结肠癌相关基因tom34的制作方法

专利名称：：结肠癌相关基因tom34的制作方法结肠癌相关基因roM34本申请要求2005年7月27日提交的美国临时申请系列No.60/703,265的权益，在此将上述申请的全部内容引用并入本文。发明领域本发明涉及4企测和诊断结肠癌的方法以及治疗和预防结肠癌的方法。发明背景结肠直肠癌是全世界癌症死亡的最常见原因之一。尽管各种结肠直肠癌的诊断和治疗取得了各种进步，但许多晚期结肠直肠癌患者的死亡率很高。为了改善他们的预后，有必要研制用于早期癌检测的敏感而特异的诊断用生物标志以及更为有效且有害性更小的治疗性药物。为了达到这个目的，有必要更清楚地了解结肠直肠癌发生的分子机制。最近的分子研究披露了结肠直肠癌发生涉及遗传改变的积累，包括在肿瘤抑制基因和/或癌基因包括APC、p53、beta-联蛋白和K-ras的遗传改变(NishishoI，etal.Science253:665-669,1991;BakerSJ，etal.，Science244:217-221，1989;MorinPJ,etal"Science275:1787-1790,1997;ForresterK,etal.，Nature327:298-303,1987)。除了这些类型的改变之外，表观遗传事件，例如改变的曱基化作用(JonesPA&LairdPW，NatGenet21:163-167，1999)和印记的丟失(CuiH,etal.,NatMed4:1276-1280,1998)和/或由于遗传变化或其它未知的才几制所致的失调节的转录控制，与结肠直肠肿瘤的发生相关。在涉及癌发生的基因中，我们预想对癌细胞的增殖和/或存活必需的基因产物的抑制将导致它们的生长抑制或细胞死亡。因此，产生致癌活性并特异性地在癌细胞中表达的分子，是用于研制新抗癌药的有希望的靶标。人TOM34是从人EST和cDNA数据库中发现的，并且被预测为线粒体蛋白输入机构的组分，因为该被预测的蛋白质在一个62位残基基序的区域中与已知的线粒体受体的酵母Tom70家族具有序列同源性(NuttallSD,etal.，DNACellBiol16:1067-1074,1997)。然而，最近的研究披露，在细胞和组织分级后，TOM34主要被包括在细胞质级分中，部分被包括在线粒体和膜级分中(ChewawiwatN,etal.，JBiochem(Tokyo)125:721-727,1999)。另一项研究通过免疫组织化学染色显示了它在HeLa细胞的细胞质中的亚细胞定位(Chun-SongYandHenryY.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002;AbhijitM,etal.，ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104,2002)。酵母双杂交篩选系统已经显示TOM34在体外与含缬酪肽蛋白(valosin-containingprotein,VCP)、一种AAA(与多种细胞活性相关的ATP酶)家族成员(Chun-SongY,etal"ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002)、或90-kDa热休克蛋白(YoungJC,etal"JBiolChem273:18007-18010，1998)相互作用。然而，TOM34的生物学作用尚不清楚。已经证明，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别提呈到MHCI类分子上的来源于肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并裂解肿瘤细胞。自MAGE家族作为TAA的第一个例子被发现以来，应用免疫方法已经发现了许多其它的TAA(BoonT.，IntJCancer.1993;54(2):177-80.，BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9.，vanderBmggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV,et.al.,JExpMed.1993;178(2):489-95"KawakamiY,et,al.,JExpMed,1994;180(l):347-52),目前其中一些在临床研究过程中已被当作免疫治疗的耙标。到目前为止发现的TAA包括MAGE(vanderBruggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7)、gplOO(KawakamiY,et.al.，JExpMed.1994;180(l):347-52)、SART(ShichijoS,et.al.，JExpMed.1998;187(3):277-88)、NY-ESO-1(ChenYT,etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8)。同时已证明，肿瘤细胞以一定程度的特异性过高表达的基因产物为被识别为细胞免疫应答的靶标。这些包括p53(UmanoY，et.al.,BrJCancer.2001;84(8):1052-7)、HER2/歸(TanakaH，et.al"BrJCancer.2001;84(l):94-9)、CEA(NukayaI，et.al"IntJCancer.1999;80(l):92-7)以及其它产物。尽管这些是在基础和临床研究中已经取得显著进展的例子(RosenbergSA，et.al.,NatMed.1998;4(3):321-7.，MukherjiB,et.al.，ProcNatlAcadSciUSA.1995;92(17):8078-82"HuX，et.al"CancerRes.1996;56(11):2479-83)，一般用于腺癌包括结肠癌治疗的候选TAA数量非常有限。如果有仅仅在癌细胞中但不在正常细胞中大量表达的TAA,它们将是有希望的候选免疫治疗靶标。发明概述为了验证在结肠直肠癌发生中的分子作用并为结肠直肠癌(CRC)患者寻找新的治疗靶标，我们应用由23040个基因构成的cDNA微阵列进行了表达模式分析(LinYM，etal.,Oncogene21:4120-4128，2002)。在结肠直肠肿瘤中显示上调表达的基因中，我们着眼于TOM34(34kDa的线粒体外膜移位酶)，因为它的表达水平在受检的20个CRC样品中在其中16个中频繁提高。多组织Northern印迹分析显示该基因大量表达于睾丸和卵巢中，弱表达于前列腺、脾脏和结肠中，但在受检的其它11个正常成人组织中均不表达。TOM34的免疫组织化学染色显示，在CRC组织中与它们相应的非癌粘膜有显著的蓄积。在本发明中，证实了人TOM34在CRC中频繁上调，它在睾丸和卵巢中表达，但在被;险的其它15种正常成人组织中不表达。既然通过siRNA抑制该TOM34明显降低了结肠癌细胞的生长，该基因产物可能是一种潜在的人肿瘤的治疗靶标，也是一种有用的诊断标志。而且，考虑TOM34可能作为一种能诱发显著的抗结肠癌细胞免疫反应的TAA(肺瘤相关抗原)。为了^r证这个^(叚设，我们用来源于TOM34的肽刺激了从健康志愿者收集的PBMC，并成功获得了肽特异性CTL克隆，这些克隆也可以识别和杀伤表达该抗原的肿瘤细胞。具体地，以rOMM特异性小干扰RNA(siRNA)转染结肠癌HCT116和RKO细胞有效地抑制了它的表达，并显著地抑制了细胞生长。而且，对于具有来源于TOM34的序列的肽，我们考察了它们作为抗原表位肽的潜力，并探索了一种可以诱导显著的抗结肠癌细胞免疫应答，用于癌症免疫治疗的新表位肽。用具有TOM34部分序列的肽刺激了健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。选择了那些被推测与HLA-A*2402结合的肽。我们成功地鉴定了一种其序列来源于TOM34的特异性抗原肽，其可诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系，所述CTL细胞系针对以HLA-A24限制性的方式提呈该抗原的细胞显示特异性细胞毒性。从这些CTL细胞系中建立了CTL克隆。进一步的CTL克隆分析显示它们不但对负载肽的靶细胞，而且对内源性表达TOM34的细胞具有强的细胞毒活性。而且，非放射性靶抑制测定(coldtargetinhibitionassay)表明这些CTL克隆特异性识别了MHCI类分子复合物中的所述抗原肽。这些结果强烈地提示该肽为一种HLA-A24限制性的表位肽，其可诱导针对表达TOM34的结肠癌细胞的强力而特异的免疫应答。这些发现提示TOM34与癌细胞生长有关，并可能促进新的抗癌药和/或CRC诊断的开发。本发明是基于TOM34的基因表达图式的发现。TOM34的核苷酸序列和氨基酸序列分别列出在SEQIDNO:60和61中。这些序列也可从Genbank登录AB085681获得。相应地，本发明提供了一种通过确定来源于患者的生物样品，例如组织样品中的TOM34表达水平，来诊断或确定受试者对结肠癌的倾向性(predisposition)的方法。正常细胞是获自结肠组织。基因表达水平与正常对照基因表达水平相比的变化，例如增加，表明该受试者患有或有风险发生结肠癌。应用于本发明背景下的术语对结肠癌的"倾向性"涵盖受试者易感于结肠癌，具有结肠癌趋势、发病性、倾向或敏感性的状态。而且，该术语也涵盖受试者有获得结肠癌的风险。在本发明的背景下，词组"对照水平"指的是在对照样品中检测到的蛋白质表达水平。对照水平可以是来源于单一参照群体的单一表达图式，或是来源于多个表达图式的单一表达图式。例如，对照水平可以是来自于在先测试细胞的表达图式的数据库。"正常对照水平，，指的是在正常健康个体或已知未患有结肠癌个体的群体中所检测的基因表达水平。正常个体是没有结肠癌临床症状的个体。与正常对照水平相比，在测试样品中纟企测到TOM34表达水平的增加表明受试者(从其获得样品者)患有CRC或者有发生CRC的风险。才艮据本发明，若基因表达与对照水平相比增加了10%、25%、50%,则认为基因表达水平是"改变的，，。或者，若基因表达与对照水平相比增加了至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多倍，则基因表达水平被认定为"增加的，，。通过;f企测杂交，例如TOM34探针对来源于患者的组织样品的基因转录物的杂交而确定表达。在本发明的背景下，来源于患者的组织样品是来自测试受试者的任何组织，例如已知患有或怀疑有结肠癌的患者。例如，该组织可能含有上皮细胞。更特别地，该组织可能是来自结肠直肠癌的上皮细胞。本发明进一步提供了通过将表达TOM34的测试细胞与测试化合物接触，并确定TOM34的表达水平或其基因产物的活性，来鉴定抑制TOM34表达或活性的物质的方法。该测试细胞可以是上皮细胞，例如获自结肠直肠癌的上皮细胞。与基因或基因产物的对照水平或活性相比，TOM34表达水平或其基因产物的活性下降，表明该测试化合物为TOM34抑制剂并可用于减轻结肠癌症状。本发明也提供了包含与TOM34核酸或多肽结合的检测试剂的试剂盒。本发明的治疗方法包括治疗或预防受试者中结肠癌的方法，包括给受试者施用TOM34拮抗剂或抑制剂例如反义组合物或抗体组合物的步骤。该拮抗剂或抑制剂可作用于核酸或蛋白质水平从而降低或抑制TOM34表达或活性。在本发明的背景下，反义组合物降低特异性靶基因的表达。例如，反义组合物可含有与TOM34序列互补的核苷酸。或者，本方法可包括给受试者施用小干扰RNA(siRNA)组合物的步骤。在本发明的背景下，siRNA组合物降低TOM34的表达。在另外一种方法中，受试者中结肠癌的治疗或预防可以通过给受试者施用核酶组合物而实施。在本发明的背景下，核酸特异性核酶组合物降〗氐TOM34的表达。实际上，siRNA对TOM34的抑制效应得到了证实。例如，在样品切片中已经清楚地显示出TOM34的siRNA抑制结肠癌细胞的细胞增殖。因此，在本发明中，TOM34是优选的结肠癌治疗l巴标。本发明也包括疫苗和接种方法。例如，治疗或预防受试者中的结肠癌的方法可包含对受试者施用含有TOM34核酸编码的多肽或该多肽的免疫活性片段的疫苗。在本发明的背景下，免疫活性片段是长度短于全长天然存在的蛋白，但诱导与全长蛋白诱导的免疫应答类似的免疫应答的多肽。例如，免疫活性片段应该是长度至少为8个残基，并且能够刺激免疫细胞例如T细胞或B细胞。可通过检测细胞增殖、细胞因子(例如IL-2)的生成(elaboration)或抗体的产生而测量免疫细胞刺激。除非另有定义，本发明中所有的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本发明的实施和检验，下文中对合适的方法和材料进行了描述。本申请引证本文中提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考数据的全部内容。本文中的任何内容均不应被解释一旦出现矛盾，将以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不意图起限制作用。本文描述的方法的一个优点是在检测到明显的结肠癌临床症状之前鉴定疾病。根据以下详细的说明和权利要求，本发明的其它特征和优点将是自明的。附图简述图1描述rOM54基因在各种组织中的表达水平。(A)结肠癌组织和它们相应的非癌粘膜中的rOM34的半定量RT-PCR分析。T，肿瘤组织；N,正常组织。的表达作为内部对照。(B)TOM34的多组织northern印迹分析。r07lf34的转录物的大小大约为2.0-kb。图2描述TOM3V基因编码的蛋白质在各种组织中的表达水平。(A)结肠癌组织和它们相应的非癌粘膜中TOM34的Western印迹分析。T,肿瘤组织；N,正常组织。(B)TOM34在结肠癌细胞系中的表达。beta-肌动蛋白的表达用作内部对照。图3描述在结肠癌组织中的TOM34的免疫组织化学染色结果。(A和B)癌性和非癌性细胞中的代表性染色图像。放大倍数X40,(C和D)正常粘膜和癌性组织的图像(C正常，D;肺瘤)。放大倍数X200。图4描述TOM34siRNA对TOM34基因表达或CRC细胞系的细胞生长的抑制效应。(A)siRNA对HCT116细胞中表达的影响。通过western印迹分析分析了TOM34的表达。(3-肌动蛋白的表达用作内部对照。制备了EGFP特异性siRNA(s正GFP)为阴性对照。(B)TOMM-siRNA对HCT116细胞生长的影响。通过一式三份的MTT测定法测量了响应于EGFP-siRNA或TOM34-siRNA的HCT116细胞生长能力。误差条形，SD;星号表示通过ScheffF检验(ScheffsFtest)确定的显著性差异(PO.OOOl)。图5描述10聚体肽TOM34-299诱导的CTL系的细胞毒性效应。10聚体肽TOM34-299激发产生的CTL系显示出肽特异性细胞毒性。CTL系显示了对负载有TOM34-299的靶细胞(TISI)的高细胞毒活性，而它们对没有负载肽的同样的靶细胞(TISI)未显示显著的细胞毒活性。这证明CTL系具有肽特异性细胞毒性。图6描述TOM34-299激发的CTL系肽特异性强细胞毒性。CTL系在低达1.2的E/T比(E/Tratio)显示出可;f全测的抗原特异性强细胞毒性。图7描述CTL克隆的强细胞毒性。可以建立具有极强的TOM34-299特异性细胞毒性的CTL克隆。从抗TOM34-299的CTL系建立的CTL克隆显示了不同的杀伤活性，其中一些具有极强的活性。图8描述TOM34-299激发产生的CTL克隆的HLA特异性。被TOM34-299激发产生的CTL克隆识别并以HLA限制性的方式裂解内源性表达TOM34的肺瘤细胞。使用由TOM34-299激发产生的CTL克隆作为效应细胞，测试了针对内源性表达TOM34的DLD-1和HT29结肠癌细胞系的细胞毒活性。用内源性表达TOM34但不表达HLA-A24的SNU-C2A细胞作为靶标。CTL克隆对既表达TOM34也表达HLA-A24的DLD-1和HT29细胞均显示了高的细胞毒活性。另一方面，它们对表达TOM34但不表达HLA-A24的SNU-C2A细胞没有显示出显著的细胞毒活性。.图9描述TOM34-299激发产生的CTL克隆的HLA特异性。TOM34-299激发产生的CTL克隆以HLA-A24限制性的方式特异性地识别TOM34。如"材料与方法"描述的那样进行非放射性靶抑制测定。制备了被Na^Cr04标记的HT29细胞作为放射性耙，而用具有或没有TOM34-299肽负载的无"Cr标记TISI细胞作为非放射性靶。E/T比固定于20。仅当负载肽时，添加TISI细胞才抑制CTL克隆对HT29细胞的细胞毒活性。图10描述TOM34-299激发产生的CTL克隆的细胞毒活性的特异性。TOM34-299激发产生的CTL克隆的细胞毒活性，被识别T细胞表面抗原I类HLA或CD8的抗体特异性地阻断。在识别T细胞表面抗原的抗体存在下，确定了CTL克隆对HT29细胞的细胞毒活性。加入识别I类HLA或CD8的抗体明显地阻断了CTL活性，且加入II类HLA或CD4的抗体轻微地影响了该活性，而它根本不被同种型匹商己只于照抗体(isotype國matchedcontrolantibody)的力口入戶斤才中制。发明详述除非有其它特别说明，文中所用的词语"一个(种)"("a","an")和"所述"("the")意味着至少一个(种)。除非上下文另有要求，该说明书的通篇和之后的权利要求中，词语"包括"、"包含"、"含有"("comprise")及其变型例如"comprises"和"comprising"，当理解为意口木着包含所述的整体(integer)或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。本发明是部分基于下述发现，即在来自CRC患者结肠组织的细胞中TOM34的表达提高。应用综合cDNA孩i阵列系统(comprehensivecDNAmicroarraysystem)鉴定了才是高的基因表达。先前应用含有23,040个基因的cDNA微阵列构建了20位患者的综合基因表达模式。TOM34在CRC患者中高水平表达。本文鉴定的TOM34作为CRC标记用于诊断目的，或者作为基因靶标，对其表达进行改变以治疗或减轻CRC症状。通过测量TOM34在细胞样品中的表达而诊断CRC。类似地，通过测量响应于各种物质的TOM34的表达，可以鉴定治疗CRC的物质。本发明涉及确定(例如测量)TOM34的表达。利用GeneBankTM数据库条目提供的TOM34序列信息，应用本领域普通技术人员熟知的技术检测和测量了TOM34。例如，使用相应于TOM34的序列数据库条目内的序列来构建探针，用于在例如Northern印迹杂交分析中检测TOM34RNA序列。另举一例，该序列可用于构建引物，用于在例如基于扩增的检测方法(例如基于逆转录的多聚酶链式反应)中特异性地扩增TOM34。然后将测试细胞群体如来源于患者的组织样品中的TOM34表达水平与参照群中的TOM34表达水平进行比较。参照细胞群体包括一种或多种被比较参数已知的细胞，即CRC细胞或非CRC细胞。与参照细胞群体比较，测试细胞群体中的基因表达图式是否指示CRC或其倾向性，取决于参照细胞群体的组成。例如，如果参照细胞群体由非CRC细胞组成，在测试细胞群体和参照细胞群体中基因表达模式相似则表明测试细胞群体为非CRC。相反地，如果参照细胞群体由CRC细胞组成，在测试细胞群体和参照细胞群体之间的基因表达模式相似则表明测试细胞群体包括CRC细胞。如果测试细胞群体中的TOM34的表达水平不同于参照细胞群体，相比于参照细胞群体中相应的TOM34变化了1.0倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍或更多的倍数，则认为其表达水平发生了改变。可以将测试细胞群体和参照细胞群体之间差异的基因表达相对于对照核酸，例如持家基因进行标准化。例如，对照核酸是已知不依赖于细胞癌性或非癌性状态而差异的核酸。可以使用对照核酸的表达水平来标准化测试细胞群体和参照细胞群体中的信号水平。对照基因的例子包括，但不限于，例如肌动蛋白、甘油醛3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl。将测试细胞群体与多个参照细胞群体比较。所述已知参数在多个参照细胞群体的每一个中可以不同。因此，可以将测试细胞群体与已知含有例如CRC细胞的第二参照细胞群体相比较，以及与已知含有例如非CRC细胞(正常细胞)的第二参照细胞群体相比较。测试细胞群体可以包含在来自已知含有或怀疑含有CRC细胞的受试者的组织类型或细胞样品中。测试细胞群体从身体组织或体液，例如生物流体(例如，血液，痰，唾液)中获得。例如，测试细胞是从组织纯化的。优选地，测试细胞群体包括上皮细胞。上皮细胞优选来自已知是或怀疑是CRC的组织。参照细胞群体中的细胞来源于与测试细胞相似的组织类型。可选地，参照细胞群体是细胞系，例如CRC细胞系(阳性对照)或正常非CRC细胞系(阴性对照)。或者，对照细胞群体来源于分子信息数据库，所述数据库来源于被测定参数或条件已知的细胞。受试者优选哺乳动物。哺乳动物可以是例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。本文公开的TOM34的表达使用本领域已知的方法在蛋白或者核酸水平上加以确定。例如，可以使用特异性识别该序列的探针进行Northern杂交分析来确定基因表达。或者，使用基于逆转录的PCR测定法来测量基因表达，例如，使用对于TOM34特异性的引物。也在蛋白水平上确定表达，即通过测量本文所述基因产物所编码多肽的水平或其生物学活性。此类方法是本领域公知的，包括但不限于，例如，使用基于针对7UM^编码蛋白的抗体的免疫测定。该基因编码的蛋白质的生物活性也是已知的。诊断CRC:在本发明的背景下，通过测量来自测试细胞群体(即来源于患者的生物样品)的TOM34表达水平而诊断CRC。优选地，测试细胞群体含有上皮细胞，例如，获自结肠组织的细胞。也可从血或其它体液如尿测量基因表达。其它生物样品可用于测量蛋白质水平。例如，可通过免疫测定或其它常规的生物测定来测量来源于待诊断受试者的血液或血清中的蛋白质水平。确定测试细胞或生物样品中TOM34的表达，并与纟皮测TOM34的相关正常对照表达水平进行比较。正常对照水平是典型地在已知未患CRC群体中发现的TOM34表达模式。来源于患者的组织中TOM34表达水平的变化(例如增加)表明该受试者患有CRC或具有发生CRC的风险。例如，与于正常对照水平相比，测试群体中TOM34的表达的增加表明该受试者患有CRC或具有发生CRC的风险。与于正常对照水平相比，测试群体中TOM34的变化表明该受试者患有CRC或具有发生CRC的风险。可通过定量TOM34的相应mRNA或TOM34的编码蛋白质来估计生物样品中TOM34的表达水平。mRNA的定量方法是本领域熟知的。例如，可通过Northern印迹法或RT-PCR估计TOM34mRNA的水平。由于TOM34的核苷酸序列是已知的，任何本领域技术人员均可设计探针或引物的核苷酸序列以定量TOM34。例如，包含SEQIDNO:43和44所示核苷酸序列的TOM34特异性引物组是优选的引物。也可以基于TOM34蛋白的量或活性分析TOM34的表达水平。以下显示了一种确定TOM34蛋白量的方法。例如，免疫测定方法对确定生物材料中的蛋白质是有用的。只要TOM34基因在结肠癌患者的样品中表达，任何生物材料均可用作确定该蛋白质或其活性的生物样品。例如，结肠组织可认为是这样的生物样品。然而，也可以分析体液例如血液和尿。另一方面，适于确定TOM34基因编码蛋白质活性的方法，也可以根据待分析的蛋白质的活性加以选择。估计生物样品中的TOM34基因的表达水平并与正常样品(例如来源于非患病受试者的样品)中的表达水平进行比较。当这样的比较显示该基因的表达水平高于正常样品的表达水平时，判断该受试者为结肠癌受累。可以同时确定来自正常受试者和待诊断受试者的生物样品中TOM34基因的表达水平。或者，可以通过统计方法确定表达水平的正常范围，该方法基于对预先从对照组采集的样品中的基因表达水平的分析结果。将通过比较受试者样品获得的结果与正常范围相比；若该结果未落入该正常范围，则判断该受试者受累于结肠癌或具有发生结肠癌的风险。在本发明中还提供了用于诊断结肠癌的诊断试剂。本发明的诊断试剂包含与TOM34基因的多核香酸或多肽结合的化合物。优选地，与TOM34基因的多核苷酸杂交的寡核苷酸或与TOM34基因编码的多肽结合的抗体可用作这样的化合物。而且，适体，例如RNA、DNA或肽适体也可以用作这样的化合物。优选地，该诊断剂包含可检测标记，例如本领域公知的萸光、发光或生物发光标记。本文诊断结肠癌的方法可以用于评定受试者中结肠癌治疗的效力。根据本方法，从正在经历结肠癌治疗的受试者获取生物样品例如测试细胞群体。该评定方法可根据诊断结肠癌的常规方法进行。如果需要，在治疗前、治疗中或治疗后不同时间点从受试者获取生物样品。然后，确定该生物样品中TOM34基因的表达水平，并与对照水平进行比较，其中对照水平来源于，例如，包括结肠癌状态(即癌性细胞或非癌性细胞)已知的细胞的参照细胞群体。对照水平在未曾经受该治疗的生物样品中确定。如果对照水平是来源于不含癌性细胞的生物样品，则来源于受试者的生物样品中的表达水平与对照水平之间的相似性表明治疗是有效的。来源于受试者的生物样品中的TOM34基因的表达水平与对照水平之间的差异则表明不太令人满意的临床结果或预后。抑制TOM34表达的作用物质的鉴定通过将表达TOM34的测试细胞群体与测试物质接触并确定TOM34的表达水平或其基因产物的活性，可以鉴定抑制TOM34表达或其基因产物活性的物质。相比于该测试物质不存在时的表达或活性水平，该物质存在时制剂并有用于抑制CRC。该测试细胞群体可以是任何表达TOM34的细胞。例如，该测试细胞群体可含有上皮细胞如来源于结肠组织的细胞。而且，测试细胞可以是来源于癌(carcinoma)细胞或结肠直肠癌的永生化细胞系。或者，测试细胞可以是转染了TOM34的细胞，或者转染了可操作地连接于报道基因的来自TOM34的调节序列(例如启动子序列)的细胞。受试者中CRC治疗的效力评估本文鉴定的差异表达TOM34还使得监测CRC的治疗过程成为可能。在该方法中，从接受CRC治疗的受试者提供测试细胞群体。如果希望的话，在治疗前、治疗中和治疗后的不同时间点从受试者获得测试细胞群体。然后确定细胞群体中TOM34的表达并与包括已知TOM34状态的细胞的参照细胞群体相比较。在本发明的背景下，所述参照细胞应尚未暴露于感兴趣的治疗。如果参照细胞群体不含CRC细胞，则测试细胞群体中和参照细胞群体中TOM34表达相似表明该目标治疗是有效的。然而，测试群体中与正常对照参照细胞群体中TOM34表达差异则表明不太令人满意的临床结果或预后。类似地，如果参照细胞群体含有CRC细胞，则测试细胞群体中和参照细胞群体中TOM34表达差异表明该目标治疗是有效的，而在测试群体与癌症对照参照细胞群体中TOM34表达相似则表明不太令人满意的临床结果或预后。另外，可以将治疗后从受试者获得的生物学样品中确定的TOM34表达水平(即治疗后水平)与治疗前从受试者获得的生物学样品中确定的TOM3表达水平(即治疗前水平)相比较。治疗后样品中TOM34表达水平的减少表明感兴趣的治疗是有效的，而治疗后样品中表达水平的增加或维持则指示较为不利的临床结果或预后。本文中所用的术语"有效的，，表明该治疗导致病理性上调基因表达下降，或导致受试者中CRC的大小、患病率(prevalence)或转移潜力的减少。当目标治疗是预防性地应用时，术语"有效的"意思是该治疗延緩或预防CRC的形成，或延緩、预防或减轻临床CRC的症状。结肠肿瘤的评定可应用标准临床规程进行。此外，可结合任何有关已知的CRC诊断或治疗方法确定有效性。CRC可通过例如鉴定异常症状，例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲减退、恶心、呕吐、全身不适、虚弱和黄痘，来加以-〖t断。特定个体CRC治疗的合适治疗剂的选择个体遗传构成(geneticmakeup)的差异可导致他们代谢各种药物的相对能力的差异。在受试者中被代谢并作为抗CRC剂起作用的物质，可通过诱导受试者细胞中的基因表达图式从癌性状态特征性基因表达图式变成非癌性状态特征性基因表达图式的方式来显示自身。因此，本文公开的TOM34使得人们有可能在来自选定受试者的测试细胞群体中测试假定的治疗性或预防性CRC抑制剂，以确定物质在受试者中是否是合适的CRC抑制剂。为了鉴定适合于特定受试者的CRC抑制剂，将来自受试者的测试细胞群体暴露于治疗剂处理，并确定TOM34的表达。在本发明的方法的背景下，测试细胞群体含有表达TOM34的CRC细胞。优选地，测试细胞为上皮细胞。例如，可以在候选物质存在下孵育测试细胞群体，可测量测试细胞群体的基因表达图式，并与一个或多个参照模式，例如CRC参照表达模式或非CRC参照表达模式比较。相对于含有CRC的参照细胞群体，测试细胞群体中TOM34的表达下降表明该物质具有治疗潜力。在本发明的背景下，测试物质可为任何化合物或组合物。示例性的测试物质包括但不限于免疫调节剂。用于鉴定治疗物质的筛选测定应用rOM34基因、该基因编码的蛋白质或该基因的转录调节区域，可以筛选改变该基因的表达或改变该基因编码多肽的生物活性的化合物。这样的化合物可以用作治疗或预防CRC的药物。因此，本发明提供了使用该n〕M34多肽筛选治疗或预防CRC的化合物的方法。该筛选方法的一个实施方案中包含下列步骤a)使测试化合物与TOM34多核苷酸编码的多肽接触；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择与该多肽结合的测试化合物.用于筛选的rOK^多肽可以是重组多肽或源于自然的蛋白质或其部分肽。要与测试化合物接触的多肽可以是，例如，纯化的多肽、可溶性蛋白、结合于载体的形式或与其它多肽融合的融合蛋白。就使用roMW多肽筛选蛋白质，例如与roM4多肽结合的蛋白质的方法而言，可使用许多本领域技术人员熟知的方法。可通过例如免疫沉淀方法，特别是如下方式进行这样的筛选。将编码roM^多肽的基因插入外源基因表达载体，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，在宿主(例如动物)细胞等中表达该基因。用于表达的启动子可以是任何可常用的启动子，包括，例如，SV40早期启动子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol,3.AcademicPress,London,83-141(1981))、EF-a启动子(KimDW,etal.,Gene91:217-23(1990))、CAG启动子(Niwaetal.,Gene108:193-9(1991))、RSVLTR启动子(Cullen,MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa启动子(Takebeetal.,MolCellBiol8:466-72(1988))、CMV立即早期启动子(SeedandAruffo,ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9(1987》、SV40晚期启动子(GheysenandFiers，JMolApplGenet1:385-94(1982))、腺病毒晚期启动子(Kaufmanetal.,MolCellBiol9:946-58(1989))和HSVTK启动子等等。可根据任何方法将基因导入宿主细胞以表达外源基因，例如，电穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-26(1987》、磷酸钓法(ChenandOkayama，MolCellBiol7:2745-52(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopataetal.,NucleicAcidsRes12:5707-17(1984);SussmanandMilman,MolCellBiol4:1641-3(1984》和脂质转染试剂(Lipofectin)法(Derijard,BCell76:1025-37(1994);Lambetal.,NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindranetal.，Science259:230-4(1993))等等。通过导入其特异性已明确的单克隆抗体的抗原表位至多肽的N或C末端，可将r<9MW基因编码的多肽表达为含有单克隆抗体识别位点(抗原表位)的融合蛋白。可使用市售的抗原表位-抗体系统(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。可利用其多克隆位点表达具有例如半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)等等的融合蛋白的载体是可商购的。还报道了这样制备的融合蛋白仅仅导入由数个至数十个个氨基酸构成的小表位以不改变多肽的特性。表位，例如多组氨酸(His-tag)、流感病毒聚集体(aggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-tag)、人单纯疱渗病毒糖蛋白(HSV-tag)、E-tag(—种单克隆噬菌体上的抗原表位)等等以及识别它们的单克隆抗体，可用作表位-抗体系统以筛选结合于rOM34多肽的蛋白质(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，通过将这些抗体加入至用合适的去污剂制备的细胞裂解产物而形成免疫复合物。免疫复合物由rOM^多肽、包括与该多肽结合能力的多肽、以及抗体。除了使用针对以上表位的抗体以外，也可以使用抗roM^多肽抗体进行免疫沉淀，这些抗体可如以上描述制备。当该抗体为小鼠IgG抗体时，可用例如蛋白Asepharose或蛋白Gsepharose沉淀免疫复合物。如果7DM^基因编码的多肽被制备为带有表位例如GST的融合蛋白，则可使用特异性结合这些表位的物质例如谷胱甘肽-sepharose4B,以与使用抗TOM34多肽抗体相同的方式形成免疫复合物。免疫沉淀可遵照或根据例如文献(HarlowandLane，Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法进行。SDS-PAGE通常用于免疫沉淀的蛋白质的分析，使用具有适合浓度的凝胶根据蛋白质的分子量分析结合的蛋白质。由于结合与rOM34多肽的蛋白质难于通过常规染色方法例如考马斯染色(Coomassiestaining)和银染色检测，可通过如下步骤提高该蛋白质的检测敏感性在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质，并检测该蛋白质。当一种蛋白质的分子量已经明确时，可直接从SDS聚丙烯酰胺凝胶纯化出该靶蛋白并确定它的序列。作为使用rOM34多肽来筛选结合该多肽的蛋白质的方法，可使用例如West-Western印迹分析(Skolniketal.,Cell65:83-90(1991))。具体地，结合rOM54多肽的蛋白质可按如下步骤获得使用噬菌体载体(例如ZAP)从期望表达结合7UM34多肽的蛋白质的细胞、组织、器官(例如，组织如睾丸或卵巢)或培养的细胞(例如CW2、DLD1、HCT116、HCT15、RKO、LS174T)制备cDNA文库，在LB琼脂糖上表达该蛋白质，将该蛋白质固定于滤膜(filter)上，使纯化、标记的r(9MW多肽与上述滤膜反应，并根据标记检测表达结合于TOM34多肽的蛋白的噬斑。本发明的多肽可利用生物素和抗生物素蛋白之间的结合，或者利用与rOM34多肽特异性结合的抗体或与7Y)M34多肽融合的肽或多肽(例如GST)而进行标记。也可采取使用放射性同位素或焚光等的方法。或者，本发明的筛选方法的另一实施方案中采用了利用细胞的双杂交系统("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem","MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);参考文献"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)，，，"FieldsandStemglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在双杂交系统中，本发明的多肽与SRF结合区域或GAL4结合区域融合并表达于酵母细胞中。从期望表达结合本发明多肽的蛋白质的细胞制备cDNA文库，使得这样的文库被表达时融合于VP16或GAL4转录激活区域。然后将该cDNA文库导入以上酵母细胞，从检测到的阳性克隆分离来源于该文库的cDNA(当结合本发明多肽的蛋白质表达于酵母细胞中时，二者的结合激活报道基因，使得阳性克隆可检测)。cDNA编码的蛋白质可通过导入以上分离的cDNA至大肠杆菌中并表达而加以制备。除了HIS3基因之外，例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和萤光素酶基因可用作报道基因。也可用亲合色i普法筛选与r(9M34基因编码多肽结合的化合物。例如，可将本发明的多肽固定于亲和柱载体上，将含有可结合本发明多肽之蛋白质的测试化合物加至该柱子上。本文中的测试化合物可以是，例如，细胞提取物、细胞裂解物等等。加载该测试化合物后，洗涤该柱子，然后可制备与本发明多肽结合的化合物。当测试化合物是蛋白质时，分析所获蛋白质的氨基酸序列，基于所述序列合成寡聚DNA，并使用该寡聚DNA作为探针筛选cDNA文库以获得编码该蛋白质的DNA。使用表面等离子共振现象的生物传感器可以用作检测或定量本发明中的结合化合物的手段。当使用这样的生物传感器(例如BIAcore，Pharmacia)时，仅仅使用微小量的多肽且不用标记，即可通过表面等离子共振信号实时观察本发明多肽与测试化合物之间的相互作用。因此，使用生物传感器例如BIAcore有可能评估本发明多肽与测试化合物之间的结合。当使固定化的rOM54多肽暴露于合成化合物或天然物质库(naturalsubstancebanks)或随机p藍菌体肽展示文库(randomphagepeptidedisplaylibrary)时，筛选结合分子的方法，以及使用基于组合化学技术的高通量来分离与TOM34蛋白结合的蛋白质乃至化合物(包括激动剂和拮抗剂)的筛选方法(Wrightonetal.，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan，Nature384:17-9(1996)),是本领域技术人员公知的。或者，本发明提供一种使用rOM34基因编码的多肽来筛选用于治疗或预防CRC的化合物的方法，包含如下步骤a)使测试化合物与TOM34的多核普酸编码的多肽接触；b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和c)选择这样的测试化合物，与不存在测试化合物时检测的所述多肽的生物活性相比，其抑制TOM34的多核香酸编码之多肽的活性。由于rOMW蛋白具有促进CRC细胞之细胞增殖的活性，使用该活性作为指标可筛选抑制该蛋白这种活性的化合物。任何多肽只要它们包含蛋白的生物活性就可用于筛选。这样的生物活性包括人roM^蛋白的细胞增殖活性。例如，可使用roM34蛋白，也可使用功能上等价于这些蛋白质的多肽。这样的多肽可由细胞内源性或外源性地表达。通过如此筛选分离的化合物，是roM3^基因编码多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语"激动剂"指的是通过与多肽结合而活化其功能的分子。同样地，术语"拮抗剂"指的是通过与多肽结合而抑制其功能的分子。而且，通过如此筛选分离的化合物，是抑制多肽与分子(包括DNA和蛋白质)体内相互作用的化合物的候选物。当本方法中待检测的生物活性为细胞增殖时，其可以，例如，通过制备表达roM3^多肽的细胞，在测试化合物存在下培养该细胞，并确定细胞增殖的速度，测量细胞周期等等加以斥企测，以及如实施例所描述的那样通过测量集落形成活性来加以检测。在一个进一步的实施方案中，本发明提供筛选用于治疗或预防CRC的化合物的方法。如以上详细讨论的，通过控制roM^的表达水平，可以控制CRC的发作和进展。因此，使用以rOM34的表达水平作为指标的筛选，能够鉴定可用于治疗或预防CRC的化合物。在本发明的背景下，这样的筛选可包含例如下列步骤a)使候选化合物与表达TOM34的细胞接触；和b)选择这样的候选化合物相比于不存在候选化合物时的对照水平，其降低TOM34的表达水平。表达7Y9M^的细胞包括例如从CRC建立的细胞系；这样的细胞可用于上文本发明的筛选(例如CW2、DLD1、HCT116、RKO、LS174T)。可使用本领域技术人员熟知的方法估计表达水平。在筛选方法中，可选择降低TOM34表达水平的化合物作为用于治疗或预防CRC的候选物质。或者，本发明的篩选方法可包含如下步骤a)使候选化合物与已经导入载体的细胞接触，该载体包含TOM34的转录调节区域和在该转录调节区域控制下表达的报道基因；b)测量所述报道基因的表达或活性；和c)选择降低所述报道基因的表达或活性的候选化合物。适合的报道基因和宿主细胞是本领域熟知的。筛选所需的报道构建体(reporterconstruct)可使用标志基因的转录调节区域加以制备。若本领域技术人员已经得知标志基因的转录调节区域，则可使用先有的序列信息制备报道构建体。当标志基因的转录调节区域尚未鉴定时，可基于标志基因的核苷酸序列信息，从染色体文库分离含有该转录调节区域的核苷酸节段(nucleotidesegment)。可以用于结合蛋白质的支持物的例子包括不溶性多糖，例如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；以及合成树脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);优选使用可市售的由以上材料制成的珠子(beads)和板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。当使用珠子时，它们可填充于柱子中。可根据常规方法例如化学键合和物理吸附将蛋白质结合于支持物。或者，可借助特异性识别该蛋白质的抗体将蛋白质结合于支持物。而且，也可藉由抗生物素蛋白和生物素将蛋白质结合于支持物。只要緩冲液不抑制蛋白质之间的结合，蛋白质之间的结合在緩冲液中，例如但不限于磷酸盐緩冲液和三羟曱基氨基曱烷(Tris)緩冲液中进行。在本发明中，使用表面等离子共振现象的生物传感器可用作检测或定量结合蛋白质的手段。当使用这样的生物传感器时(例如BIAcore,Pharmacia)，仅仅使用微小量的多肽且不用标记，蛋白质之间的相互作用可作为表面等离子共振信号而得以实时观察。或者，可以标记多肽，并且可利用结合蛋白质的标记物来检测或测量该结合蛋白质。特别地，在预标记了这些蛋白质中的一个以后，在测试化合物存在下使被标记的蛋白质与另一蛋白质接触，然后，经过洗涤，根据标记物检测或测量结合蛋白质。标记物质，例如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶类(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶)、荧光物质(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明)和生物素/抗生物素蛋白，可用于在本方法中的蛋白质标记。当蛋白质标记有放射性同位素时，可通过液体闪烁进行检测或测量。或者，以酶标记的蛋白质，可以通过加入酶的底物，用吸收光度计检测底物的酶促变化例如颜色的发生，来检测或测量。进一步地，在使用荧光物质作为标记物的情形下，可以使用荧光光度计检测或测量结合蛋白质。在本筛选中使用抗体的情形下，优选用上面提及的标记物质之一标记该抗体，并基于该标记物质才企测或测量该抗体。或者，可使用抗TOM34多肽或肌动蛋白的抗体作为第一抗体，该第一抗体用标记有标记物质的第二抗体加以4企测。而且，可使用蛋白G或蛋白A柱子检测或测量在本发明筛选中结合于蛋白质的抗体。或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双杂交系统("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，"MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);参考文献"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在双杂交系统中，本发明的rOM34多肽融合至SRF结合区域或GAL4结合区域，并在酵母细胞中表达。作为报道基因，除了HIS3基因之外，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和萤光素酶基因。任何测试化合物，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵樣i生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、中，也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得测试化合物，包括(l)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要解巻积(deconvolution)的合成文库法，(4)"一珠一化合物"("one-beadone-compound")文库法，以及(5)使用亲和色谱选择的合成文库法。使用亲和色谱选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文库(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145-67)。合成分子文库方法的例子可在本领域中找到(DeWittetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erbetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermannetal.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Choetal.(1993)Science261:1303-5;Carelletal,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carelletal.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallopetal.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques13:412陽21)或珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4)、芯片上(Fodor(1993)Nature364:555-6)、细菌上(USPat.No.5,223,409)、孢子上(USPat.No,5,571,698;5,403,484，and5,223,409),质粒上(Culletal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865画9)或噬菌体上(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Devlin(1990)Science249:404-6;Cwirlaetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Fdici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10;美国专利申请2002103360)。通过本发明的筛选方法分离的化合物是抑制TOM34多肽活性、为治疗或预防例如属于细胞增殖性疾病的疾病如CRC的药物的候选物。通过本发明的筛选方法获得的化合物包括通过本发明的本筛选方法获得的化合物的部分结构通过添加、缺失和/或取代而转换的化合物。用于治疗或预防CRC的药物组合物当本发明的方法分离的化合物作为药物施用于人和其它哺乳动物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和猩猩时，该分离的化合物可直接施用或可使用已知的药物制剂方法按方制造成剂型。例如，根据需要，该药物可以作为糖包衣片、胶嚢、酏剂和微胶嚢剂而口服，或以无菌溶液注射剂或含水悬浮剂或任何其它药学可接受的液体的形式非口服施用。例如，该化合物可与药学可接受的载体或介质特别是灭菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、溶媒、防腐剂、粘合剂等混合成适于公知药物实施(drugimplementation)所需的单位剂型。这些制剂中活性成份构成可得的标称范围内的合适剂量。可以掺混到片剂和胶嚢剂中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂如明胶、玉米淀粉、西黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和海藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精；和增味剂如薄荷、a&"of/^x油和樱桃。当单位剂型是胶嚢剂时，上述成分中还可以进一步包括液体载体如油类液体。可以根据常规药物实施方法使用注射用蒸馏水等溶^某配制注射用无菌组合物。生理盐水、葡萄糖和其它含有辅料的等渗液可以用作注射用水溶液，所述的辅料包括D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠。它们可以与合适的增溶剂结合使用，增溶剂有例如醇(如乙醇)、多元醇如丙二醇和聚乙二醇；及非离子表面活性剂如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以用作油状液体，可以与苯曱酸苯曱醇酯或苯曱醇结合使用作为增溶剂，并且可以与下列物质一起配制緩冲剂，例如磷酸盐緩冲剂和乙酸钠緩沖剂；止痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯曱醇和苯酚；和/或抗氧化剂。制成的注射剂可以充入合适的安瓿中。可以使用本领域技术人员知道的方法对患者施用本发明的药物组合物，例如作为动脉内、静脉内或经皮注射，或作为鼻内、经支气管、肌肉内或口服施用。施用方法和剂量根据患者的体重和年龄和施用方法而变化，但本领域的技术人员可常规地选择合适的施用方法。此外，若所述的化合物是可被DNA编码的，则可将该DNA插入基因治疗用载体，然后将该载体施用于患者进行治疗。施用剂量和方法根据患者的体重、年龄和症状而变化，但本领域的技术人员能够合适地选择它们。例如，尽管与本发明的蛋白质结合并调节其活性的化合物的取决于症状，当口服地施用于正常成人(体重60kg)时，通常的剂量为每天约0.1至约100mg，优选每天约1.0至约50mg，更优选每天约1.0至约20mg。当通过非消化道途径以注射剂形式施用化合物于正常成人(体重60kg)时，尽管根据患者、靶器官、症状和施用方法而有一些不同，但方便的是静脉内注射每天约0.01至约30mg，优选每天约0.1至约20mg,更优选每天约0.1至约10mg的剂量。在其它动物的情形下，可通过换算为60kg体重常规地求出适合的剂量。患有CRC的受试者的预后评定本发明还提供评估患有CRC的受试者之预后的方法，包括将测试细胞群体中TOM34的表达与参照细胞群体中TOM34的表达相比较的步骤，其中参照细胞群体来源于处于一系列疾病阶段的患者。通过比较TOM34在测试细胞群体中和参照细胞群体中的基因表达，或者通过经时地比较来自受试者的测试细胞群体中的基因表达图式，可以评价受试者的预后。例如，TOM34表达相比于正常对照样品的增加指示较为不利的预后。相反，TOM34表达与正常对照样品的相似性，指示受试者较为有利的预后。试剂盒本发明还包括CRC检测试剂，例如，特异性结合或鉴定TOM34核酸的核酸，例如与TOM34核酸的一部分互补的寡核香酸序列，或者与TOM34核酸编码的蛋白结合的抗体，或者适体。可以以试剂盒的形式将检测试剂包装在一起。例如，检测试剂可以包装在不同的容器中，例如核酸或抗体(或者结合于固体基质，或者与用于将它们结合于基质的试剂分别包装)、对照试剂(阳性/阴性)、和/或可检测标签。该试剂盒中还可以包括关于实施测定的说明书(例如书面(written)、磁带(tape)、VCR、CD-ROM等)。试剂盒的测定样式可以是Northern杂交或夹心ELISA,二者都是本领域已知的。例如，CRC检测试剂可以固定在固体基质，例如多孔片条(porousstrip)上，形成至少一个CRC检测位点。多孔片条的测量或检测区域可包括多个位点，每个均含有核酸。测试片条(teststrip)也可以含有用于阴性和/或阳性对照的位点。或者，对照位点可以位于不同于所述测试片条的片条上。任选地，不同的检测位点可含有不同量的固定核酸，即第一4企测位点中的量较高，随后的位点中的量较低。添加测试样品时，显示可检测信号的位点的数目提供样品中存在的CRC的定量指标。检测位点可以构成为任何可合适检测的形状，典型地是跨越测试片条宽度的条形或点形。抑制CRC的方法本发明进一步提供一种通过减少TOM34的表达(或者其基因产物的活性)来治疗或緩解受试者中CRC症状的方法。可以对患有或有风险发生(或易感)CRC的受试者预防性或治疗性地施用合适的治疗化合物。这样的受试者可以通过标准临床方法来鉴定，或者通过4全测TOM34的异常表达水平或者其基因产物的异常活性来鉴定。在本发明的背景下，合适的治疗剂包括，例如，细胞周期调节和细胞增殖的抑制剂。或者，本发明的治疗方法可包括减少TOM34基因产物的表达、功能，或其二者的步骤，其中TOM34的表达在结肠癌细胞中异常增加("上调"或"过高表达"的基因)。可以通过本领域已知的多种方法中的任何方法来抑制表达。例如，可以对受试者施用抑制或拮抗过高表达基因之表达的核酸，例如破坏过高表达基因之表达的反义寡核苷酸或小干扰RNA。当然，本文中描述的治疗或緩解方法，经过必要的修改后，可适用于本文所述之减少TOM34表达(或其基因产物之活性)的化合物在制备用于治疗或緩解受试者中结肠癌的药物组合物中的用途。这样的化合物可以是，例如，反义、siRNA、抗体、适体或核酶组合物。反义核酸及siRNA:如上所述，可以使用相应于TOM34核苷酸序列的反义核酸来降低该基因的表达水平。相应于CRC中上调的TOM34的反义核酸对CRC治疗是有用的。具体地说，本发明的反义核酸可以如下起作用结合TOM34的核苷酸序列，或其相应的mRNA,从而抑制所述基因的转录或翻i,，促进mRNA降解，和/或抑制TOM34所编码的蛋白质的表达，由此抑制这些蛋白的功能。本文所使用的术语"反义核酸"涵盖与靶序列完全互补的核苷酸，和具有一个或多个核苷酸错配的核苷酸，只要这些反义核酸能够特异性地与靶序列杂交。例如，本发明的反义核酸包括在至少15个连续核苷酸的范围内具有至少70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高、甚至更优选95%或更高的同源性的多核苦酸。可以使用本领域已知的算法确定同源性。本发明的反义核酸通过下述方式作用于产生TOM34编码蛋白的细胞结合编码所述蛋白的DNA或mRNA,抑制它们的转录或翻译，促进mRNA降解，抑制蛋白质的表达，从而导致蛋白功能的抑制。混，制成外用制剂，例如搽剂或罨剂。并且，根据需要，通过添加赋形剂、等渗剂(isotonicagents)、增溶剂、稳定剂、防腐剂、镇痛剂等，可以将本发明的反义核酸配制成片剂、粉末、颗粒、胶嚢、脂质体胶嚢、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些剂型可通过下文的7>知方法制备。本发明的反义核酸可以通过直接施于患处上，或者通过注射入血管以使其到达患处，来施用于患者。也可以使用反义封固介质(antisense-mountingmedium)以提高持久性和膜通透性。例子包括但不限于脂质体、聚-L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染试剂(lipofectine)或它们的衍生物。本发明的反义核酸衍生物的剂量，可以根据患者的状况适当调整，并以所需的量使用。例如，可以施用0.1至100mg/kg，优选O.l至50mg/kg的剂量范围。本发明的反义核酸抑制本发明蛋白质的表达，因而可以用于抑制本发明蛋白质的生物活性。此外，含有本发明的反义核酸的表达抑制剂也是有用的，因为它们可以抑制本发明的蛋白质的生物活性。在靶细胞中siRNA与对应于TOM34的转录物结合导致细胞的蛋白质产生减少。寡核苷酸的长度为至少IO个核苷酸，可以与天然存在的转录物等长。优选寡核苷酸的长度为少于75、50、25个核苷酸。最优选寡核苷酸的长度为19-25个核苷酸。本发明的反义核酸包括经修饰的寡核苷酸。例如，可以使用硫羰酸化(thioated)寡核苷酸以赋予针对寡核苷酸核酸酶的抗性。而且，可以使用针对TOM34的siRNA以降低TOM34的表达水平。本说明书中，术语"siRNA"指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。可以采用将siRNA导入细胞的标准技术，这其中包括以DNA为RNA转录之才莫板的技术。在本发明的背景下，siRNA含有有义核酸序列和针对上调标志物基因例如TOM34的反义核Si序列。构建siRNA以使单一转录物具有来自靶基因的互补的反义序列和有义序列，例如发夹结构。TOM34的siRNA与耙mRNA杂交，通过与通常为单链的mRNA转录本相结合，从而干扰翻译，进而干扰蛋白质的表达，藉此减少或抑制TOM34编码之多肽的产生。因此，本发明的siRNA分子可通过其在严紧条件下与TOM34的mRNA特异性杂交的能力来定义。为了本发明的目的，术语"杂交"或"特异性杂交"用于表示两个核酸分子在"严紧杂交条件下"杂交的能力。短语"严紧杂交条件"是指这样的条件，在该条件下，典型地在检测的杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同的环境下会不同。越长的序列在越高的温度发生特异性杂交。在下列文献中可找到核酸杂交的详细才旨导Tijssen，rec/zw々M&y/"5z'oc/zew^^vAfo/ecw/arWo/ogy—外Z)W6fe加'oww"/zWwc/e/c尸raZ&y,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一4殳i也，严:紧条件选择比限定的离子强度pH下特定序列的热解链温度(TJ低大约5-10°C。Tm是这样的温度(在限定的离子强度，pH和核浓度)，在该温度平衡状态时时，50%的探针被占据)。严紧条件还可以通过添加去稳定剂如曱酰胺实现。对于选择性或特异性杂交而言，阳性信号至少是背景的2倍，优选地是背景杂交的10倍。严紧杂交条件的实例可如下50%曱酰胺、5xSSC和l。/cSDS,42。C温育，或者5xSSC、1%SDS，65。C温育，在50°C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。在本发明的背景下，siRNA的长度优选小于500、200、100、50、或者25个核苦酸。更优选地，siRNA的长度为19-25个核芬酸。示例性的用于产生TOM34siRNA的核S吏序列包含SEQIDNO:48或52的核芬酸的序列作为靶序列。在RNA或其衍生物中，核苷酸序列中的碱基"t"应当替换为"u"。因此，例如，本发明提供包含核香酸序列5'-gaaaguguucucuacucca-3，(SEQIDNO:48)或5'隱ggauggaaacugcagagac-3，(SEQIDNO:52)的双链RNA分子。为了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反义链的3，端可以添加核苷酸"u"。所添加的"u"的数目为至少2个，一般2-10个，优选地2-5个。添加的"u"在siRNA反义链的3'端形成单链。可以将TOM34的siRNA以能与mRNA转录物结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，典型地如上文对反义分子的描述对本发明的siRNA分子进行修饰。其他修饰也是可能的，例如胆固醇偶联的siRNA显示药理学性质改善(Songetal.NatureMed.9:347-51(2003))。或者，可以在载体中携带编码siRNA的DNA。载体可以例如这样制备将TOM34靶序列克隆到表达载体中，其中所述表达载体具有可操作连接的调控序列，所述调控序列以这样的方式位于所述靶序列的侧翼，使得两条链均有可能得以表达(通过DNA分子的转录)(Lee,N.S.,etal"(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。与TOM34mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如位于所克隆DNA3'侧的启动子序列)转录，而作为TOM34mRNA之有义链的RNA分子则由第二启动子(例如位于所克隆DNA5，侧的启动子序列)转录。所述有义链和反义链在体内杂交，从而产生用于沉默所述TOM34的siRNA构建体。或者，可以利用两个构建体生成siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的TOM34可编码具有二级结构例如发夹的构建体，其中单一转录物具有来自靶基因的互补反义序列和有义序列。为了形成发夹环结构，可在有义序列和反义序列之间放置由任意核苷酸序列组成的环序列(loopsequence)。因此，本发明还提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]为对应于与TOM34的mRNA或cDNA特异性杂交之序列的核糖核苷酸序列，[B]为由3-23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。[A]区与[A，]区杂交，然后形成由[B]区组成的环(loop)。所述环序列的长度可以为3-23个核苷酸。所述环序列例如可以选自下列序列(http://ambionxom/tecMb/tb/tb_50dhtml)。此外，由23个核香酸组成的环序列也提供活性siRNA(Jacque,J,M.,etal.,(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.M,etal.,(2002)Nature,Vol.418:435-8。UUCG:Lee，N.S.，etal.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.;Fruscoloni,P.，etal.，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44。UUCAAGAGA:Dykxhoorn,D.M.，etal.,(2003)NatureReviewsCellBiology4:457-67。因此，环序列可以选自下组CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA。优选的环序列是UUCAAGAGA(DNA中为"ttcaagaga")。在本发明的背景下适于使用的示例性发夹siRNA包括对TOM34-siRNA-D(siD，针对靶序列SEQIDNO:48)5'-gaaaguguucucuacucca-[B]画uggaguagagaacacuuuc-3'(SEQIDNO:49)and对TOM34-siRNA-E(s正，针对靶序列SEQIDNO:52)5'-ggauggaaacugcagagac-[B]-gucucugcaguuuccaucc-3'(SEQIDNO:53)适当的siRNA的核苷酸序列可使用可从Ambion网站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)得到的siRNA设计计算机程序来设计。所述计算机程序基于如下规程选择核苷酸序列用于siRNA合成。选择siRNA靶位点1.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描寻找AA二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3'侧邻近的19个核苷酸作为siRNA靶位点。根据Tuschl等在(1999)GenesDev13(24):3191-7，不推荐针对5'和3'非翻译区(UTRs)和邻近起始密码子的区域(75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻"％起始复合物可干扰与siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，从考虑范围中排除与其它编码序列具有显著的序列同一性的任何靶序列。可采用BLAST2.0进行序列同一性搜索，它可以在NCBI服务器ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，优选可沿着待评价的基因的长度选择数个靶序列。侧翼邻接于TOM34基因序列的调节序列可以相同，也可以不同，使得它们的表达可以独立地、或者以时间性或空间性方式得到调控。通过将TOM34模板分别克隆到载体中来胞内转录siRNA,其中所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单位或人HIRNA启动子。为了将载体导入细胞，可以使用转染增强剂(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen),Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作转染增强剂。本发明的反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明多肽的表达，因而可以用于抑制本发明多肽的生物学活性。并且，含有本发明的反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂是有用的，因为它们可以抑制本发明多肽的生物学活性。因此，包含本发明的反义寡核苷酸或siRNA的组合物对于治疗CRC是有用的。抗体或者，可以通过施用与基因产物结合或以其它方式抑制基因产物功能的化合物，来抑制在CRC中过高表达的TOM34的基因产物的功能。例如，所述化合物是与TOM34的基因产物结合的抗体。本发明涉及抗体特别是针对TOM34编码蛋白的抗体、或所述抗体的片段的用途。如本说明书中使用的，术语"抗体"指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原(即上调标志的基因产物)或与其紧密相关的抗原相互作用(即结合)。另外，抗体可以是抗体片段或修饰抗体，只要它结合TOM34编码的蛋白。例如，抗体片段可以是Fab,F(ab，)2,Fv,或单链Fv(scFv)，在scFv中来自重链和轻链的Fv片^殳通过合适的接头连接(HustonJ.S.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-83(1988))。更具体地说，可以用酶，包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，然后在合适的组主细胞中表达(参见例如，CoM.S.etal.J.Immunol.152:2968-76(1994);BetterM.andHorwitzA.H.MethodsEnzymol.178:476-96(1989);PluckthunA.andSkerraA.MethodsEnzymol.178:497-515(1989);LamoyiE.MethodsEnzymol.121:652-63(1986);RousseauxJ.etal.MethodsEnzymol.121:663-9(1986);BirdR,E.andWalkerB.W.TrendsBiotechnol.9:132-7(1991))。抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)偶联进行修饰。本发明提供这样的修饰抗体。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。或者，抗体可包括嵌合抗体，其具有来自非人抗体的可变区及来自人抗体的恒定区，或者人源化抗体，其包括来自非人抗体的互补决定区(CDR)、和来自人抗体的框架区(FR)及恒定区。所述抗体可利用已知技术制备。人源化可通过用啮齿类的CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列的方式进行(见例如Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988))。因而，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上少于整个人源可变域的区域已被来自非人物种的相应序列取代。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，来制备人源抗体。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584;5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5，633，425;5,661,016。指向癌细胞中发生的特异性分子变化的癌症疗法的有效性，已经通过下述抗癌药的临床开发和管理机构的批准得以证实用于治疗晚期乳腺癌的曲妥单抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治疗慢性髓性白血病的曱磺酸伊马替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B细胞淋巴瘤和外膜细胞(mantlecell)淋巴瘤的rituximab(抗CD20单克隆抗体)(CiardielloF.etal.，ClinCancerRes.2001Oct;7(10):2958-70.SlamonDJ.etal"NEnglJMed.2001Mar15;344(ll):783-92.;RehwaldU.etal"Blood.2003Jan15;101(2):420-424.;FangG.etal.,(2000).Blood，96,2246-2253)。这些药物临床上是有效的，并且比传统抗癌剂具有更好的耐受性，因为它们仅仅耙向转化的细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，而且证明了分子靶向癌症疗法的理念。另外，当靶向药物与标准化疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1,47-56.;KlejmanA.etal.，(2002).Oncogene,21，5868-5876.)。因此，未来的癌症治疗将很可能涉及将常规药物与针对肿瘤细胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸润性(invasiveness)的輩巴特异性作用物质相结合。这些调节方法可以离体(exvivo)、体外(例如通过在作用物质的存在下培养细胞)或体内(例如通过给受试者施用作用物质)进行。所述方法包括施用蛋白质或蛋白质的组合、或者核酸分子或核酸分子的组合作为抵抗(counteract)差异表达基因的异常表达或其基因产物的异常活性的疗法。可以用拮抗(即降低或抑制)一种或多种过高表达基因之活性的治疗剂来治疗以基因和基因产物的表达水平或生物活性(相对于未患有疾病或病症的受试者)增加为特征的疾病和病症。可以治疗性或预防性地施用拮抗活性的治疗剂。因此，可以用于本发明背景下的治疗剂包括例如(i)过高表达基因的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗过高表达基因或基因产物的抗体；(iii)编码过高表达基因的核酸；(iv)反义核酸或"功能障碍性(dysfunctional)"核酸(即，由于过高表达基因的核酸内的异源插入所致)；(v)小干扰RNA(siRNA);或(vi)调节剂(即，改变过高表达或过低表达多肽与其结合配对物(bindingpartner)之间的相互作用的抑制剂、激动剂和拮抗剂)。将功能障碍性反义分子用于通过同源重组来"敲除"多肽的内源性功能(参见例如Capecchi,(1989)Science244:128892)。通过获取患者组织样品(例如从活;险组织)，并在体外测定其RNA或肽水平、表达的肽(或表达改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，来定量肽和/或RNA，可以容易地检测出水平的上升或下降。本领域公知的方法包括但不限于免疫测定(例如在Western印迹分析、免疫沉淀后随十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和/或4企测mRNA表达的杂交测定(例如Northern测定、点印迹、原位杂交等)。预防性施用在出现疾病的明显临床症状之前进行，以阻止疾病或病症的出现或者延迟其进程。调节差异表达基因的基因产物的一种或多种活性。蛋白质活性调节剂的例子包括但不限于核酸、蛋白质、这些蛋白质的天然存在的关连配体(naturallyoccurringcognateligands)、肽、肽才莫扣乂4勿及其它'J、分子。针对CRC的接种在本发明中，TOM34来源的肽被证明是HLA-24限制性的TAA表位，HLA-24是日本人和白种人群中普遍的HLA等位基因。利用候选的TOM34来源HLA-A24结合肽对HLA-A24的结合亲和力的信息鉴定了它们。用这些负载这些肽的树突状细胞(DC)体外刺激T细胞后，使用TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7))成功地建立了CTL。这些CTL表现针对结肠直肠癌细胞的强细胞毒活性。此外，来源于这些细胞的CTL克隆和系也针对内源过高表达TOM34的HLA-A24阳性结肠直肠癌细胞显示了特异性细胞毒性。这些CTL克隆和CTL系的细胞毒活性针对缺少HLA-A24或靶TAA表达的细胞系则没有得到显示。这些CTL克隆和CTL系的特异性细胞毒活性被非放射性靶(coldtarget)显著地抑制。这些结果证明，TOM34可用作CRC的TAA，且TOM34是HLA-A24限制性TAA的表位肽。由于TOM34抗原在大多数CRC中过高表达且与肿瘤细胞增殖相关，它们是用于抗CRC免疫疗法的良好靶标。因此，本发明进一步提供治疗或预防CRC的方法，所述方法包括施用包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的、少于约40个氨基酸，往往少于约20个氨基酸，通常少于约15个氨基酸的免疫原性肽的步骤。或者，所述免疫原性肽可包括SEQIDNO:7所示序列的衍生物，其中1个、2个、3个或者数个氨基酸被修饰、取代或添加。在优选的实施方案中，免疫原性肽是九肽或十肽。或者，本发明提供一种诱导针对CRC的抗肿瘤免疫的方法，所述方法包含施用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列之本发明免疫原性肽或其如上所述的衍生物的步骤。在本发明中，肽或其衍生物可通过体内或离体施用于受试者。另外，本发明还提供包含SEQIDNO:7所示序列的十肽TOM34的同源性分析显示，它们与来源于任何已知人基因产物的肽均没有显著的同源性。这样就降低了针对这些分子的免疫疗法带来未知或不希望的免疫反应的可能性。关于HLA抗原，使用在日本人中高度表达的A-24型有利于获得有效结果，使用A-2402等亚型更为优选。典型地，在临床上，事先考察需要治疗的患者的HLA抗原型，这样就能够合适地选择针对该抗原具有高水平结合亲和力，或者具有通过抗原呈递诱导细胞毒T细胞(CTL)能力的肽，另夕卜，为了获得显示高结合亲和力和CTL诱导能力的肽，可以在天然存在的TOM34部分肽的氨基酸序列的基础上取代或添加1、2、3、4或数个氨基酸。本文中，术语"数个"意思是5个或更少，或优选3个或更少。此外，除了天然被展示的肽之外，由于通过结合HLA抗原而一M示的肽的序列规则性是已^口的(Kubo，etal.，J.Immunol"152，3913，1994;Rammensee,etal.，Immunogenetics.41:178-228,1995;Kondo,etal"J.Immunol.155:4307-12，1995)，可以基于这种规则性对本发明的免疫原性肽进行修饰。例如，对于显示高HLA-24结合亲和力的肽，将它们从N末端起的第二个氨基酸取代为苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，而且C末端取代为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸的肽也可有利地使用。但是，若肽序列与具有不同功能的内源或外源蛋白质的氨基酸序列的一部分相同，则可能会诱发副作用，例如针对特定物质的自身免疫障碍或变应性症状；因此，优选的是利用现有数据库进行同源性搜索，以避免出现序列与另一蛋白质的氨基酸序列一致的情况。另外，如果根据同源性搜索得知即使1或2个氨基酸不同的肽亦不存在，则为了增加针对HLA抗原的结合亲和性和/或增加CTL诱导能力而对上述氨基酸序列所作的修饰没有造成此类问题的危险。虽然上述对HLA抗原具有高结合亲和力的肽有望成为高度有效的癌症疫苗，对于以高结合亲和力的存在作为指标选出的候选肽，必须考察它们是否真实存在CTL诱导能力。CTL诱导能力的验证如下进行诱导带有人MHC抗原的抗原呈递细胞(例如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞)，或更具体地说，来自人外周血单核白细胞的树突状细胞，用肽刺激后，与CD8阳性细胞混合，然后测定针对革巴细胞的细胞毒活性。作为反应系统，可以使用制备为表达人HLA抗原的转基因动物(例如BenMohamedL.，etal.,Hum.Immunol.2000Aug.;61(8):764-79中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性标记耙细胞，并根据耙细胞释放的放射性计算细胞毒活性。或者，可以通过测定在携带有固定化肽的抗原呈递细胞的存在下CTL产生并释放的IFN-y,并利用抗IFN-y单克隆抗体使培养基上的抑制区域可见，来进行考察。如上所述考察肽CTL诱导能力的结果发现，具有针对HLA抗原的高结合亲和力的肽不一定具有高的诱导能力。另外，包含KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7)所示氨基酸序列的十肽显示了特别高的CTL诱导能力。如上文提到的，本发明提供具有细胞毒T细胞诱导能力，并且包含其中取代或添加了1、2、3、4或数个氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列的肽。包含SEQIDNO:7中所示9个或10个氨基酸且其中取代或添加了1、2、3、4或数个氨基酸的氨基酸序列，优选不与其它蛋白质的氨基酸序列一致。尤其是，从N末端起第二个氨基酸取代为苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、曱硫氨酸(M)或色氨酸(W)的氨基酸取代，以及C末端氨基酸取代为苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、色氨酸(W)或曱硫氨酸(M)的氨基酸取代，以及N末端和/或C末端添加1到2个氨基酸的氨基酸添加是优选的例子。具体地，本发明提供一种十肽，其包含氨基酸序列KLRQEVKQNL(SEQIDNO:7),或K-[L,F,Y，M或W]-RQEVKQN-[L,F,L,I,W或M]。本发明的肽可以利用7>知的技术制备。例如，可以利用重组DNA^支术或化学合成来合成地制备所述肽。本发明的肽可以个别地合成，或者作为包含两个或多个肽的较长多肽合成。所述肽优选是分离的，即，基本上不含其它天然存在的宿主细胞蛋白或其片段。肽可包含修饰诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化，只要这些修饰不破坏本文所述的这些肽的生物活性。其它修饰包括纳入D-氨基酸或其它能够使用的氨基酸才莫拟物，例如，以增加这些肽的血清半寿期。本发明的肽可以制备为包含2种或更多种本发明肽的组合，用作可以在体内诱导CTL的癌症疫苗。所述肽可以作为合剂(cocktail)，或者使用标准技术相互偶联。例如，所述肽可以作为单一多肽序列表达。组合中的肽可以是相同或不同的。通过施用本发明的肽，这些肽被以高密度呈递于抗原呈递细胞的HLA抗原，然后诱导出与被展示肽和HLA抗原所成的复合物特异性反应的CTL。或者，通过除去受试者中的树突状细胞，获得了将本发明的肽固定化在其细胞表面上的抗原呈递细胞，用本发明的肽刺激它们，将这些细胞再次施用给受试者以诱导受试者中的CTL，结果，可以增加针对耙细胞的攻击性。更具体地，本发明提供治疗肿瘤或预防肺瘤的增殖、转移等等的药物，其包括1种或更多种本发明的肽。本发明的肽可用于治疗CRC。本发明的肽可以作为通过常规制剂方法配制的药物组合物直接施用。在此情况下，除了本发明的肽以外，可以包括通常用于药物的载体、赋形剂等等，视情况而定没有具体限制。本发明的免疫原性组合物可用于治疗和预防CRC。包含本发明的肽作为活性成分，用于治疗和/或预防CRC的免疫原性组合物，可以包含佐剂以使细胞免疫得以有效地建立，或者它们可以与其它活性成分例如抗肿瘤剂一起施用，而且它们可通过配制为颗粒剂施用。可以使用的佐剂包括文献中描述的那些(Johnson，Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289，1994)。示例性的佐剂包括，磷酸铝、氢氧化铝或明矾。另外，可以方便地使用脂质体制剂、其中药物结合于数iim直径小珠的颗粒制剂、和其中脂质结合于肽的制剂。施用方法可以是口服、皮内、皮下、静脉内注射等等，全身施用或局部施用于靶肿瘤附近是可能的。本发明肽的剂量可以根据待治疗的疾病、患者年龄、体重、施用方法等合适地调整，通常是0.001mg至)j1000mg,4尤选0.01mgf)100mg，更^t选0.1mg至))10mg,^f尤选数天到数月施用一次。本领域技术人员可以合适地选择合适的剂量。或者，本发明提供名为外来体(exosome)的细胞内小泡，它们将本发明的肽和HLA抗原之间形成的复合物呈现在它们的表面上。外来体可以例如使用日本专利特表平11-510507号公报和特表2000-512160号公报中详细记载的方法来制备，并且优选使用从作为治疗和/或预防目标的受试者获取的抗原呈递细胞来制备。本发明的外来体可以与本发明的肽类似地作为癌症疫苗接种。所用的HLA抗原类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的类型一致。例如，对于日本人，HLA-A24,尤其是HLA-A2402往往是合适的。在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括刺激(prime)T淋巴细胞的组分。脂质已经被鉴定为能够体外针对病毒抗原刺激CTL的作用物质。例如，可以将棕榈酸残基附接于赖氨酸残基的s-和a-氨基上，然后与本发明的免疫原性肽连接。然后，脂质化的肽可以通过直接在胶束或颗粒中施用，掺入脂质体施用，或者在佐剂中乳化来施用。作为CTL应答的脂质刺激的另一个例子，大肠杆菌脂蛋白，诸如三棕榈酰基-S-甘油半胱氨基丝氨基丝氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)(P3CSS),当共i"介附才矣于合适的肽时，可以用于刺激CTL(参见例如Deres,etal.,Nature342:561-4，1989)。酸。参见，例如，Wolffet.al.(1990)Science247:1465-1468;美国专利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO98/04720。基于DNA的递送技术的例子包括"棵(naked)DNA"，协助(布比卡因(bupivicaine;聚合物，肽介导的)递送，阳离子脂质复合物，和颗粒介导的("基因枪")或压力介导的递送(参见，例如美国专利5，922,687)。本发明的免疫原性肽也可以由病毒或细菌载体来表达。表达载体的例子包括「减毒病毒宿主，-渚如痘苗病毒(vaccine)或禽痘病毒(fowlpox)。该途径包括使用痘苗病毒，例如作为载体，来表达编码肽的核苷酸序列。一旦导入宿主中，重组痘苗病毒表达该免疫原性肽，从而引发免疫应答。在免疫规程中有用的痘苗病毒载体和方法记载于，例如，美国专利4,722,848。另一种载体是BCG(卡介苗)。BCG载体记载于Stover,etal.(1991)Nature351:456-460。多种其它可用于治疗性施用或免疫的载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体，逆转录病毒载体，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)载体，脱毒的炭疽毒素载体等等，是显而易见的。参见例如Shata,etal.(2000)Mol.Med.Today6:66-71;Shedlock，etal.(2000)J.Leukoc,Biol.68:793-806;andHipp,etal.(2000)InVivo14:571-85。本发明还提供使用本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。抗原呈递细胞可以如下诱导从外周血单核细胞诱导树突状细胞，然后使它们以体外、离体或体内方式接触本发明的肽(刺激)。当将本发明的肽施用于受试者时，在受试者体内诱导出抗原呈递细胞，本发明的肽固定于这些细胞。或者，将本发明的肽固定于抗原呈递细胞后，可将这些细胞作为疫苗施用给受试者。例如，离体施用可包括下列步骤a:从受试者收集抗原呈递细胞；和b:将步骤a的抗原呈递细胞与肽接触。步骤b获得的抗原呈递细胞可以作为疫苗施用给受试者。本发明还提供一种诱导具有高水平的细胞毒T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方法，其中所述方法包括将包含编码本发明肽的多核苷酸的基因体外转移到抗原呈递细胞的步骤。导入的基因可以是DNA或RNA的形式。关于导入方法，没有特别限制，可以使用本领域常规使用的各种方法，例如脂质体转染(lipofection)、电穿孔和磷酸钙方法。更具体地，可以如Reeves,etal"CancerRes.，56:5672,1996;Butterfield,etal.，J.Immunol"161:5607，1998;Boczkowski，etal"J.Exp.Med"184:465,1996;日本专利特表2000-509281号公报所述的来进行。通过将基因转入抗原呈递细胞，基因在细胞中经过转录、翻译等等，然后获得的细胞被I类或II类MHC加工，并经过呈递途径而呈递出部分肽。此外，本发明提供使用本发明的肽诱导CTL的方法。当对受试者使用本发明的肽时，在受试者体内诱导CTL，从而免疫系统针对肿瘤组织中CRC细胞的威力增强。或者，它们可以用于离体治疗方法，其中使来源于受试者的抗原呈递细胞、CD8阳性细胞或外周血单核白细胞在体外与本发明的肽接触(刺激)，诱导CTL后，将细胞返回受试者。例如，所述方法可包括下列步骤a:从受试者收集抗原呈递细胞；b:使步骤a的抗原呈递细胞与肽接触；c:使步骤b的抗原呈递细胞与CD8+T细胞混合，并共培养以诱导细胞毒T细I包；和d:从步骤c的共培养物收集CD8+T细胞。步骤d所获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗施用给受试者。相应地，本发明涉及这样的CD8+T细胞，它们能够识别由MHC分子例如HLA-24呈递的本文所述的肽。此外，本发明还涉及呈递本文所述的肽、包含HLA-24型I类MHC分子的细胞，例如APC。此外，本发明提供使用本发明的肽诱导的、分离的细胞毒T细胞。这些细胞毒T细胞是通过呈递本发明的肽的抗原呈递细胞刺激而诱导的，优选来源于作为治疗和/或预防目标的受试者，并且可以单独施用，或者与其它药物，包括本发明的肽或外来体联合施用，用于抗肿瘤目的。所得的细胞毒T细胞特异性作用于呈递本发明的肽，或者优选地，与诱导所用相同的肽的靶细胞。靶细胞可以是内源表达TOM34的细胞，或者是转染了TOM34基因的细胞，而且，由于被本发明的肽刺激而在细胞表面上呈现这些肽的细胞，也可以成为攻击目标。本发明还提供包括HLA抗原和本发明肽之间所形成的复合物的呈递的抗原呈递细胞。通过使本发明的肽或者编码本发明的肽的核苷酸接触而获得的抗原呈递细胞，优选来源于作为治疗和/或预防目标的受试者，并且可以作为疫苗单独或者与包括本发明的肽、外来体或细胞毒T细胞在内的其它药物组合施用。在本发明中，短语"疫苗"(又称免疫原性組合物)是指这样的物质，当它接种到动物中时，具有诱导抗肿瘤免疫或抑制CRC的免疫的功能。根据本发明我们提出，包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽可能是HLA-A24限制性表位肽，可能诱导产生针对表达TOM34的CRC细胞的特异性强免疫应答。因此，本发明还涵盖一种诱导抗肺瘤免疫的方法，该方法使用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽。通常，抗肿瘤免疫包括例如下述免疫应答隱针对包含TOM34表达细胞的肿瘤的细胞毒淋巴细胞之诱导，-识别包含TOM34表达细胞之肿瘤的抗体之诱导，-抗胂瘤细胞因子产生之诱导。因此，若某一蛋白质在接种于动物中时诱导上述任何免疫应答，则判定该蛋白质具有诱导抗肿瘤免疫的效果。蛋白质对抗肿瘤免疫的诱导，可以通过体内或体外观察宿主中免疫系统针对该蛋白质的应答来加以;险测。例如，细胞毒T淋巴细胞诱导的检测方法是公知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用被呈递给T细胞和B细胞。以抗原特异性方式对APC呈递抗原起响应的T细胞由于抗原刺激而分化成细胞毒T细胞(或细胞毒T淋巴细胞；CTLs)，然后增殖(这称为T细胞的活化)。因此，对于特定肽所致的CTL诱导，可以通过将所述肽经由APC呈递于T细胞，然后检测CTL的诱导来加以评估。另外，APC具有活化CD"T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和天然杀伤细胞的作用。由于CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，可以利用这些细胞的活化效果为指标来评估所述肽的抗肿瘤免疫诱导作用。使用树突状细胞(DC)作为APC以评价CTL诱导作用的方法是本领域公知的。DC是一种代表性的APC，在APC中具有最强的CTL诱导作用。在该方法中，首先使测试多肽接触DC，然后使该DC与T细胞接触。与DC接触后^r测到具有针对感兴趣细胞的细胞毒作用的T细胞，证明测试多肽具有诱导细胞毒T细胞的能力。CTL针对肿瘤的活性可以，例如，利用"Cr标记肺瘤细胞的裂解作为指标进行检测。或者，使用&胸苷摄取活性或LDH(乳糖脱氢酶)-释放作为指标，评估肿瘤细胞损伤程度的方法，也是公知的。除了DC，外周血单核细胞(PBMC)也可以用作APC。据报道，在GM-CSF和IL-4存在的条件下培养PBMC可增强CTL的诱导。类似地，已经证明，通过在钥孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC可诱导CTL。通过这些方法确认为具有CTL诱导活性的测试多肽，是具有DC活化效应及随后的CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作抗CRC的疫苗。而且，通过接触这些多肽而获得诱导抗CRC性CTL的能力的APC可用作抗CRC的疫苗。进一步，由于APC呈递所述多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作抗CRC疫苗。利用APC和CTL所致抗肿瘤免疫的此类CRC治疗方法称为细胞免疫疗法。通常，当细胞免疫疗法使用多肽时，已知通过组合多种具有不同结构的多肽，并使它们与DC接触，CTL诱导的效率会增加。因此，当用蛋白片段刺激DC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。或者，多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来确认。例如，当用多肽免疫的实验动物中诱导产生抗该多肽的抗体,并且这些抗体抑制胂瘤细胞生长、增殖或转移时，所述多肽可确定为具有诱导抗肿瘤免疫的能力。施用本发明的疫苗诱导抗肿瘤免疫，而该抗肿瘤免疫的诱导使治疗和预防CRC成为可能。针对CRC的治疗或预防可以包括任何下述步骤诸如CRC细胞生长的抑制，CRC细胞的退缩(involution)以及CRC细胞发生的抑制。CRC的治疗或预防的效果还包括患CRC个体的死亡率降低、血液中CRC标志减少、CRC伴发的可检测症状的緩解等。所述治疗性和预防性效果优选是统计学上显著的。例如，在观察中显著性水平为5%或更低，在行比较。例如，可将Student'st-检验，Mann-WhitneyU-检验或ANOVA用于统计学分析。上述有免疫活性的蛋白或编码该蛋白的多核苷酸或载体可与佐剂组合。佐剂是指当与具有免疫活性的蛋白共同(或相继)施用时增强针对该蛋白的免疫应答的化合物。例示性的佐剂包括但不限于霍乱毒素(choleratoxin)、沙门氏菌毒素(salmonellatoxin)、明巩(alum)等。此外，本发明的疫苗可适宜地与药物可接受的载体组合。这样的载体的例子有无菌水、生理盐水、磷酸盐緩冲液、培养液等。此外，疫苗可根据需要包含稳定剂，悬浮剂(suspensions),防腐剂，表面活性剂等。疫苗全身或局部地进行施用。疫苗施用可以通过单次给药进行，或者通过多次给药来强化(boost)。当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以例如通过离体(exvivo)方法治疗或预防CRC。更具体地，收集接受治疗或预防疗法的受试者的PBMC，使细胞与多肽在离体条件下接触，诱导APC或CTL，然后可将该细胞施用于受试者。也可通过将编码多肽的载体在离体条件下导入PBMC中来诱导APC。体外诱导的APC或CTL可以在施用前进行克隆。通过克隆和培养具有高靶细胞破坏活性的细胞，可以更有效地实施细胞免疫治疗。此外，以该方式分离的APC和CTL不仅可以用于针对提供细胞的受试者进行细胞免疫治疗，还可以用于针对来自其它个体的相似类型的肿瘤进行细胞免疫治疗。用于抑制CRC的药物组合物在本发明的背景下，适宜的药物制剂包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔或舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，或用于通过吸入或吹入(insufflation)施用的制剂。优选静脉内施用。制剂可以任选包装在离散的剂量单位(dosageunit)中。适于口服施用的药物制剂包括胶嚢剂、扁嚢剂(cachet)或片剂，它们各自含有一定量的活性成分。适合的制剂还包括粉末、颗粒、溶液、悬浮液和乳液。活性成分任选以大丸药糖剂(boluselectuary)或糊剂(paste)的形式施用。用于口服给药的片剂和胶嚢剂可含有常规赋形剂诸如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或成型来制备，任选与一种或多种配方成分压缩或成型。压缩片剂可通过如下方法制备将自由流动形式的活性成分，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和/或分散剂混合，在适当的机器中进行压缩。成型片剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行成型。所述片剂可根据本领域公知的方法进行包衣(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式；或者也可以作为干燥产物提供，在使用前用水或其它适宜溶媒来构成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的緩释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。适于非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其中任选地含有抗氧化剂、緩冲剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与预期接受者的血液等张(isotonic)的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中含有悬浮剂和/或增稠剂。所述制剂可以提供为单位剂量或多次剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(continuousinfusion)。可以/人前述的无菌4分末、颗粒及片剂的类型制备即配即用的注射溶液和悬浮液。适于直肠给药的制剂包括含有标准载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂(suppository)。适于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille),其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，本发明的化合物可以用作液体喷雾剂、可分散粉末，或以滴鼻剂(drops)的形式。滴鼻剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂和/或悬浮剂。吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurizedpack)或其它便利的气溶胶喷雾递送装置方便地递送化合物。气溶胶包装可含有适宜的喷射剂，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量量(meteredamount)的阀门来确定剂量单位。或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以采取干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以提供为单位剂型，例如作为胶嚢、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。其它的制剂包含可释放治疗剂的可植入装置及粘性贴片(adhesivepatches)。需要时，可以采用适于活性成分緩释的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂和/或防腐剂。应当理解，除了上面具体提到的成分外，本发明的制剂可包括对于所讨论的制剂类型而言其它本领域常规的药剂。例如，适用于口服施用的制剂可包括调味剂。优选的单位剂量制剂含有如下所述有效剂量的活性成分，或有效剂量的适当部分的活性成分。对于前述的各种情况，所述组合物，例如肽和有机化合物，可以在每天约0.1-约250mg/kg的剂量范围内口服或通过注射施用。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。片剂或其它以分散单元提供的单位剂型可适宜地含有这样的量，该量在该剂量条件下为有效量，或者在多个该剂量条件下为有效量；例如，单位剂型含有约5mg-约500mg,通常为约100mg-约500mg的单位。所用剂量将依赖于多种因素，包括受试者的年龄和性别，治疗的确切疾患及其严重程度。此外，给药途径也依赖于病症及其严重程度而变化。然而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规地计算出合适的最佳剂量。下面的实施例描述了本发明的方面，它们并不意在限制权利要求所述的本发明的范围。下面的实施例例示了在CRC细胞中差异表达的基因的鉴定和表4i。实施例细胞系和临床材料人结肠癌细胞系HCT116和RKO获自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)。所有这些细胞均在合适的培养基中单层培养，即McCoys5A(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于HCT116;RPMI1640(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis，MO)用于RKO,培养基i匀添力口了100/o月台牛血;青(CanseraInternationalInc.,Ontario,Canada)和1。/o抗生素/抗真菌剂溶液(Sigma-Rich)。将细胞维持在37。C、5%<^02的加湿气氛下。癌性组织和相应的非癌性粘膜是从12名患者获得知情同意后于手术中切除的。人B-类淋巴母细胞系TISI细胞(HLA-A24/24)和EHM(HLA-A3/3)由TakaraShuzoCo,Ltd.(Otsu，Japan)惠赠。将TISI细胞用于肽介导的细胞毒性测定。结肠直肠癌细胞系DLD-1(HLA-A24/02)、HT29(HLA-A24/01)和SNU-C2A(HLA-A31/26)购自ATCC。慢性髓性白血病细胞系K562购自ATCC。半定量RT-PCR使用TRIZOL试剂(Invitrogen)根据制造商的规程从培养细胞或临床组织中提取总RNA。用DNA酶I(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)处理提取的RNA，然后利用oligo(dT)12_18引物和SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)逆转录成单链cDNA。我们通过监测<^4户￡>//基因作为定量对照，序列为5，-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3，(SEQIDNO;41)和5，-GGTCCACCACTGACACGTTG-3，(SEQIDNO;42)用于04尸D7/;5，-TGGTATAAACCTAAGGCCCTGAT-3，(SEQIDNO;43)和5，-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)用于TOM34。在所有扩增反应前先用94"预先热变性2min，然后再进行18个(对于GL4尸D^)或29个(对7PM3力如下的扩增循环94°C30秒，6(TC30秒，和72。C30秒；反应在GeneAmpPCR系统9700(PEAppliedBiosystems，Foster,CA)上进行。Northern印迹将人多组织印迹(BDBioscience,PaloAlto，CA)与32P标记的PCR产物杂交。探针是使用引物组5，-GAACGTGAAGGCATTCTACAGA-3，(SEQIDNO;45)和5'-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)进4亍RT-PCR，然后用Mega标记试剂盒(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UnitedKingdom)用32P-dCTP进行随机寡核苦酸标记而制备的。预杂交、杂交和清洗根据供应商的建议进行。用增感屏将印迹在-80。C放射自显影10天。抗TOM34多克隆抗体的制备使用下列引物组5，-CATAAGCTTGCATGGCCCCCAAATTCCCA-3，(SEQIDNO;58)和5，-GTTAAGCTTTTAGTGTAGGTTCT-3，，(SEQIDNO;59)扩增TOM34的整个编码区域，然后将其克隆到pET28载体(Novagen,Madison,WI)的合适克隆位点中以生成表达His-标签TOM34蛋白的质粒。在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌抹(Stratagene，LaJolla,CA)中表达重组蛋白，并使用TALONSuperflowMetalAffinityResin(BDBioscience)根据制造商的规程加以纯化。将蛋白接种到兔中，然后根据标准方法在亲和柱上纯化免疫血清。使用含有50mMTris-HCl(pH7.5)、250mMNaCl、0.1%SDS和0,5%NP40，以及蛋白酶抑制剂合剂组III(ProteaseInhibitorCocktailSetIII)(CALBIOCHEM,LaJolla,CA)的0.1%RIPA样緩冲液(RIPAlikebuffer)从细胞提取蛋白质，使用该蛋白质进行Western印迹分析。免疫组织化学使用亲和纯化的抗人TOM34多克隆抗体进行免疫组织化学染色。通过将载玻片在0.01M柠檬酸盐緩冲液(pH6.0)中108。C高压蒸汽预处理10分钟从脱石蜡并复水的组织中修复(retrieve)抗原，然后将石蜡包埋的组织切片用于SAB-PO过氧化物酶免疫染色系统(Nichirei，Tokyo,Japan)构建表达针对TOM34的siRNA的psiU6BX根据先前的记载(W02004/076623)，将双链寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0载体的SfoI位点中来制备siRNA表达载体。配对的寡核苷酸的序列为5,-CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC-3，(SEQIDNO;46)和5'誦AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC陽3，(SEQIDNO;47)用于siD;5，-CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;50)和5,-AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;51)用于siE。用T4多核香酸激酶磷酸化后，将配对的寡核苷酸煮沸5min,然后通过緩慢冷却退火产生双链寡核苷酸。使用由下述序列组成的寡核苷酸制备对照质粒psiU6BX-EGFP。各核苷酸序列、siRNA靶序列和SEQIDNO均示于表l。5'画CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;54)和5，-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;55)。为了考察TOM34-siRNA的效果，转染质粒5天后使用抗TOM34抗体进行Western印迹分析。表1插入siRNA表达载体的特异性双链寡核苷酸的序列及各个siRNA的靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>集落形成测定使用FuGENE6试剂(RocheDiagnostics),用表达TOM34-si認A的质粒瞬间转染铺在10-cm培养亚(4x105个细胞/皿)上的HCT116细胞，并将细胞维持在含10%胎牛血清和800[ig/ml遗传霉素的培养基中两周。将生存下来的细胞用100%曱醇固定并用Giemsa溶液染色。在另一个实-验中，用细胞计数试剂盒(DOJINDO，kumamoto，Japan)测量活细胞数。统计分析使用可商购的软件(Statview;SASInstitute,Caiy，NC),通过ScheffesF检验的ANOVA分析统计显著性。TOM34由来的肽通过结合子贞测软件(http://bimas.dcrLnih.gov/cgi-biri/molbio/ken_paiker—combofoim)(ParkerKC,et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75),对可结合HLA-A24分子的、TOM34肽序列由来的9聚体和10聚体肽进行预测(ParkerKC，et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75)。这些肽由Mimotopes,SanDiego，CA根据标准固相合成方法合成，并通过反相HPLC纯化。肽的纯度(>90%)和同一性分别通过分析型HPLC和质谱分析来确定。将肽以20mg/ml溶解在二甲亚砜(DMSO)中并保存在-80。C。体外CTL诱导导针对呈递于HLA上的肽的CTL。如他处所述体外生成DC(NukayaI，etal.,IntJCancer.1999;80(l):92-7;TsaiV，改aL，JImmunol.1997;158(4):1796"802)。简单地说，从正常志愿者(HLA-A24)中用Ficoll-Paque(Pharmacia)溶液分离出外周血单核细胞(PMBCs)，并通过附着于塑料组织培养瓶(BectonDickinson)力口以分离，以富集它们的单核细胞级分。将富集了单核细胞的群体在含2%的热灭活自身血清(AS)的AIM画V(Invitrogen)中、在l，OOOU/ml的GM画CSF(KirinBreweryCompany提供)和1,000U/mlIL-4(Genzyme)存在下培养。培养7天后，在AIM-V中，20°C，以4小时时间，于3吗/ml(32-微球蛋白存在的条件下，使产生细胞因子的DC负载20pg/ml的HLA-A24-结合肽。然后照射这些负载了肽的DC(5，500rad),并以l:20的比例与自身CD8+T细胞混合，其中CD8+T细胞是用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)阳性选择获得的。进一步将该混合物分份，将等份在48孔平板(Corning)中温育；每个孔在0.5ml含10ng/mlIL-7(Genzyme)的AIM-V/2%AS中含有1.5xl04个负载了肽的DC和3xl()5个CD8+T细胞。3天后，向这些培养物补充IL-2(CHIRON)到终浓度为20IU/ml。在第7天和第14天，进一步用负载了自身肽的DC来再刺激T细胞。每次用上述相同的方法制备DC。在21天的第3轮肽刺激后，测试了针对负载肽的TISI细胞的细胞毒性。CTL扩大培养程序使用与Riddell，etal.(Walteretal，NEnglJMed333:1038-1044,(1995)，Riddeletal,NatureMed.2:216-223，(1996))所述的方法类似的方法，在培养物中扩大培养CTL。在40ng/ml抗CD3单克隆抗体(Pharmingen)的存在下，将总数5x104个CTL重悬在25ml含有25x106个被照射(3，300rad)的PBMC和5x106个被照射(8,000rad)的EHM细胞的AIM-V/5%AS中。在培养开始后l天，向培养物中加入120IU/ml的IL-2。在第5、8和11天向培养物中添加含30IU/mlIL-2的新鲜AIM-V/5%AS。CTL克隆的建立将扩大培养后的CTL培养物稀释，并将细胞分配到96孔圓底微量滴定板(NalgeNuncInternational)的孔中，将细胞数调节为0.3、1和3个CTL/孔。然后将CTL与7xl()4个细胞/孔的同种异型PBMC、1x1C)4个细胞/孔的EHM、30ng/ml的抗CD3抗体及125U/ml的IL-2在总共150pl/孔的含5%AS的AIM-V中培养。10天后向培养基中加入50pl/孔的IL-2,使得IL-2的终浓度成为125U/ml。在第14天测试CTL的细胞毒活性，并使用与上述相同的方法扩大培养CTL克隆。细胞毒性测定在C02培养箱中37。C条件下、用100pCi的Na^Cr04(PerkinElmerLifeSciences)标记靶细胞1小时。在标记前，通过将细胞与20吗/ml的肽在37。C共温育16小时来制备负载肽的耙细胞。漂洗标记的靶细胞，并在圓底微量滴定板中以0.2ml的终体积与效应细胞混合。将平板离心(800xg，4分钟)以增加细胞对细胞的接触，并放置在37。C的C02培养箱中。温育4小时后，从每个孔收集0.1ml上清液，使用y计数器(gammacounter)确定放射性。在评价针对内源表达TOM34的靶细胞的细胞毒性的场合，在30倍过量的未标记K562细胞存在下测定细胞溶解活性，其排除任何由NK类效应物所致的非特异性裂解。通过非放射性靶抑制测定(coldtargetinhibitionassay)确证抗原特异性，该测定使用负载有抗原肽(37。C、20(ig/ml,16小时)的未标记TISI细胞来竟争"Cr-标记HT29肿瘤细胞的识别。特异性细胞毒性的百分比是通过下式计算特异性51Cr释放的百分比而求出的{(测试样品释放的cpm-自发释放的cpm)/(最大释放的cpm-自发释放的cpm)}x100。自发释^L通过在没有效应细胞存在下单独温育靶细胞来确定，最大释放通过将靶与1NHC1共温育而获得。所有的测量均一式二份进行，其平均的标准偏差一直低于平均值的10%。结果CRC中roM^的表达上升在我们更早的研究中，我们使用由23040种基因构成的cDNA微阵列对11例CRC和9例结肠腺癌进行了全基因组表达模式分析，从而鉴定了多种在结肠肺瘤中表达水平频繁变化的基因。在表达水平在11例癌(carcinoma)中频繁上调的基因中，我们在本发明中着眼于一种内部标识号为D3124的基因，它对应于rOM34(GeneBanck登录号AB085681,SEQIDNO;60,61)(线粒体外膜的34kDa移位酶)。随后的半定量RT-PCR分析揭示，它在所检查的20个CRC临床样品里的16个中表达增强(图1A)。另外，在我们的cDNA微阵列数据中，r(9M34在所有8例肝细胞癌、19例肺癌中的5例、9例膀胱癌中的3例、27例急性髓性白血病中的7例、以及49例软组织肉瘤中的9例中也有显著上调。为了考察它在人类正常组织中的表达，我们使用r(9M54cDNA作为探针进行了多组织Northern印迹分析。结果，分析显示了一种大小约2.0kb的转录物，它在睾丸和卵巢中大量表达，在前列腺、脾和结肠中弱表达，而在其它11个被一企组织中则均不表达(图1B)。结肠直肠癌细胞系和CRC组织中TOM34蛋白质的积累我们制备了抗TOM34多克隆抗体，并通过免疫组织化学染色考察了TOM34蛋白在8个CRC细胞系和12个CRC组织中的表达。免疫印迹分析检测到了在全部被检CRC细胞系中均大量表达的34kDaTOM34条带。另一方面，在两种非癌性细胞系MH3T3和COS7中，显示较低的表达水平(图2B)。使用16例CRC及相应的非癌性粘膜组织进行Western印迹分析，证实了它在16个肿瘤的15个中相比于正常粘膜表达增强(图2A)。为了考察TOM34的亚细胞定位，我们用HCT116和RKO细胞以抗TOM34抗体进行了免疫细胞化学染色，结果显示该蛋白的细胞质定位。此外，我们使用12个石蜡包埋的结肠癌组织进行了免疫组织化学染色。在这12例肿瘤中的11例中，TOM34在癌性细胞的细胞质中被强染色，而其在非癌性粘膜中几乎不S皮染色(图3)。TOM34-siRNA对结肠癌细胞生长的影响为了阐明TOM34在癌细胞中的作用，我们制备了表达针对TOM34的siRNA的质粒，并考察了它们对癌细胞生长的影响。我们制备了两种形式的表达设计为抑制TOM34的siRNA的质粒(psiU6BX-TOM34-siD和-s正)，以及一种对照质粒(psiU6BX-s正GFP)。我们用psiU6BX-TOM34-siD、psiU6BX-TOM34-siE或psiU6BX-siEGFP转染了HCT116细胞。针对被转染细胞之提取物的Western印迹分析显示，与psiU6BX-s正GFP相比，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX-TOM34-s正显著地抑制了被转染细胞中TOM34的表达(图4A)。我们将共表达新霉素抗性基因的质粒转染到HCT116细胞中，并用合适浓度的遗传霉素培养它们13天。与TOM34的表达下降相一致，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX画TOM34陽siE相比于psiU6BX-s氾GFP均明显地延迟了被转染细胞的生长(图4B)。这些数据表明，TOM34的表达是与癌细胞的生长相关的。TOM34由来的HLA-A24结合肽的预测表2和3按高结合亲和力的顺序显示了预测为抗原的肽。选择了20个10聚体肽(表2)和20个9聚体肽(表3)作为抗原，并如下文所述进行了考察。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>使用预测的肽刺激T细胞按照"材料与方法"中描述的方式产生了识别TOM34由来的肽的细胞毒T细胞。将所得具有可检测的细胞毒活性的CTL扩大培养，并且建立了CTL系(CTLlines),这些CTL系针对负载肽的靶比针对没有用肽短暂刺激(pulse)的靶显示更高的细胞毒活性。用10聚体肽TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNO;7))刺激过的CTL系针对负载肽的靶显示很强的细胞毒活性，而对未负载肽的靶则不显示任何显著的细胞毒活性(图5)。这些CTL系显示强力且抗原特异性的细胞毒性，在低达1.2的E/T比仍可检测到(图6)。CTL克隆的建立如"材料和方法"中所述，对CTL系培养物进行有限稀释，然后扩大培养，建立了CTL的克隆。这样得到的TOM34-299特异性CTL克隆包括具有极高细胞裂解活性的克隆，克隆全体的活性在1.2的E/T比为20%到70%的裂解，在10的E/T比为40%到>90%的裂解(图7)。以内源表达TOM34的结肠癌细胞系为耙的细胞毒活性对于TOM34-299肽激发产生的CTL克隆，考察了它们识别并杀死内源表达TOM34的肿瘤细胞的能力。图8显示了TOM34-299肽激发产生的两种CTL克隆所得的结果。这两种CTL克隆对于表达TOM34及HLA-A24的结肠癌细胞系DLD-1和HT29均显示强的细胞毒活性。另一方面，这两种CTL克隆对表达TOM34而不表达HLA-A24的SNU-C2A结肠癌细胞系均不显示任何相关的细胞毒活性(图8)。非放射性乾抑制测定进行了非放射性靶抑制测定来确证CTL系的特异性。使用"Cr标记的HT29细胞作为放射性靶(hottarget),将不进行51Cr标记的负载或不负载肽的TISI细胞作为非放射性靶(coldtarget)。当以不同比例向测定中加入负载肽的非放射性靶细胞时，针对靶HT29细胞的特异性细胞裂解被显著抑制，但加入未负载肽的非放射性耙细胞时，针对靶HT29细胞的特异性细胞裂解则完全不被抑制。该结果作为效应物/放射性靶比为20时特异性裂解的百分比显示(图9)。抗原肽的同源性分析针对TOM34-299建立的CTL克隆显示了非常强的细胞毒活性。这可能说明该肽的序列与来源于已知可致敏(sensitize)人免疫系统的其它分子的那些肽具有同源性。为了排除这种可能性，以肽序列作为查询项，使用BLAST算^r(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/blast/blast.cgi)(AltschulSF,etal.，NucleicAcidsRes,1997;25(17):3389-402.;AltschulSF，etal"JMolBiol.1990;215(3):403-10)进行同源性分析，结果未显示具有显著同源性的序列。这说明TOM34-299的序列是独特的，而且就我们所知，激发针对任何无关分子的非期望免疫反应的可能性极低。结合T细胞表面抗原的抗体所致的CTL活性阻断为了确认观察到的杀伤活性是否由细胞毒T细胞所介导，使用中和CTL活性相关T细胞表面抗原的功能的抗体考察了抗体对该杀伤活性的作用。添加识别I类HLA或CD8的抗体明显阻断了CTL活性，而添加针对II类HLA或CD4的抗体也以较前者为低的程度阻断了CTL活性，如图10所示。该结果证明，针对HT29结肠直肠癌细胞观察到的T细胞克隆的细胞毒活性，是HLA限制性的CD8阳性T细胞杀伤活性。讨论在本发明中我们证明，TOM34在CRC中频繁上调；它在正常睾丸及卵巢中大量表达，在前列腺、脾和结肠中微量表达，但在所检查的其它正常成人组织中几乎未检测到。有希望的治疗手段之一是癌症免疫疗法，其包括T细胞介导的抗肺瘤免疫接种。通过识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原，CD"细胞毒T淋巴细胞以展示抗原的细胞为靶标。由于肿瘤组织源于非癌性自身细胞，大多数肿瘤细胞逃脱免疫监视。为了应用癌症免疫治疗，鉴定在癌细胞中特异表达的抗原是非常重要的。抗原不在睾丸中表达，因为缺少I类MHC分子(JassimA,etal.,EurJImmunol19:1215-1220,1989)。所以，在癌症和睾丸中特异性表达的基因应是免疫治疗的靶标。由于TOM34在除睾丸和卵巢之外的正常器官中不大量表达，并且在大多数结肠癌中上调，因此TOM34可能作为新的癌-睾丸抗原起到CRC治疗靶标的作用。最初认为TOM34作为将蛋白质输入线粒体的移位酶的组分起作用，因为该蛋白与酵母Tom蛋白显示序列同源性(NuttallSD，etal.,DNACellBiol16:1067-1074,1997)。尽管曾预测TOM34定位于线粒体外膜中，新近一项研究揭示其包含在Hela细胞的胞浆中(Chun-SongY&HenryW,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110，2002;AbhijitM，etal,,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104，2002)。与该数据一致的是，我们使用抗TOM34多克隆抗体进行免疫组织化学染色发现，TOM34在CRC细胞中的亚细胞定位是细胞质。在另一项报道中，使用酵母双杂交系统的筛选将含缬酪肽蛋白(VCP)和hsp90鉴定为TOM34相互作用蛋白。VCP是一种AAA(与多种细胞活性相关的ATP酶)家族成员，又称p97;它与遍在蛋白化的IkB(x和26S蛋白酶体的亚基形成复合物，提示VCP可能通过降解IkBoi而参与转录因子NFicB向细胞核的移位(DaiRM，etal.,JBiolChem273:3562-3573,1998)。HSP90是一种分子伴侣，许多分子的稳定性和功能都需要它的相互作用。因此，TOM34可能通过与HSP90结合而稳定化。由于HSP90与致癌性分子例如Rafl、AKT和SMYD3结合，已经开发了若干种HSP90抑制剂来治疗人类癌症。人们估计这些抑制剂会阻碍正常的功能性HSP90，从而造成严重的不良作用，因为HSP90在大多数正常组织中是普遍表达的。总之，TOM34在CRC中上调，但在除睾丸和卵巢之外的正常器官中几乎不表达。因此，抑制TOM34很可能不会对正常细胞带来不良影响。另夕卜，抑制TOM34导致癌细胞的细胞生长被抑制，这提示TOM34在它们的生长中起关键作用。这些数据暗示，TOM34是人结肠直肠癌的免疫疗法及抗癌药开发的有希望的靶标。另外，诱导强力和特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定，保证了各种癌症类型中肽疫苗接种策略的临床应用的进一步发展(BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9，vanderBruggenP，etal"Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV，etal.,JExpMed.1993;178(2):489-95.,KawakamiY,etal.,JExpMed.1994;180(l):347-52.，ShichijoS，etal"JExpMed.1998;187(3):277画88,ChenYT，etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8.，HarrisCC.,JNatlCancerInst.1996;88(20):1442-55"ButterfieldLH，etal.，CancerRes.1999;59(13):3134画42.,VissersJL,etal.,CancerRes.1999;59(21):5554隱9.,vanderBurgSH,etal.,JImmunol.1996;156(9):3308-14.，TanakaF，etal.,CancerRes.1997;57(20):4465-8.,FujieT,etal.,IntJCancer.1999;80(2):169-72.,KikuchiM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):459-66.，OisoM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):387-94.)。我们分析了作为HLA-A24限制性TAA表位的、来源于TOM34的肽，其中HLA-A24是日本人以及白人人群中常见的HLA等位基因之一(DateY，etal"TissueAntigens,1996;47:93-101.,KondoA,etal"JImmunol,1995;155:4307-12，KuboRT,etal.，JImmunol,1994;152:3913-24)。在本发明中，我们利用来自TOM34的HLA-A24限制性表位肽的候选物与HLA-A24的预测的结合亲和力，对它们进行了选择。用负载有这些候选肽的DC体外刺激T细胞之后，使用TOM34-299肽(KLRQEVKQNL)(SEQIDNO;"成功地建立了针对负载肽的TISI细胞显示强细胞毒活性的CTL。另外，来源于这些CTL的CTL克隆也显示了针对内源过高表达TOM34的HLA-A24阳性结肠直肠癌细胞系的特异性细胞毒性。这些CTL克隆的细胞毒活性对于缺少HLA-24或耙TAA表达的细胞系不显示，而且被非放射性靶显著地抑制。这些结果强烈地提示TOM34是一种新的结肠癌TAA,而且TOM34-299是这种TAA的HLA-A24限制性特异表位肽。由于这种抗原在大多数结肠癌病例中过高表达并且与肿瘤细胞增殖相关，它似乎是一种可用于结肠癌免疫疗法的极好靶标。TOM34-299的同源性分析显示它与来自任何已知人基因产物的肽均无显著的同源性。工业应用性本文描述了通过激光捕获解剖和全基因组cDNA^f效阵列的组合获得的结肠癌基因表达分析，该分析鉴定了用于癌症预防和治疗的靶标的特异性基因。根据这些差异表达的基因中的一部分的表达，本发明提供了用于鉴定和检测CRC的分子诊断标志物。本文所描述的方法还可用于鉴定其它分子靶标，用于CRC的预防、诊断和治疗。本文报道的数据增加了人们对CRC的全面理解，方便了新诊断策略的开发，并且为鉴定治疗剂和预防物质的分子靶标提供了线索。这些信息为深化对于结肠肿瘤发生的认识作出了贡献，并为诊断、治疗及最终预防CRC的新策略的开发提供了指标。例如，阻断TOM34表达或者阻止起活性的作用物质具有作为抗癌剂，尤其是用于治疗CRC的抗癌剂的治疗效用。这样的作用物质的例子包括针对rOMW基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA和核酶，以及识别TOM34的抗体。或者，诱导强力和特异性的抗肿瘤免疫应答的新TAA的鉴定，为各种癌症类型中肽疫苗接种策略的临床应用的进一步发展提供了保证。另外，尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但可理解的是上述说明书实际上是例示性和解释性的，意欲阐明本发明及其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地认识到，可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意欲受到上述说明的限定，而由如下权利要求及其等同物限定。权利要求1.一种诊断受试者中结肠癌或发生结肠癌的倾向性的方法，包括确定来源于患者的生物样品中TOM34的表达水平，其中与该基因正常对照水平相比，所述样品中表达水平的增加表明该受试者患有结肠癌或具有发生结肠癌的风险。2.权利要求1的方法，其中所述样品表达水平比所述正常对照水平高至少10%。3.权利要求1的方法，其中基因表达水平通过选自下组的方法确定a)才企测TOM34的mRNA,b)检测TOM34编码的蛋白质，和c)检测TOM34的生物活性。4.权利要求1的方法，其中所述来源于患者的生物样品包括上皮细胞。5.权利要求1的方法，其中所述来源于患者的生物样品包括结肠癌细胞。6.权利要求1的方法，其中所述来源于患者的生物样品包括来自结肠癌细力包的上皮细月包。7.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤a)使测试化合物与TOM34的多核苷酸编码的多肽接触；b)检测该多肽和测试化合物之间的结合活性；和c)选择与该多肽结合的测试化合物。8.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤a)使候选化合物与表达TOM34的细胞接触；和b)选择与不存在该候选化合物时4企测的TOM34表达水平相比，降低TOM34表达水平的候选化合物。9.权利要求8的方法，其中所述细胞包括结肠癌细胞。10.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤a)使测试化合物与TOM34的多核苷酸编码的多肽接触；b)检测步骤(a)的多肽的生物活性；和c)选择这样的测试化合物与不存在该测试化合物时检测的所述多肽的生物活性相比，该化合物抑制TOM34的多核普酸编码的多肽的活性。11.筛选用于治疗或预防结肠癌的化合物的方法，该方法包括下列步骤a)使候选化合物与其中导入了载体的细胞接触，该载体包含TOM34的转录调节区域和在该转录调节区域控制下表达的报道基因；b)测量所述报道基因的表达或活性；和c)选择降低所述报道基因的表达或活性的候选化合物。12.—种试剂盒，其包含与(a)TOM34或与(b)TOM34编码的多肽结合的检测试剂。13.治疗或预防受试者中的结肠癌的方法，包括给所述受试者施用反义组合物，所述反义组合物包含与TOM34编码序列互补的核香酸序列。14.治疗或预防受试者中的结肠癌的方法，包括给所述受试者施用siRNA组合物，其中siRNA组合物降低TOM34的表达。15.权利要求14的方法，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有义链。16.权利要求15的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，,其中[A]为与SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示序列对应的核糖核苷酸序列，[B]为由3到23个核苷酸组成的核糖核苷酸环序列，[A，]为由[A]的互补序列组成的核;瞎核苷酸序列。17.治疗或预防受试者中的结肠癌的方法，包括给所述受试者施用药学有效量的与TOM34蛋白结合的抗体或其免疫活性片段的步骤。18.—种治疗或预防受试者中的结肠癌的方法，包括给所述受试者施用疫苗，该疫苗包含(a)由TOM34的核酸编码的多肽，(b)所述多肽的免疫活性片段，或(c)编码该多肽或(b)所述的免疫活性片段的多核苷酸。19.权利要求18的方法，其中所述免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基S吏序列的十肽；(ii)具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含其中取代或添加了1或2或数个氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。20.—种诱导抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括使多肽、编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体与抗原呈递细胞接触的步骤，其中所述多肽是由TOM34编码的或者是该多肽的免疫活性片段。21.权利要求20的方法，其中免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽；(ii)具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含其中取代或添加了1或2或数个氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。22.权利要求20的方法，其中该方法进一步包括给受试者施用抗原呈递细胞的步骤。23.—种治疗或预防受试者中的结肠癌的方法，所述方法包括施用根据权利要求7至11任一项的方法获得的化合物的步骤。24.—种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的针对TOM34的多核苷酸的反义多核苷酸或siRNA。25.权利要求24的组合物，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有义链。26.权利要求25的组合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]为与SEQIDNO:48或SEQIDNO:56所示序列对应的核糖核苷酸序列，[B]为由3到23个核苷酸组成的核糖核苷酸环序列，[A，]为由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。27.—种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的与TOM34编码的蛋白结合的抗体或其片段。28.—种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的根据权利要求7至11任一项的方法选择的化合物作为活性成分，以及药学可接受的载体。29.包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽。30.—种具有细胞毒T细胞诱导能力的肽，其中该肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，其中取代或添加了1或2或数个氨基酸。31.权利要求30的肽，其中从N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱碌u氨酸或色氨酸。32.权利要求30的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。33.—种用于治疗或预防结肠癌的组合物，所述组合物包含药学有效量的权利要求29或30的肽作为活性成分。全文摘要本文描述了检测和诊断结肠癌的客观方法。在一个实施方案中，诊断方法涉及确定在结肠癌细胞和正常细胞之间有区别的TOM34的表达水平。最后，本发明提供了筛选结肠癌中有用的治疗剂的方法，治疗结肠癌的方法以及接种受试者抗结肠癌的方法。文档编号G01N33/574GK101278196SQ20068003538公开日2008年10月1日申请日期2006年7月21日优先权日2005年7月27日发明者中村佑辅,古川洋一,松岛敏志,田原秀晃,角田卓也申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司