cys Gln Asp Phe Phe Pro Val1 5 10(2)序列鉴定号25的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:Tyr Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Val Val1 5 10(2)序列鉴定号26的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:Gly Ile Glu Val Val Glu Val Val Pro Ile1 5 10(2)序列鉴定号27的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:Pro Ile Ser His Leu Tyr Ile Leu Val1 5(2)序列鉴定号28的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:His Leu Tyr Ile Leu Val Thr Cys Leu1 5(2)序列鉴定号29的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:His Leu Tyr Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu1 5 10(2)序列鉴定号30的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:Tyr Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu1 5(2)序列鉴定号31的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu1 5(2)序列鉴定号32的信息:
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(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile1 5(2)序列鉴定号34的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:Val Mer Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile1 5 10(2)序列鉴定号35的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val1 5 10(2)序列鉴定号36的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile1 5(2)序列鉴定号37的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile1 5 10(2)序列鉴定号38的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala1 5 10(2)序列鉴定号39的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile1 5(2)序列鉴定号40的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala1 5 10(2)序列鉴定号41的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala Ile1 5 10(2)序列鉴定号42的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala1 5(2)序列鉴定号43的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile Ala Ile15 10(2)序列鉴定号44的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:Ile Ile Ala Ile Glu Gly Asp Cys Ala1 5 10(2)序列鉴定号45的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:Lys Ile Trp Glu Glu Leu Ser Met Leu1 5(2)序列鉴定号46的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:Leu Met Gln Asp Leu Val Gln Glu Asn Tyr Leu1 5 10(2)序列鉴定号47的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile1 5(2)序列鉴定号48的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu1 5 10(2)序列鉴定号49的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49:Ala Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu1 5 10(2)序列鉴定号50的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50:Thr Leu Lys Ile Gly Gly Glu Pro His Ile1 5 10(2)序列鉴定号51的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51:His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His Glu Arg Ala1 5 10(2)序列鉴定号52的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52:Gln Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu1 5(2)序列鉴定号53的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53:Gln Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val1 5 10(2)序列鉴定号54的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54:Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala1 5(2)序列鉴定号55的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55:Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val1 5 10(2)序列鉴定号56的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56:Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val Leu1 5 10(2)序列鉴定号57的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57:Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu1 5 10(2)序列鉴定号58的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型
(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58:Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu1 5(2)序列鉴定号59的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59:Lys thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala1 5 10(2)序列鉴定号60的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60:Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile1 5 10(2)序列鉴定号6l的信息(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61:His Thr Leu Lys Ile Gly Gly Glu Pro His Ile1 5 10(2)序列鉴定号62的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(C)拓扑学线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:62:Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr1 权利要求
1.对HLA-A2分子与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQID NO:9之一的复合物具有特异性的分离的溶胞性T细胞克隆。
2.权利要求1的分离的溶胞性T细胞克隆，其中所说的分离的溶胞性T细胞克隆对HLA-A2分子的复合物具有特异性。
3.权利要求1的分离的溶胞性T细胞克隆，其中所说的分离的溶胞性T细胞克隆对HLA-A2分子与SEQ ID No:5的复合物具有特异性。
4.权利要求1的分离的溶胞性T细胞克隆，其中所说的分离的溶胞性T细胞克隆对HLA-A2分子与SEQ ID No:9的复合物具有特异性。
5.在受试者中诱导产生溶胞性T细胞的方法，包含给细胞上存在HLA-A2分子的受试者施用SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQID No:9中的至少一种，施用量足以诱导针对HLA-A2与SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:9之一的复合物的溶胞性T细胞的增生。
6.权利要求5的方法，其中所说的受试者需要溶胞性T细胞增生。
7.选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69的分离的肽。
全文摘要
本发明公开了来自MAGE－2分子且结合HLA－A*0201分子的新肽。其中一些特别有用,因为当它们与其HLA－A*0201配偶性分子复合时可诱导CTL增生。
文档编号A61K35/26GK1226897SQ97196749
公开日1999年8月25日 申请日期1997年7月24日 优先权日1996年7月25日
发明者科内利斯·J·M·梅利夫, M·W·维塞伦, 舒尔德·范德堡, 皮埃尔·范德布鲁根, 蒂埃里·布恩法勒尔 申请人:路德维格癌症研究所, 莱顿大学