专利名称：杀菌肽－x纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于药物化学技术领域。具体涉及一种杀菌肽-X纯化工艺。
背景技术：
杀菌肽因为具有杀伤抗生素耐药菌，病毒和肿瘤细胞等作用，以及其极低的毒副作用，正在农业、畜牧业、医药及食品工业中显示出越来越广阔的应用前景。
通常早期研制和应用的杀菌肽均是从昆虫体液等天然物质中提取的，来源途径广泛，但含量极低，提取步骤繁杂，很难获得大量高纯度的杀菌肽。随着分子生物学技术的广泛应用，人们开始采用酵母体系及昆虫或昆虫细胞体系进行基因表达，如中科院上海生物工程研究中心杨胜利，屈贤铭等完成了抗菌肽Magainin基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达(2002年18卷4期中国生物化学与分子生物学报)；南京农业大学的张素芳等完成了重组magainin抗菌肽表达条件的优化及其对抑菌活性的影响(2004年24卷11期中国生物工程杂志)；南京师范大学张杰等完成了抗菌肽CM4基因克隆及其在毕赤酵母中的表达鉴定(2005年45卷5期微生物学报)；第二军医大学仲燕等完成了东海贻贝抗菌肽Myticin A基因的克隆表达及其生物学活性(第二军医大学学报2005年26卷1期)；中国热带农业科学院吴代飞等完成了抗菌肽B基因的点突变及在昆虫细胞中的表达(1999年20卷3期热带作物学报)；南京军区军事医学研究所张林元和南京师范大学赵东红等完成了中国家蚕抗菌肽人工合成类CMIV基因在甜菜夜蛾虫体内的表达(2001年41卷6期微生物学报)。但对杀菌肽这类小肽而言，从工业化生产的角度考虑，以具有成本低、周期短、表达水平高、易于操作等优点的大肠杆菌作为表达体系较为理想。因此，相关研究单位对在大肠杆菌中表达抗菌肽进行了各种尝试，如北京化工大学吴卫华等对重组阳离子抗菌肽的初步研究(2003年30卷2期北京化工大学学报)；四川大学冯云等进行的人抗菌肽FALL-39在大肠杆菌中高效表达(2003年20卷4期生物医学工程学杂志)；第三军医大学许波等进行的抗菌肽葛佬素在大肠杆菌BL21中的表达(2003年1卷1期中华医药卫生)；华东理工大学周宇荀等进行的抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培养条件的优化及分批发酵研究(2005年21卷4期生物工程学报)等。因而进一步探索合适的分离纯化工艺以制备高纯度的杀菌肽引起了研究者的关注。本发明人在完成杀菌肽-X的基因设计和在大肠杆菌中的高效表达后，成功地建立了一整套适合于大规模制备高纯度杀菌肽-X的分离纯化工艺，使用这一工艺可制备“克”级(重量)水平的杀菌肽-X应用于临床前试验。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于应用由大肠杆菌发酵得到的包涵体制备有生物活性的杀菌肽-X。
本发明提供了一种杀菌肽-X的纯化工艺。
本发明的工艺是对杀菌肽-X发酵工艺制得的发酵产物进行纯化。本发明人曾对杀菌肽-X发酵工艺进行了改进并提交中国专利申请200610026829.4。该发酵工艺包括下列步骤(1)发酵种子菌体OD600在0.48～1.0菌种种龄的种子；(2)发酵培养基改良的TB培养基，每升培养基中含细菌培养用胰化蛋白胨12g，细菌培养用酵母提取物24g，甘油4ml，KH2PO4 2.31g，K2HPO4·3H2O含量在1.64g/L～16.4g/L；(3)发酵工艺在发酵罐中加入培养基，接种OD600在0.48～1.0的菌种，在通气量160l/h，罐压0.02～0.04MPa，温度37℃，搅拌转速150r/min的条件下，发酵12小时。
本发明的杀菌肽-X纯化工艺的主要步骤如下
(1)菌体OD600在0.48～1.0菌种种龄的种子，经改良的TB培养基发酵，发酵结束后，5000r/min离心发酵液10min收集菌体，悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液中，均质机破碎细胞，压力为8×107Pa～9×107pa，10000r/min离心破碎细胞15min收集沉淀，依次用0.02mol/L磷酸缓冲液，0.5％NaCl/Triton，PH 8.0 TE(10mM Tris/0.5mMEDTA)溶液，2％脱氧胆酸钠，2mol/L尿素洗涤沉淀，得到包涵体，其中主要成分为融合蛋白，即肿瘤坏死因子b-杀菌肽-X；(2)将溶解在0.2Mol/L盐酸中的6mol/L的盐酸胍作为包涵体的变性剂，包涵体在变性剂中溶解充分，加入CNBr适量，于18～25℃避光反应24h；(3)将第(2)步得到的反应液装入相应的透析袋中，对20～25倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液透析，其中缓冲液pH选择6.00，透析时间48h，换透析液4次，整个期间透析液温度为0～4℃；(4)透析结束后，12000r/min 4℃离心20min后，收集上清液，用RP-HPLC检测纯度，同时将上清和沉淀进行SDS-PAGE检测CNBr切割效率；(5)取第(4)步得到的上清液上CM-52纤维素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸缓冲液pH6.00梯度洗脱，收集洗脱峰，各取5μl点E.coli K12D31的测活板，37℃培养过夜，次日观察抑菌圈，再取有抑菌活力的洗脱峰用RP-HPLC检测纯度。
(6)取第(5)步得到的主峰对超纯水透析去盐后，测定蛋白浓度并冻干，最后置于4℃长期保存。
本发明工艺在包涵体洗涤过程中，每种溶液均洗至离心上清澄清为止，由此得到的包涵体中融合蛋白的含量可达60％～80％，去除了大部分菌体蛋白。
在包涵体变性剂的选择中，本发明试用了6mol/L的尿素、8mol/L的尿素和6mol/L的盐酸胍(此时酸浓度都为1.0mol/L)。在溶解包涵体的过程中，6mol/L的盐酸胍表现出最好的溶解度。考虑到包涵体变性过程中二硫键的影响，本发明人又尝试在6mol/L和8mol/L的尿素溶解包涵体时加入终浓度为30mM的还原型谷胱甘肽(GSH)。经过相同的切割和透析过程，最终得到离心产物的沉淀和上清分别用SDS-PAGE和RP-HPLC检查，结果显示用盐酸胍做变性剂能达到最好的切割效率，并且上清中的可溶性杀菌肽-X含量最高；8mol/L的尿素溶解能力略高于6mol/L的尿素，而加入GSH对提高尿素的溶解能力影响不大，反而在透析过程中帮助了某些杂蛋白的复性而使透析上清的组分变得更为复杂影响了下一步的分离纯化。根据上述结果本发明选择6mol/L的盐酸胍为包涵体变性剂。.
考虑到溶液pH值对蛋白质稳定性的影响，本发明试验了变性剂酸浓度的变化。本发明选择了0.1Mol/L，0.2Mol/L，0.5Mol/L和1.0Mol/L盐酸溶解盐酸胍，其它条件不变，将第(4)步得到的离心产物用SDS-PAGE检测，结果显示0.1Mol/L盐酸体系内包涵体切割较少，产物上层为乳浊状；0.2Mol/L，0.5Mol/L和1.0Mol/L盐酸体系则切割较充分，都能达到75％左右，且都得到澄清溶液。因此，本发明选择0.2Mol/L的盐酸—6Mol/L的盐酸胍体系作为包涵体变性剂。
切割结束后，进行透析液和透析温度的选择，以透析上清中目的蛋白杀菌肽-X含量和稳定性为标准。
实验证明，对透析液种类而言，相对于甲酸铵缓冲液、醋酸铵缓冲液和柠檬酸缓冲液，利用磷酸缓冲液得到的第(4)步上清纯度高且稳定。同时考虑到缓冲液pH对蛋白质的影响，我们选择pH为5.30、6.00和6.30磷酸缓冲液进行比较。将由第(2)步得到的反应液均分成3份，分别对pH5.30，6.00和6.30的0.05mol/L磷酸缓冲液透析，得到的透析产物离心上清用RP-HPLC检测杀菌肽-X的含量，结果证明由pH6.00的磷酸缓冲液得到的上清中杀菌肽-X含量高，且稳定性好，在4℃放置两周，目的蛋白含量下降不超过10％。因此最终选择pH6.00的磷酸缓冲液为第(2)步中的透析缓冲液。
考虑到第(2)步中透析时间较长，因此在以pH6.00的磷酸缓冲液为透析缓冲液时进行了温度对透析液中杀菌肽-X稳定性的考察，结果发现0～4℃明显优于10℃和常温25℃，有效的防止了目的蛋白的降解。
总结以上试验，选定保持0～4℃的pH6.00的磷酸缓冲液为第3步中的透析体系。
通过本发明工艺可制得稳定高纯度的水溶性杀菌肽-X。将此杀菌肽-X应用于初期抗恶性肿瘤的体外细胞实验和体内的动物实验，证明杀菌肽-X疗效明显，且重复性极好。
本发明工艺主要解决了发酵后包涵体纯化；融合蛋白变性剂种类及酸浓度的选择；透析缓冲液种类及pH选择；透析温度的选择。用以上得出的最佳条件分离纯化杀菌肽-X，经紫外光吸收法测定活力峰蛋白含量后可知，1g包涵体可稳定得到10mg纯度在95％以上的杀菌肽-X。以每罐20L发酵液得到100g包涵体计算，最终每罐发酵液就可得到1g的纯度＞95％的杀菌肽-X。
具体实施例方式实施例11、将已纯化的包涵体20克用200mL 0.2Mol/L的盐酸——6Mol/L的盐酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反应24h。
2、将上述反应液装入透析袋中，对20倍体积的常温PH6.00的0.05mol/L磷酸缓冲液透析，透析共用48h，其间换透析液4次。
3、透析结束后，12000r/min 4℃离心20min后，收集上清液，放置4℃冰箱，分别在第1天，第3天，第7天和第14天用HPLC检测杀菌肽-X的含量。具体结果见表一表一透析产物中杀菌肽-X的稳定性时间(天) RP-HPLC检测得到的透析液上清中杀菌肽-X的含量(％)1 61.73 62.17 62.21456.1实施例21、将已纯化的包涵体20克用200mL 0.2Mol/L的盐酸——6Mol/L的盐酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反应24h。
2、将上述反应液均分后装入等容积的透析袋中，分别置等体积0～4℃、10℃和常温(25℃左右)的pH6.00的磷酸缓冲液中，透析48h，其间换透析液4次，且在透析期间保持温度恒定。
3、透析结束后，12000r/min 4℃离心20min后，收集上清液，分别用HPLC检测杀菌肽-X的含量。具体结果见表二。
表二透析温度对杀菌肽-X稳定性的影响温度(℃)RP-HPLC检测得到的透析液上清中杀菌肽-X的含量(％)0-4 79.710 70.325 62.34、取上述上清上CM-52纤维素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸缓冲液(pH6.00)梯度洗脱。收集活力峰用RP-HPLC检测。由0～4℃透析得到的上清经CM-52纤维素柱分离，活力峰纯度可保证在95％～98％，进行SDS-PAGE检测，呈银染一条带。
实施例31、将已纯化的包涵体20克用200mL 0.2Mol/L的盐酸——6Mol/L的盐酸胍充分溶解，加入CNBr，22℃避光反应24h。
2、将上述反应液装入透析袋中，对20倍体积0～4℃的pH6.00的0.05mol/L磷酸缓冲液透析，透析共用48h，其间换透析液4次，且在透析期间保持温度恒定。
3、透析结束后，12000r/min 4℃离心20min后，收集上清液。由RP-HPLC检测上清液中杀菌肽-X的含量为82.3％。
4、取上清液上CM-52纤维素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸缓冲液pH6.00梯度洗脱。RP-HPLC检测收集的活力主峰，其中杀菌肽-X的含量达到98.8％；SDS-PAGE检测，呈银染一条带。
5、取上述活力主峰对超纯水透析去盐后，测定蛋白浓度，计算得到杀菌肽-X232mg。冻干后置于4℃长期保存。
权利要求
1.一种杀菌肽-X纯化工艺，其特征在于该工艺包括下列步骤(1)菌体OD600在0.48～1.0菌种种龄的种子，经改良的TB培养基发酵，发酵结束后，5000r/min离心发酵液10min收集菌体，悬浮于0.02mol/L磷酸缓冲液中，均质机破碎细胞，压力为8×107Pa～9×107Pa，10000r/min离心破碎细胞15min收集沉淀，依次用0.02mol/L磷酸缓冲液，0.5％NaCl/Triton，pH 8.0 10mMTris/0.5mM EDTA溶液，2％脱氧胆酸钠，2mol/L尿素洗涤沉淀，得到包涵体，其中主要成分为融合蛋白，即肿瘤坏死因子b-杀菌肽-X；(2)将溶解在0.2Mol/L盐酸中的6mol/L的盐酸胍作为包涵体的变性剂，包涵体在变性剂中溶解充分，加入CNBr适量，于18～25℃避光反应24h；(3)将第(2)步得到的反应液装入相应的透析袋中，对20～25倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液透析，其中缓冲液pH选择6.00，透析时间48h，换透析液4次，整个期间透析液温度为0～4℃；(4)透析结束后，12000r/min 4℃离心20min后，收集上清液，用RP-HPLC检测纯度，同时将上清和沉淀进行SDS-PAGE，检测CNBr切割效率；(5)取第(4)步得到的上清液上CM-52纤维素柱，用0.05-0.70Mol/L的磷酸缓冲液pH6.00梯度洗脱，收集洗脱峰，各取5μl点E.coli K12D31的测活板，37℃培养过夜，次日观察抑菌圈，再取有抑菌活力的洗脱峰用RP-HPLC检测纯度。
2.根据权利要求1所述的一种杀菌肽-X纯化工艺，其特征在于其中所述步骤(1)得到的包涵体中融合蛋白，即肿瘤坏死因子b-杀菌肽-X含量为60％～80％。
3.根据权利要求1所述的一种杀菌肽-X纯化工艺，其特征在于其中所述步骤(2)包涵体的变性剂为溶解在0.2Mol/L盐酸中的6mol/L的盐酸胍。
4.根据权利要求1所述的一种杀菌肽-X纯化工艺，其特征在于其中所述步骤(3)切割产物的透析条件为0～4℃，pH6.00的磷酸缓冲液。
全文摘要
本发明提供了一种杀菌肽－X纯化工艺，通过本发明工艺可制得稳定高纯度的水溶性杀菌肽－X。将此杀菌肽－X应用于初期抗恶性肿瘤的体外细胞实验和体内的动物实验，证明杀菌肽－X疗效明显，且重复性极好。本工艺主要解决了发酵后包涵体纯化；融合蛋白变性剂种类及酸浓度的选择；透析缓冲液种类及pH选择和透析温度的选择。利用所选定的条件，1g包涵体可稳定得到10mg纯度在95％以上的杀菌肽－X。
文档编号C07K1/00GK101089188SQ20061002765
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月13日 优先权日2006年6月13日
发明者沈益, 劳学刚, 张洪祖, 徐贤秀 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂, 南京大学