专利名称：杀菌肽－x基因构建、生产工艺及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程生产多肽药物技术领域。
杀菌肽是瑞典科学家Boman于1980年首先从惜古比天蚕中发现的，后来科学家们又从其他蚕类和蝇类发现多种杀菌肽。在80年代人们都是从昆虫中分离纯化杀菌肽，并进行了结构分析及生物学活性的研究。结果表明杀菌肽是一类碱性小肽，等电点9-10，由33-39个氨基酸残基组成，C-末端酰胺化、水溶性好、对热稳定、分子量仅4Ku左右，因此无抗原性；生物学活性表明杀菌肽可杀菌、杀肿瘤细胞，还有抗病毒作用，其作用机制是杀菌肽分子直接插入细胞膜，造成孔洞而使上述细胞崩解而死亡。因此对抗生素耐药菌株仍有杀伤作用，若杀菌肽应用于临床，对于那些由耐药菌感染的疾病病人无疑是个福音。近年来感染性疾病又重新肆虐全球，发病率逐年上升，这一方面是由于新的病毒或致病菌的出现，另一个重要方面是很多致病菌对现有抗生素产生抗性而耐药。据统计，每年全世界各种传染病死亡人数高达1700万，占总死亡人数1／3，人们渴望着新的杀菌药问世!另外值得重视的是杀菌肽的抗肿瘤活性，研究者发现杀菌肽对肿瘤细胞有很强的杀伤作用，但对正常真核细胞却无影响，推测可能由于正常细胞含有胆固醇及丰富骨架结构有关。
据世界卫生组织统计，全世界恶性肿瘤患者1400万，每年死亡500万。我国每年约100万新增的恶性肿瘤患者，死亡120万。鉴于杀菌肽对于这两类严重威胁人类生命的疾病均有潜在的治疗价值，研究者们梦寐以求能获得大量高纯度的杀菌肽来进行临床试验，但这一问题始终未能解决。昆虫体液中虽然可提取杀菌肽，但提取步骤繁杂，在含量极低的昆虫中很难获得大量杀菌肽；随着分子生物学技术的广泛应用，不少实验室试图以基因工程手段来获取大量杀菌肽，也未获理想结果。由于杀菌肽本身具有杀菌作用，无法直接在大肠杆菌中表达杀菌肽，只能用酵母体系及昆虫或昆虫细胞体系进行基因表达，例如1991年Hellers将天蚕素B基因在天蚕蛹及昆虫细胞中表达；1992年Reichhart将绿蝇防御素A基因在酵母中表达，每升中仅含1mg表达产物。在国内，1987年徐飞等将柞蚕杀菌肽D基因在酵母中表达；1994年叶玉坤等也用酵母表达了此基因，表达水平为1．14mg／升。到目前为止，未见其他研究单位有大肠杆菌中高效表达杀菌肽的报道。
从工业化生产的角度考虑，在基因工程表达体系中，大肠杆菌最为理想。因为它具有成本低、周期短、表达水平高、易于操作等优点，但这一体系缺乏对表达产物修饰功能，例如糖基化、酰胺化等功能。对于杀菌肽来说若采用大肠杆菌进行表达，要解决三个难题第一，如何避免表达产物杀宿主菌，我们采用了融合表达方式，即在杀菌肽前加进其他蛋白，使表达产物为融合蛋白，此种表达产物无杀菌活性。在设计目的基因时除了采用大肠杆菌偏爱的密码子外，在目的基因上游融合了其他蛋白基因，同时引进了溴化氰或钯配合物专一切割序列；第二，如何使大肠杆菌表达的杀菌肽C-端为酰胺。由于有活力的杀菌肽C-端为酰胺，而大肠杆菌又无酰胺化能力因此在构建杀菌肽-X基因时在C-端外加了一个门冬酰胺；第三，如何正确切割表达的融合蛋白，放出有活力的杀菌肽-X，首先我们采用的是溴化氰切割，获得了预期结果，显然这种传统切割方法是应用了有毒的溴化氰，因此很难用于大量生产，而采用钯配合物切割则完全避免了传统方法的缺点，不仅它无毒不污染环境，还有切割效果好成本低等特点。由于我们集中了高效表达，有效切割的优势，使杀菌肽-X的工业化生产成为可能。
本发明的目的在于创造一种抗恶性肿瘤，无抗原性的新型药物，另外还可用于治疗耐药致病菌感染的疾病。
本发明方案包括1．基因构建2．在大肠杆菌中高效融合表达3．对表达产物的正确有效切割4．杀菌肽-X的分离纯化杀菌肽-X基因的构建我们设计的杀菌肽-X基因是参照了屈贤铭、戴祝英、张双全等从中国家蚕蛹中提取的杀菌肽CMIV的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱的密码子，并在C-端加进门冬酰胺密码子而成为杀菌肽-X全部编码序列，在编码序列上下游分别引入内切酶识别位点(上游为EcoR I和Nde I，下游有Spe I和BamH I)，为了拼接的方便，将整个基因分为交错相搭的6个寡聚核苷酸片段。将互补片段分别混合，加热80℃再冷却，使复性，再通过连接反应，成为完整的合成基因，将完整基因以EcoR I和BamH I位点克隆至pUC9中，转化至大肠杆菌JM109，通过筛选挑出阳性菌落，从阳性菌落中挑取DNA，测定序列，证明与预期结果一致，具体序列如下5′AATTCG CAT ATG AGA TGG AAA ATC TTC AAG AAA ATC GAAGTT GGT CAG AAC ATT CGT GAC GGC ATT GTG AAA GCG GGT CCGCGT GTT GCA GTA GTA GGT CAA GCT GCT ACC ATC AAC TAG TG3′和改良型肿瘤坏死因子(TNF-b)基因的融合表达，操作步骤如下1．用PCR法去除TNF-b中的终止密码子，再和上述杀菌肽-X基因连接，成为融合蛋白基因，以Nco I和BamH I插入表达载体pET-11d中，转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中，经IPTG诱导8小时，用SDS-PAGE电泳检测，扫描，计算表达蛋白的含量约50％。收集菌体破碎，离心，收集融合蛋白，用溴化氰裂解，100mg融合蛋白加50mg溴化氰，在室温下作用24小时，以20倍水稀释以终止反应。
2．和TNF-b基因融合，并引入钯配合物切割单元半胱氨酸-组氨酸-编码序列，表达的融合蛋白，以钯配合物切割。
这种融合蛋白的基因和步骤1中大体相同，但以PCR法加入钯配合物切割单元的序列-TGC-CAC-表达体系与(1)相同，表达量为50％。
上述两种表达的融合蛋白，经溴化氰或钯配合物切割均可获得有活性的杀菌肽-X，经CMII阳离子层析，可获得纯品SDS-PAGE电泳，银染一条带。
和谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因融合表达，步骤如下1．用含GST的表达载体pGEX-KG和杀菌肽-X基因连接，转化至BL-21(DE3)中，经IPTG诱导5小时，可测出融合表达的蛋白，经SDS-PAGE电泳后扫描，表达量为30％，经溴化氰裂解，可得到有活力的杀菌肽-X。
2．以PCR法引入钯配合物切割序列(TGC-CAC)。
PCR引物15′-GGG GGA TCC TGC CAC AGA TGG AAA ATC TTCAAG AAA-3′
PCR引物25′-CCC CCA AGC TTC TAG TTG ATG GTA GCA GC-3′以克隆在pUC中的杀菌肽-X为模板，PCR产物含TGC-CAC。
将PCR产物以BamH I和HindIII双酶切，并和pEX-KG连接，宿主菌的诱导条件同(1)，最后将表达产物用钯配合物切割，切割后可测出杀菌活性。
上述两种切割方式的产物均可用CMII层析纯化至SDS-PAGE银染一条带。
结果表明，每立升发酵液至少可得杀菌肽-X 10mg，并证明具有很强的杀菌能力，这一成果在杀菌肽研究史上是一个重大突破，使工业化生产杀菌肽供临床应用将成为现实，杀菌肽将可能成为“21世纪的抗生素”。
我们已将纯的重组杀菌肽-X进行了体外抗肿瘤试验，证明对三种肿瘤细胞(白血病细胞株K562、U937、HL-60)有明显杀伤作用，经扫描电镜观察，用微克水平(5μmol／L)的杀菌肽-X处理肿瘤细胞48-60小时后，细胞严重崩解，使完整圆形的肿瘤细胞变为煤炭渣状，而对正常细胞无影响，我们分离了正常人的白细胞加相同浓度的杀菌肽，经48-60小时培养，白细胞不但不死亡，并且有轻微刺激生长作用。
另外，我们进行了杀菌试验，将几株耐药菌，例如痢疾杆菌、变形杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌都有良好杀伤作用。
我们的实验结果与国外以提取法制备的杀菌肽的结果一致。1988年美国路易斯安娜大学的Jaynes发现杀菌肽对癌细胞有破坏作用；1983年Hultmark用了三种天蚕杀菌肽(A、B、D)对十一种细菌都有很强的杀伤性。国人戴祝英等用家蚕杀菌肽可杀伤K562、U937等白血病细胞；郭玉梅等观察到杀菌肽对宫颈癌实体瘤有抑制作用。
本发明优点是创造了一种适宜于工业化生产杀菌肽的工艺，根本解决了杀菌肽来源困难的矛盾。
采用大肠杆菌表达体系，既经济又简便，且表达水平高。尤其是我们将高效表达体系和新型的切割剂-钯配合物结合起来，优化了条件，使成为成本低，无污染等特点的工艺。最后可获得大量高纯度有活力的重组杀菌肽-X，它成为治疗恶性肿瘤新型药物并治疗由耐药致病菌感染的传染病。
下面是
具体实施例方式1．杀菌肽X基因的构建，具体步骤如下首先按照天然家蚕CMIV氨基酸序列，在C-端外加一个门冬酰胺，在编码序列上下游分别引入内切酶识别位点(上游为EcoR I和Nde I，下游有Spe I和BamH I)，最大限度地采用大肠杆菌偏爱的密码子，为了拼接的方便，将整个基因分为交错相搭的6个寡聚核苷酸片段。将互补片段分别混合，加热80℃再冷却，使复性，再通过连接反应，成为完整的合成基因。
具体的6个寡聚核苷酸片段序列如下EcoR1 Nde11 35′AATTCGCATATGAGATGGAAAATCTTCAAGAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGAACATTCGTGACGG3′-GCGTATACTCTACCTTTTAGAAGTTCTTTTAGCTTTTTCAACCAGTCTTGTAAGCACTGCC2 5CATTGTGAAAGCGGGTCCG GCTGTTGCAGTAGTAGGTCAAGCTGCTACCATCAACAGTG-3′GTAACACTTTCGCCCAGGCCGACAACGT CATCATCCAGTTCGACGATGGTAGTGATCACCTAG-5′4 6 Spe1 BamH1将完整基因以EcoR I和BamH I位点克隆至pUC9中，转化至大肠杆菌JM109，通过筛选挑出阳性菌落，从阳性菌落中挑取DNA，测定序列，证明与预期结果一致，具体序列如下5′-AATTCGCAT ATG AGA TGG AAA ATC TTC AAG AAA ATCGAA GTT GGT CAG AAC ATT CGT GAC GGC ATT GTG AAAGCG GGT CCG CGT GTT GCA GTA GTA GGT CAA GCT GCTACC ATC AAC TAG TG-3′由上述序列可见杀菌肽-X的编码序列的第一密码子为ATG，表达后为甲硫氨酸，此处为CNBr的切割位点。2．和TNF-b基因融合表达，以CNBr切割融合蛋白首先要以PCR法将TNF-b基因中的终止密码子消除，并在5′-端和3′-端分别引入Nco I位点(以便和表达载体连接)和EcoR I位点(和杀菌肽-X基因连接)。
5′-端引物5′-GCTTCCATGGTTCGTAAACG-3′3′-端引物5′-GCGAATTCAGAGCGATAATACCG-3′经过30个循环后，收集扩增产物，再以Nco I和EcoR I双酶切。
再将杀菌肽-X基因以EcoR I和BamH I切割，将这两种基因连接并克隆至pET11-d中，构成重组的表达载体。
进一步将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经筛选，获阳性菌落，用含氨苄青霉素的LB培养液37℃培养，加0．4 mM IPTG诱导8小时，收集细胞。用SDS-PAGE电泳检测，表达的融合蛋白占总菌体蛋白50％。
用超声破菌，离心收集沉淀，100mg蛋白溶于8ml 70％甲酸中加50mg CNBr，在室温下作用24小时，加20倍水稀释以终止反应。由于两种基因间含有ATG，因此在融合蛋白中出现甲硫氨酸，用CNBr切割后，位于甲硫氨酸后的肽键断裂，放出完整的杀菌肽-X分子。3．和谷胱甘肽硫转移酶(GST)基因融合表达，以钯配合物切割表达产物表达载体pGEX-KG中含有GST基因，可以和杀菌肽-X基因连接，并引入钯配合物切割单元(半胱氨酸一组氨酸密码子TGC-CAC)。
为了达到上述目的，以克隆在pUC9中的杀菌肽-X基因为模板，进行PCR，使此基因的N-端含有TGC-CAC。
引物15′-GGG GGA TCC TGC CAC AGA TGG AAA ATC TTC AAGAAA-3′引物25′-CCC CCA AGC TTC TAG TTG ATG GTA GCA GC-3′经过30轮扩增，PCR产物以BamH I和HindIII双酶切，并和pGEX-KG连接，转化至BL21(DE3)中，阳性菌在LB中培养，经0．1mM IPTG诱导5小时，可见融合蛋白表达，经SDS-PAGE电泳检测，融合蛋白占菌体总蛋白30％。
收集培养后菌体，超声破碎，保留上清液，测定蛋白浓度，加入约2倍摩尔浓度的钯配合物，用HAc调节pH2左右，经过约24小时反应，即可放出杀菌肽-X分子。
钯配合物的结构为Cis[Pd(en)(H2O)2]2+，在反应体系中的钯配合物可通过与DTTC反应产生沉淀被除去。4．用离子交换层析纯化用CMII纤维素装柱，上样液为pH5．1 0．05 M NH4Ac缓冲液，将上述切割后的蛋白液上柱，用上柱液洗涤。
用以pH5．1 0．05 M-1 M NH4Ac梯度洗脱，出现两个峰，收集第二个峰，即为杀菌肽-X。经SDS-PAGE电泳银染一条带。
权利要求
1．一种称之为杀菌肽-X的基因，其特征是根据提取的中国家蚕杀菌肽CMIV的氨基酸序列(35肽)，在C末端加一个门冬酰胺(或谷氨酰胺)，成为36肽，其编码序列采用大肠杆菌偏爱密码子，用化学方法合成了全基因。
2．根据权利要求1所述的基因其特征是和改良型肿瘤坏死因子(TNF-b)或谷胱甘肽硫转移酶基因融合，分别插入pET-11d和GST-KG表达载体，转化至大肠杆菌中，可获得表达融合蛋白的菌称为工程菌。3．根据权利要求2所述的工程菌，其特征是工程菌用超声破碎，经溴化氰或用钯配合物裂解融合蛋白可放出有活力的杀菌肽-X，以离子交换层析，可获得重组杀菌肽-X纯品，SDS-PAGE电泳银染一条带。4．根据权利要求1所述的杀菌肽-X，其特征是重组杀菌肽-X，用于恶性肿瘤(包括白血病)及抗感染，特别对那些耐药致病菌感染的疾病更有价值。
全文摘要
本发明属于基因工程生产多肽药物领域,其目的在于创造一种新药,可抗肿瘤及治疗耐药菌感染疾病。本发明参照了杀菌肽CMⅣ的氨基酸序列,化学合成其基因。将合成的基因在大肠杆菌中实现两种体系融合表达,表达水平分别为50%和30%。裂解融合蛋白,经层析,最后可获得SDS－PAGE银染一条带的纯品。用重组杀菌肽－X纯品对白血病细胞株和白血病病人白细胞都有良好的杀伤作用;另外,对几种耐药细菌都有明显杀伤性。
文档编号C12P21/02GK1205361SQ9710698
公开日1999年1月20日 申请日期1997年6月3日 优先权日1997年6月3日
发明者徐贤秀, 朱龙根, 朱德煦, 董雪吟, 邱奇峰, 谢维 申请人:南京大学