纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤的制作方法

纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤的制作方法
【专利摘要】本发明涉及纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤，具体涉及纳米银与自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于制备抗肿瘤药物的用途及自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于促进纳米银对肿瘤细胞杀伤的用途。
【专利说明】纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纳米银与自噬的抑制剂或者敲低/敲除自噬必须基因表达的试 剂用于制备抗肿瘤药物的用途。

【背景技术】
[0002] 纳米银就是将粒径做到纳米级的金属银单质。纳米银由于其很好的杀菌作用，被 应用于医疗领域，比如抗菌类医药及医疗器械，抗菌塑料及橡胶制品，抗菌纺织品及服装鞋 袜等。纳米银还具有很多别的生物学效应，比如抗真菌、抗病毒、消炎。作为为数不多的已 经被应用于临床的纳米材料，近年的细胞以及小鼠实验研究表明，纳米银还可能是一种潜 在的抗肿瘤药物。纳米银已经在多种癌细胞中被证实具有很强的细胞杀伤效果，包括氧化 压力、DNA损伤、细胞周期停滞、凋亡、坏死。
[0003] 纳米银在动物模型中的抗肿瘤效果也得到了验证。在道尔顿淋巴腹水瘤小鼠模 型中，相对于没加纳米银处理组，纳米银对腹水中癌细胞进行杀伤，很好的控制了腹水的体 积，使得小鼠的体重还原至腹水瘤接种前的体重。另外一项研究显示，纳米银对恶性黑色素 瘤具有很好的杀伤效果，用细胞穿膜肽TAT修饰纳米银以增加其穿透细胞的效果后，黑色 素瘤的杀伤效果得到了进一步的提升，与用阿霉素处理的抑瘤效果相似。不过不同的是阿 霉素处理组小鼠体重明显下降，而纳米银处理组小鼠的体重还有一定程度的增加，显示了 其更小的副作用。纳米银抗肿瘤的另外一个特点是抑制肿瘤血管的生长，肿瘤血管的生成 是肿瘤生长、侵润、转移过程中至关重要的一步。在链唑霉素刺激诱导大鼠肿瘤模型中，可 以见到明显的肿瘤血管生成，纳米银处理后，新肿瘤血管生成的现象被抑制。
[0004] 自噬是真核生物细胞内一种基本降解过程，当自噬发生时，双层膜包裹细胞内非 必要的或者功能失常的组分形成自噬体，自噬体与溶酶体融合对内容物进行降解，这个过 程具有很重要的生理以及病理学意义。自噬在发育分化、癌症、神经退行性疾病、衰老、免疫 等生理病理方面起着非常重要的作用。自噬在肿瘤的发生发展过程中被认为起着促进肿瘤 生长和抑制肿瘤生长两方面的作用。
[0005] 自噬在肿瘤发生过程中起着双刃剑的作用。一方面来讲，自噬可以增强肿瘤细胞 对压力（包括低氧环境、饥饿、一些治疗手段）的耐受。即使在更长时间的压力下，自噬可以 延长肿瘤细胞的生存时间，产生休眠的肿瘤细胞，使其在生存条件变好之后能重新复活。由 自噬带来的压力下存活、休眠、重生等一系列效应可能是肿瘤治疗的一个阻碍。另一方面， 正是由于自噬可以减轻压力造成的损伤，这对抑制肿瘤的生长意义重大。因为通过消除损 坏的蛋白和细胞器，自噬可以避免基因组的损伤，基因组的损伤往往会促进肿瘤发生。慢性 细胞死亡和炎症反应都可能促进肿瘤的发生，自噬能对这些损坏进行消除，从这方面讲自 噬可以抑制肿瘤发生。但是如果自噬被抑制，细胞内的平衡遭到破坏，这样更加会导致肿瘤 的发生。肿瘤细胞可以适应环境，并且对体内特定的压力产生更强的适应性，这就导致肿瘤 细胞更加难以被清除。自噬在这个过程中，通过维持新陈代谢状态可能阻止肿瘤细胞演变 为更加恶性的状态。所以尽管自噬可能会保护肿瘤细胞的生存，但是作为补偿的是，自噬同 时也可以对损伤进行消除。在自噬被抑制的细胞里面，肿瘤存活率减少变得并不重要了，因 为自噬的抑制导致基因组损坏的增多和慢性炎症的增强，这些都会导致肿瘤的生长。所以 总的说来，自噬在肿瘤发生里面虽然起着两方面的作用，但是主要的作用还是抑制肿瘤细 胞的发生和恶化。
[0006] 相对于自噬在肿瘤发生过程中主要起抑制肿瘤的作用，自噬在肿瘤发展过程中则 主要起着促进肿瘤生长存活的作用。研究表明，自噬在癌细胞中起着最主要的作用就是抵 抗压力，这就保护了肿瘤的正常生长。在很多种肿瘤细胞中，如果将自噬必需基因的表达敲 低，则表现出细胞死亡的增强。肿瘤细胞由于生长快需要很高的代谢速度，在体内模型中， 自噬缺陷的肿瘤细胞相对自噬正常的细胞，在遭遇压力的时候更容易死亡。在人胰腺癌细 胞系和肿瘤样本中都观察到了自噬水平升高的现象，自噬可以通过维持细胞内能量的产生 来保证肿瘤细胞的快速生长。另外，在癌细胞接受化疗或者放疗的情况下，自噬效应可能帮 助癌细胞进入休眠状态，这可能是肿瘤复发以及肿瘤耐受的一个原因。并且现在已经有很 多证据显示抑制自噬可以增强抗癌药物的效果。当自噬处于一定的范围内，主要体现为促 进肿瘤细胞存活。但是也存在过度激活的自噬导致肿瘤细胞死亡的现象，这也是一个可能 的抑瘤机制。
[0007] 很多纳米颗粒都已经被报道可以引起细胞自噬，比如稀土材料：如氧化钐Sm20 3、 氧化铕Eu2O3、氧化礼Gd2O 3、氧化试Tb2O3、氧化钇（Y2O3)、氧化镧（La 2O3)、氧化镱（Yb2O3);量 子点：羧基化的CdSe/ZnS QDs、羧基化的CdTe QDs ;碳基材料：水溶性纳米富勒烯C6tl、内嵌 钕原子的C6ciONcU C00H-CNT、C6tl的羟基衍生物C6tlOHx ;另外还有不同粒径的纳米金颗粒、磁 性纳米颗粒、氧化锰颗粒等都被报道可以引起细胞自噬现象。然而银纳米颗粒是否能引起 细胞自噬，以及引起的纳米银引起的自噬对细胞的存亡起着怎样的作用还没有报道。另外， 纳米银在对肿瘤细胞的杀伤过程中，自噬起着怎样的作用也没有报道。


【发明内容】

[0008] 本发明的第一个方面提供纳米银与自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表 达的试剂用于制备抗肿瘤药物或试剂盒的用途。
[0009] 在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。
[0010] 在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自噬下游降解 阻断剂，优选选自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化铵士311101115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其组合。所述自噬抑制剂均购自Sigma Aldrich，USA(参见Mizushima N.et al. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010Feb5 ; 140 (3) : 313-26) 0
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因选自Atg3、Atg5、Beclinl、Atg7、 Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral 或其组合（参见 Mizushima N.et al.Methods in mammalian autophagy research. Cell. 2010Feb5 ; 140 (3) : 313-26. ) 〇
[0012] 在一个优选的实施方案中，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂选自siRNA、 shRNA，和miRNA或其组合。
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述纳米银可以具有不同形貌、粒径和表面修饰，所述 形貌包括球形，薄片状、立方体或其他多面体，所述粒径为5-300纳米，所述表面修饰包括 PVP、PEG或肽修饰等。
[0014] 本发明的第二个方面提供自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂 用于制备促进纳米银对肿瘤细胞杀伤的药物或试剂盒的用途。
[0015] 在一个优选的实施方案中，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。
[0016] 在一个优选的实施方案中，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自噬下游降解 阻断剂，优选选自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化铵士311101115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其组合。
[0017] 在一个优选的实施方案中，所述自噬相关基因选自Atg3、Atg5、Beclinl、Atg7、 Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral 或其组合。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂选自siRNA、 shRNA，和miRNA或其组合。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述纳米银可以具有不同形貌、粒径和表面修饰，所述 形貌包括球形，薄片状、立方体或其他多面体，所述粒径为5-300纳米，所述表面修饰包括 PVP、PEG或肽修饰等。

【专利附图】

【附图说明】
[0020] 图1纳米银扫描电镜分析：合成的纳米银的粒径为26. 5±8. 4nm ;
[0021] 图2纳米银DLS分析：动态光散射分析显示，纳米银的水合粒径为58. 8 ± I. 7nm ;
[0022] 图3纳米银引起HeLa细胞自噬：
[0023] a与阳性对照雷帕霉素（Rap)相同，纳米银引起EGFP_LC3/HeLa细胞内发生荧光点 聚集；
[0024] b纳米银在EGFP_LC3/HeLa细胞中引起的自噬效应随时间增加而增强；
[0025] c纳米银在HeLa细胞中引起的自噬效应随使用浓度加大而增强；
[0026] 图4wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：
[0027] a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银处理造成Hela细胞活性减弱 20. 91% ；
[0028] b ANXA5-FITC PI流式分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤效 果增强了 29. 37% ;
[0029] c Η0/ΡΙ染色统计：wortmannin抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增强了 20. 18% ；
[0030] 图5bafilomycin Al抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：
[0031] a MTT :BFA抑制自噬后，纳米银处理造成Hela细胞活性减弱25. 01% ;
[0032] b ANXA5-FITC PI流式分析：BFA抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增强了 31. 28% ；
[0033] c Η0/ΡΙ染色统计：BFA抑制自噬后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增强了 20. 58%;
[0034] 图6通过转染ATG5siRNA抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：
[0035] a HeLa细胞转染ATG5siRNA后，敲低了 HeLa细胞中的ATG5表达水平和自噬水平；
[0036] b MTT分析：转染ATG5siRNA后，纳米银处理造成Hela细胞活性减弱了 27. 41% ;
[0037] c ANXA5-FITC PI流式分析：转染ATG5siRNA后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增 强了 20. 23% ;
[0038] d Η0/ΡΙ染色统计：转染ATG5siRNA后，纳米银对Hela细胞杀伤效果增强了 20. 58% ；
[0039] 图7B16细胞中wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤：
[0040] a MTT分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银处理造成B16细胞活性减弱了 28. 54% ；
[0041] b ANXA5-FITC ΡΓ流式分析：wortmannin抑制自噬后，纳米银对B16细胞杀伤效果 增强了 23. 66% ;
[0042] 图8wortmannin抑制自噬促进纳米银对黑色素瘤的杀伤：
[0043] a纳米银或wortmannin处理，不会造成小鼠体重的减轻；
[0044] b给药过程中小鼠黑色素瘤体积变化；
[0045] c给药结束后小鼠瘤重统计显示，纳米银处理组中，小鼠瘤重减轻了 42. 10%， wortmannin与纳米银共处理组瘤重则减轻了 60. 91%，这表明抑制自噬后纳米银的抗肿瘤 效果增强了 18.81%。

【具体实施方式】
[0046] 本发明通过以下技术方案实现。
[0047] 实验方法 [0048] 纳米银合成方法
[0049] 我们用基于连续流技术的电化学法合成了 PVP包裹的纳米银颗粒，具体方法为，将 纯的银棒进行抛光和清洗，然后安装在密封容器的盖子上，通电电压为15V，反应过程中每 分钟变化一次电极方向，反应温度为90°C。将5毫克/毫升的PVP K30 (30154484, Sinopharm Chemical Reagent Co.，Ltd)溶液通过注射器以100毫升/小时的速度持续匀速注入容器， 最后，将收集到的银颗粒溶胶通过0. 22微米的滤膜进行过滤即得到了所需的纳米银颗粒。
[0050] 纳米银表征
[0051] 透射电镜分析：将分散于去离子水中的纳米银溶液滴到铜网的碳膜上，室温干燥， 无需染色，直接用透射电子显微镜（JE0L，Tokyo, Japan)进行观察拍照。直接用拍得的图片 进行纳米银粒径分析，通过Image J软件分析超过800个纳米颗粒的粒径，统计后得到纳 米银的平均粒径、标准差和大小分布。
[0052] 用 Malvern ZetasizerNano 检测 仪(Malvern Instrument Ltd. ,Worcestershire, UK)检测动态光散射以及zeta电势时，用去离子水配制纳米银溶液 至30 μ g/mL，室温进行检测。
[0053] 细胞培养以及EGFP_LC3/HeLa细胞系构建
[0054] 细胞培养试剂均购买于GIBIC0(Carlsbad，CA)。在本研究中用到的细胞（均来 源于上海细胞库）均连续单层培养于含有10% FBS的DMEM培养基中，培养条件为37°C， 含 5 % CO2。构建 HeLa EGFP-LC3 细胞系时，用 Lipofectamine2000 转染 pEGFP-LC3 质粒 (参见 Y. Kabeya, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J.2000Nov I; 19 (21):5720-8.)到 HeLa细胞中，具体操作为：
[0055] 1)分HeLa细胞于24孔板，IxlO5个细胞/孔；
[0056] 2)次日，将800ng质粒pEGFP-LC3溶于50 μ L双无培养基（无血清无抗生素）中， 2 μ LI ipo2000溶于50 μ L双无培养基，轻轻混匀，室温静置5分钟；
[0057] 3)将两管轻轻混匀，室温放置20分钟；
[0058] 4)转染细胞，转染前先将培养基换为100 μ L双无培养基；
[0059] 5)转染后的细胞于培养箱培养6小时后换液；
[0060] 6)转染24小时后，细胞传代于一个新的细胞培养板中，用添加了 0.6mg/mL G418 (Promega, Madison, WI, USA)的 DMEM 培养基进行选择培养；
[0061] 7)大约10天后，经过扩大培养就获得了在荧光显微镜下强烈表达绿色荧光的细 胞克隆。
[0062] EGFP-LC3点聚集形成分析
[0063] 1)分EGFP_LC3HeLa细胞于24孔板，IxlO5个细胞/孔；
[0064] 2)当EGFP-LC3HeLa细胞长到约60%密度时，加纳米银或者阳性对照雷帕霉素处 理细胞；
[0065] 3)处理到指定时间后拍照；
[0066] 4)对图片中含有荧光点聚集的细胞比率进行统计分析。统计方法为，计算含有至 少5个EGFP-LC3点聚集的细胞在所有表达绿色荧光蛋白的细胞（在我们构建的稳定表达 EGFP-LC3的细胞中，100%的细胞表达绿色荧光蛋白）中的比例。这个实验需要两个不同的 实验者进行双盲实验。
[0067] Western blot蛋白印迹实验
[0068] 1)细胞样品处理及制作电泳用样品：胰酶消化收集处理后的细胞，SOOxg离 心后去除上清，加入含有蛋白酶抑制剂（Sigma，P8340)的细胞裂解液（1 % Nonidet P-40(Beyotime, ST366), 1% sodium deoxycholate(Pierce, #89905), 25mMTris-HCl, 150mM NaCl，pH7. 6)于冰上裂解细胞，然后加入等体积2x SDS电泳上样缓冲液。置沸水中煮样10 分钟制成SDS电泳样品。
[0069] 2)SDS_PAGE电泳：根据所需蛋白的大小配制合适浓度的SDS电泳凝胶，待测样品 等量上样后进行电泳分离（上层浓缩胶恒压80伏特，下层分离胶恒压120伏特）。
[0070] 3)转膜：SDS-PAGE电泳完成后进行转膜（若为硝酸纤维素膜则直接使用，PVDF膜 需要用甲醇激活才能使用），350安培恒流90分钟，转膜过程在冰水浴中进行。
[0071] 4)封闭：转膜完成后，将载有蛋白的膜置于TBST缓冲液配置的5%脱脂牛奶中，摇 床室温封闭1小时。
[0072] 5) -抗孵育：根据蛋白抗体的使用说明或预实验结果，配制合适浓度的一抗，封 闭后的转移膜室温孵育一抗3小时或4°C过夜。
[0073] 6)洗涤一抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。
[0074] 可以根据实验需要适当减少或增加洗涤次数。
[0075] 7)二抗孵育：用一抗相对应的二抗室温摇床孵育膜40分钟到1小时。
[0076] 8)洗涤二抗：用TBST缓冲液于室温摇床震荡清洗3次，每次5分钟。
[0077] 9)显色检验：膜上的蛋白含量信号用ECL显影试剂盒（Biological Industries, Beit Haemek, Israel)和柯达医用胶片进行显色检测。
[0078] MTT细胞活力分析
[0079] 噻唑蓝（MTT)比色法检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。实验步骤为：
[0080] DHeLa细胞培养于96孔板中，当细胞接近IxlO4个细胞/孔的时候，加纳米材料 进行处理，每个组5个复孔。
[0081] 2)加入5毫克/毫升的MTT至终浓度0. 5mg/mL，于37°C细胞培养箱中培养4小 时。
[0082] 3)小心吸去孔内培养基终止培养。
[0083] 4)每孔加入150 μ L DMS0,置摇床上摇晃至结晶物充分溶解均匀，注意液体不能溢 出。
[0084] 5)然后在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔吸光值（Elx800, BioTek，Winooski ,VT, USA)〇
[0085] 细胞凋亡检测
[0086] 检测原理：ΑΝΧΑ5选择性结合磷酯酰丝氨酸。正常情况下，磷酯酰丝氨酸主要分布 在细胞膜内侧，在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞 表面。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit) (购自碧云天生物技术研究所）则是利用了这一原理，用FITC标记的重组人ANXA5直接地 检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。碘化丙陡（Propidium Iodide, PI) 可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由 于细胞膜已经不完整，Annexin V-FITC可以进入到细胞质内，与细胞膜内侧的磷酯酰丝氨 酸结合，从而使坏死细胞也呈现绿色荧光。
[0087] 实验步骤：
[0088] 1)把处理后的细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适 量胰酶消化细胞。消化好后加入之前收集的细胞培养液，终止消化，这样可以保证收集到已 经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞。
[0089] 2)将收集到的细胞IOOOxg离心5分钟，弃上清，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
[0090] 3)取5-10万重悬的细胞，IOOOg离心5分钟，弃上清，加入195μ I Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。
[0091] 4)加入 5 μ I Annexin V-FITC，轻轻混勻。
[0092] 5)加入10 μ 1碘化丙啶染色液，轻轻混匀。
[0093] 6)室温（20-25°C )避光孵育10-20分钟，孵育过程中可以重悬细胞2-3次，随后 置于冰浴中。
[0094] 7)随即进行流式细胞仪检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。
[0095] 细胞死亡检测
[0096] H〇eChst33342是一种可以穿透活细胞细胞膜的蓝色荧光染料。PI不可以透过活 细胞的细胞膜，只能透过破损的细胞膜从而对核染色呈现红色荧光，所以可以指示死细胞。 简单说来，用培养基配制IOmM Hoechst33342和IOmM PI混合液，于37°C恒温培养箱染色 20分钟，然后在荧光显微镜下拍照。每组统计600个细胞，PI阳性的细胞在Hoechst阳性 细胞中所占的比例则为细胞死亡率。这个实验需要两个作者进行双盲检测。
[0097] siRNA转染细胞实验
[0098] ATG5siRNA(由4条siRNAs按照相同质量比混合使用，以下为各自的序列：Sense 5'-GGA AUA UCC UGC AGA AGA ATT-3'（SEQ ID No: 1)，Anti-sense 5'-UUC UUC UGC AGG AUA UUC CTT-3'（SEQ ID No :2) ;Sense 5'-CAU CUG AGC UAC CCG GAU ATT-3'（SEQ ID No :3) ,Anti-sense 5'-UAU CCG G ⑶ AGC UCA GAU GTT-3'（SEQ ID No :4) ;Sense 5'-GAC AAG AAG ACA UUA GUG ATT-3'（SEQ ID No:5)，Anti-sense5'-UCA CUA AUG UCU UCU U⑶ CTT-3'（SEQ ID No :6) ;Sense 5' -CAA UUG GUU UGC UAU UUG ATT-3'（SEQ ID No :7) ,Anti-sense 5'-UCA AAU AGC AAA CCA AUU GTT-3'（SEQ ID No :8))，和阴 性对照 siRNA (序列信息为：Sense 5'-UUC UCC GAA CGU ⑶ C ACG UTT-3'（SEQ ID No: 9)，Antisense 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'（SEQ ID No :10))购自上海吉玛生物 科技公司。实验步骤为：待24孔板中细胞55%到65%细胞密度时，每孔转染20nM siRNA， RNAimax (Invitrogen, 13778-075)用作转染试剂，转染操作为：将 20nM siRNA 溶于 100 μ L opti-MEM培养基中，2 μ L RNAimax溶于100 μ L opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温静置5 分钟；将两管轻轻混勻，室温放置20分钟，24孔板中预先加入300 μ L含10% FBS的DMEM 培养基，将混合物转染细胞。24小时后换液。转染36到48小时后，可加纳米银进行处理。
[0099] 荷瘤鼠构建以及给药
[0100] 首先我们构建了小鼠动物模型，我们购买了 16只6-8周的SPF级的C57BL/6雄鼠 (购自北京维通利华实验动物技术有限公司），剃掉其左侧腋下的毛，然后将lx IO6个重悬 于100微升无菌PBS中的Β16细胞注入左侧腋下。4天后，就构建成功了带直径为4-6毫米的 Β16皮下肿瘤的小鼠模型。将小鼠随机分为4个组：对照组、wortmannin组、纳米银组、纳米 银加 wortmannin组，每组4只鼠。从接种Β16细胞开始的第五天开始给药：wortmannin组每 天注射25nmol/kg wortmannin ;纳米银组每天注射I. 5mg/kg纳米银；纳米银加 wortmannin 组每天注射I. 5mg/kg纳米银加上25nmol/kg wortmannin ;对照组则为等量的生理盐水。每 天给药一次，均为在位给药。每天测量小鼠体重和肿瘤的直径，连续给药8天后，牺牲小鼠， 剥取皮下肿瘤并进行称重统计。
[0101] 实施例1 :电化学法合成水溶性纳米银颗粒
[0102] 我们用基于连续流技术的电化学法合成了 PVP包裹的纳米银颗粒，通过扫描电镜 (图1)分析得知，我们合成的纳米银的粒径为26. 5±8. 4nm。动态光散射分析（图2)显示， 纳米银的水合粒径为58. 8±1. 7nm，多分散指数为0. 29±0. 04。纳米银在水中的zeta电势 为-12. 9±L lmV。
[0103] 实施例2 :纳米银处理引起细胞内自噬
[0104] 我们构建了稳定转染EGFP-LC3的HeLa细胞系，当自噬发生时，便可以看到细胞内 有绿色荧光点聚集（图3a)。在24孔板中，当EGFP-LC3/H eLa细胞长到约60(%密度时，力口 入10微克/毫升的纳米银处理细胞，分别于〇、2、4、6、8、10、12小时拍照，并对含有荧光点 聚集的细胞比率进行统计分析，我们发现随着时间的增加，含有荧光点聚集的细胞的比例 就越大，表明引起的细胞自噬就越强（图3b)。在24孔板中，当HeLa细胞长到约60%密度 时，加不同浓度（〇、5、10、15、20微克/毫升）的纳米银处理细胞24小时，然后用细胞裂解 液裂解细胞收样，通过western blotting进行检测，我们发现随着纳米银使用浓度的增加， 引起的自噬效果增强（图3c)。
[0105] 实施例3 :wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤
[0106] 在24孔板中，当HeLa细胞密度长到约60 %时，我们分别用浓度为ΙμΜ的 wortmannin (购自 Sigma-Aldrich)、10 微克 / 毫升纳米银、1 μ M 的 wortmannin 加上 10 微克 /毫升纳米银共处理细胞24小时，然后通过MTT、Annexin A5 (ANXA5) -FITC PI流式分析、 Η0/ΡΙ染色分析三种方法对细胞凋亡情况进行检测。MTT结果显示1 μ M的wortmannin与10 微克/毫升纳米银共处理与单用纳米银处理相比，细胞活性减弱了 20. 91%，wortmannin单 处理对细胞活性没有影响（图4a) JNXA5-FITC PI流式分析（图4b)，与MTT分析结果一致， wortmannin将纳米银导致的细胞死亡（位于右下和右上区域的细胞的相对比例，右下代表 早期凋亡细胞，右上代表凋亡晚期的细胞以及坏死的细胞，下文均同）增加了 29. 37%。接 下来我们用到了 Hoechst (HO)/PI染色分析，由于PI不可以透过活细胞的细胞膜，只能透过 破损的细胞膜而对核染色，所以可以指示死细胞，从图中可以看出，wortmannin将纳米银导 致的细胞死亡增加了 20. 18%，wortmannin单处理对细胞死亡没有影响（图4c)。
[0107] 实施例4 :bafilomycin Al抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤
[0108] 我们还尝试了别的自噬抑制剂来检测抑制自噬对纳米银处理下细胞命运的影响。 与上面实验方法相同，我们使用了一种自噬下游的抑制剂IOOnM bafilomycin Al(BFA)(购 自Sigma-Aldrich)与10微克/毫升的纳米银共处理，通过MTT、ANXA5 - FITC PI流式分 析、Η0/ΡΙ染色分析三种方法对细胞凋亡情况进行检测，均取得了同wortmannin处理相似 的结果。MTT分析结果显示BFA与纳米银共处理与单用纳米银处理相比，细胞活性减弱了 25. 01% (图5a)。ANXA5 - FITC PI流式分析与MTT分析结果一致，BFA将纳米银导致的细 胞死亡增加了 31. 28% (图5b)。最后，Η0/ΡΙ染色分析显示，与单用纳米银处理相比，BFA 与纳米银共处理细胞死亡增加了 20. 58% (图5c)。
[0109] 实施例5 :通过ATG5基因敲减抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤
[0110] 接下来，我们还用到了一个更为专一的抑制自噬的方法一转染自噬相关基因 ATG5siRNA，用来检测抑制自噬对纳米银处理下细胞命运的影响。当24孔板里面的HeLa细 胞长到约55%-65%密度后，利用1?隱丨11^转染2〇11麻1658丨1?隱或者对照8丨1?隱，转染36小 时后收样通过western blotting检测ATG5siRNA对细胞自噬敲减的效果。我们发现我们 成功的敲减了细胞内本底的自噬水平（图6a)。这个时候利用10微克/毫升的纳米银处理 转染ATG5siRNA的细胞24小时，与用10微克/毫升的纳米银处理的转染对照siRNA的细 胞相比，ATG5siRNA处理过的细胞对纳米银处理表现得更加敏感，通过MTT、ANXA5-FITC PI 流式分析、Η0/ΡΙ染色分析三种方法对细胞凋亡情况进行检测。MTT结果显示转染ATG5特 异性siRNA的细胞中，纳米银引起的细胞活性减弱了 27. 41% (图6b)。ANXA5 - FITC PI流 式分析显示，与转染对照siRNA的细胞相比，自噬水平降低的细胞中纳米银导致的细胞凋 亡与坏死增加了 20. 23% (图6c)。最后，Hoechst/PI染色分析显示，纳米银处理后，转染 ATG5特异性siRNA的细胞比转染对照siRNA细胞死亡增加了 20. 58% (图6d)。但是转染 ATG5特异性siRNA组并没观察到明显的细胞凋亡或坏死。
[0111] 总的说来，实施例1-5证明了，无论是利用自噬泡形成抑制剂，还是自噬下游降解 阻断剂，或者使用ATG5敲低的方法来阻断自噬，都使得纳米银对细胞的毒性增加。这就表 明纳米银引起的细胞自噬起着保护细胞的作用。
[0112] 实施例6 :B16细胞中wortmannin抑制自噬促进纳米银对细胞的杀伤
[0113] 为了在一个恶性程度很强的肿瘤模型一B16黑色素模型中检验我们的结果，我们 首先探究了在B16细胞中纳米银的效果。在24孔板中，当B16细胞密度长到约60%时，我们 用1 μ M的自噬抑制剂wortmannin、50微克/毫升的纳米银、1 μ M的自噬抑制剂wortmannin 加上50微克/毫升的纳米银分别处理细胞24小时，然后利用MTT和ANXA5-FITC PI流式分 析对细胞凋亡情况进行检测。MTT分析结果显示，1 μ M的自噬抑制剂wortmannin与50 μ g/ mL的纳米银共处理组比纳米银单处理组细胞活性减弱了 28. 54% (图7a)。ANXA5-FITC PI 流式分析显示，wortmannin将纳米银导致的B16细胞凋亡和坏死增加了 23. 66% (图7b)。 这和在HeLa细胞中取得的结果是类似的。这表明在B16细胞中，纳米银引起的自噬也起着 保护性细胞的作用。
[0114] 实施例7 :wortmannin抑制自噬促进纳米银对黑色素瘤的杀伤
[0115] 在B16细胞实验的基础上，我们开展了动物实验。首先我们构建了荷瘤小鼠动物 模型，带直径为4-6毫米的B16皮下肿瘤的小鼠模型构建成功后。将小鼠随机分为4个组： 对照组、wortmannin组、纳米银组、纳米银加 wortmannin组，每组4只鼠。从接种B16细 胞开始的第五天开始给药：wortmannin组每天注射25nmol/kg wortmannin ;纳米银组每天 注射I. 5mg/kg纳米银；纳米银加 wortmannin组每天注射I. 5mg/kg纳米银加上25nmol/ kg wortmannin;对照组则为等量的生理盐水。每天给药一次，均为在位给药。每天测量小 鼠体重和肿瘤的直径，连续给药8天后，牺牲小鼠，剥取皮下肿瘤并进行称重统计。统计显 示，纳米银处理组中，小鼠瘤重减轻了 42. 10%，wortmannin与纳米银共处理组瘤重则减轻 了 60. 91%，这表明抑制自噬后纳米银的抗肿瘤效果增强了 18. 81%，同样，wortmannin单 处理组没有明显的抗肿瘤效果（图8)。
【权利要求】
1. 纳米银与自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于制备抗肿瘤药 物或试剂盒的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。
3. 根据权利要求1所述的用途，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自噬下游降解 阻断剂，优选选自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化铵士3111〇1115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其组合。
4. 根据权利要求1所述的用途，所述自噬相关基因选自以下的一种或多种：Atg3、 Atg5、Beclinl、Atg7、Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral。
5. 根据权利要求1所述的用途，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂选自siRNA、 shRNA，和miRNA或其组合。
6. 自噬抑制剂和/或敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂用于制备促进纳米银对肿瘤 细胞杀伤的药物或试剂盒的用途。
7. 根据权利要求6所述的用途，所述肿瘤为宫颈癌或黑色素瘤。
8. 根据权利要求6所述的用途，所述自噬抑制剂为自噬泡形成抑制剂或自噬下游降解 阻断剂，优选选自》〇1'1：1]^1111；[11、1^294002、3-敵、氯化铵士3111〇1115^;[1141464(1和口6口8丨31:;[11 A或其组合。
9. 根据权利要求6所述的用途，所述自噬相关基因选自以下的一种或多种：Atg3、 Atg5、Bee 1 ini、Atg7、Atg9a、Atgl6Ll、FIP200、和 Ambral。
10. 根据权利要求6所述的用途，所述敲低/敲除自噬相关基因表达的试剂包括 siRNA、shRNA，和 miRNA 或其组合。
【文档编号】A61K33/38GK104258394SQ201410509906
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】温龙平, 林俊, 顾宁, 张云娇, 周伟, 金佩佩 申请人:中国科学技术大学