自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用，尤其是表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的多药耐药。本发明提供了自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用，该自噬抑制剂可有效增加肺癌细胞对于EGFR靶向药物的敏感性，对临床有着重要的借鉴价值，在通过药物治疗诱导肿瘤细胞凋亡的同时辅以自噬作用的抑制剂，可能将会增加人类癌症治疗的成功率。
【专利说明】自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及自自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]肺癌已成为发病率和死亡率增长最快，严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已属晚期，因此化疗仍是肺癌的主要治疗方法。但10多年来化疗的疗效并未获得突破性进展，靶向治疗的出现，让肺癌病人获得了新的希望。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂在肺癌的治疗中取得了巨大的成功，其代表药物为吉非替尼及埃罗替尼。这两类分子靶向药物都已在临床上广泛地使用，成为非小细胞肺癌的重要治疗药物，但是由于该类祀向药物价格昂贵，且有不少患者治疗一开始即对这类药物不敏感，或者有些患者对该类药物初始有效但很快产生耐药，患者在接受治疗的不同时期内出现对EGFR抑制剂不同程度的耐药现象，从而使得该类治疗药物的临床使用受到很大的限制。因此，提高EGFR抑制剂治疗敏感性方法显得尤为重要。
[0003]目前发现EGFR抑制剂耐药的机制主要包括以下几个方面:EGFR激酶区域特异性继发突变；酪氨酸受体高表达，下游效应蛋白活化；非依赖于EGFR的血管生成增加；下游区介质活化，信号途径异常激活，如其中可能与自噬作用密切相关的PI3K-Akt信号通路的异常激活。III型PI3K家族成员属于原`癌基因，其与蛋白激酶B(Akt)组成的PI3K-Akt信号通路，在细胞的增殖和存活中起着重要的作用。PI3K激活可导致Akt的完全活化，激活的Akt再通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的作用。PI3K组成性活化在EGFR耐药的发展和维持中起到关键作用。PI3K组成性活化的原因有:基因扩增、下游效应蛋白过度表达(如Akt蛋白)，以及PTEN丢失或失活。Kokubo等的研究显示EGFR抑制剂耐药的亚组人群的Akt磷酸化表达增加，PTEN蛋白表达减少，而PTEN的再引入或PI3K-Akt途径激活的药理学下调可以作为治疗耐药的一种方案。Qin等报道Ras和Src活化可以通过激活Akt和/或Erk信号途径而导致细胞对EFGR抑制剂耐药。
[0004]细胞自噬是依赖溶酶体途径对细胞内蛋白和细胞器进行降解的一种过程，以胞质内出现双层膜结构包裹部分胞质和细胞器的自噬体为特征，自噬过程由一系列基因控制，其中关键的基因包括LC3和ATG7等。许多化疗药物可以引起肿瘤细胞自噬，在某些情况下，自噬的持续激活最终会导致肿瘤细胞自噬性死亡，但相反，适度的自噬在大多情况下可以帮助肿瘤细胞面对各种死亡刺激,此时自噬表现为一种肿瘤细胞自我调整的生存方式，所以自噬在肿瘤治疗中的作用存在两面性。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。在此基础上提出一种新的增敏肺癌靶向治疗方法，即EGFR-TKI联合抑制自噬的方法。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。[0008]具体的，所述自噬抑制剂用于逆转表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的多药耐药。
[0009]发明人用EGFR-TKIs吉非替尼及埃罗替尼处理肺癌细胞系A549、H1299等细胞后，从形态学及分子生物学水平观察药物处理后细胞内的自噬现象，用免疫印迹的方法检测自噬相关的信号通路，揭示其诱导肺癌细胞自噬的分子机理。再使用小分子抑制剂或者小RNA干扰自噬必需基因的方法抑制肺癌细胞自噬，证实抑制自噬可以增加肺癌细胞对于EGFR-TKI的敏感性。
[0010]优选的，所述自噬抑制剂为氯喹。
[0011]优选的，所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼或埃罗替尼。
[0012]本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用，该自噬抑制剂可有效增加肺癌细胞对于EGFR靶向药物的敏感性，对临床有着重要的借鉴价值，在通过药物治疗诱导肿瘤细胞凋亡的同时辅以自噬作用的抑制剂，可能将会增加人类癌症治疗的成功率。(四)【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为EGFR-TKIs呈浓度(A)和时间(B)依赖性地诱导肺癌细胞LC3-1I表达。
[0014]图2为吉非替尼诱导肺癌细胞内自噬溶酶体形成。图中绿色荧光信号表示自噬标志蛋白LC3-1I (LC3)，红色荧光信号为标记的溶酶体(Lysosome)，绿色与红色信号共定位后出现的黄色信号表不自曬溶酶体(Merge)。
[0015]图3为透射电镜显示吉非替尼或者埃罗替尼可以诱导肺癌细胞系A549细胞内自噬体的形成。A:对照细胞；B、C:吉非替尼处理细胞；D、E:埃罗替尼处理细胞。图中白色箭头为典型的自噬体及自噬溶酶体。
[0016]图4为EGFR-TKIs可以诱导自噬关键基因ATG5及ATG7表达升高。A:Real timeRT-PCR方法检测ATG5/7mRNA水平；RQ:用GAPDH校正后的相对定量。B:western blot方法检测Atg5或者Atg7水平。
[0017]图5为EGFR-TKI通过抑制Akt/mT0R/p70S6K信号通路诱导A549及H1299细胞自曬。
[0018]图6为抑制自噬增加EGFR-TKIs诱导的肺癌细胞死亡。A为自噬抑制剂和溶剂处理后用MTT方法测定细胞的生长抑制曲线；B为westernblot方法检测siRNA方法有效地下调A549细胞ATG5及ATG7基因(左侧)和siRNA敲除目的基因后用MTT方法测定细胞的生长抑制曲线(右侧)。
(五)【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0020]实施例1:
[0021]EGFR-TKI吉非替尼(Gef itinib)及埃罗替尼(Erlotinib)分别处理肺癌细胞系A549、H1299等细胞后，从形态学及分子生物学水平证实药物处理后细胞内有自噬现象:
[0022](I)用不同浓度的吉非替尼或者埃罗替尼处理A549细胞及NC1-H1299细胞24小时后，收集细胞，提取蛋白，western blot方法检查LC3的表达变化；另外用25 μ M吉非替尼或者埃罗替尼处理Α549细胞及NC1-H1299细胞不同时间段后，收集细胞，提取蛋白，western blot方法检查LC3的表达变化；用GAPDH作为内参定量。用western blot方法检测EGFR-TKIs处理后细胞内LC3I/II的变化，结果见图1。
[0023](2)用25 μ M吉非替尼处理Α549或者NC1-H1299细胞24小时后，收集细胞，用lyso-tracker标记溶酶体，用FITC荧光二抗标记LC3抗体后，激光共聚焦显微镜成像，结果见图2。图中红色表示Iyso tracker标记的溶酶体,绿色表示FITC标记的LC3;蓝色表示DAPI标记的细胞核。最右边的一栏为重叠后照片。细胞内桔黄色部分表示LC3与溶酶体共定位，即形成自噬溶酶体。
[0024](3)用25 μ M吉非替尼或者埃罗替尼处理Α549细胞24小时后，用用透射电镜观察细胞内自噬现象的发生，结果见图3。图中显示大量具有典型双层膜结构的自噬泡形成，自噬泡内具有各种损伤破裂的细胞器结构，既为自噬体(图中白色箭头显示)，Bar=I μ m。
[0025](4)用25 μ M吉非替尼处理A549细胞6小时后用Real time RT-PCR方法检测ATG5/7mRNA水平；另外用不同浓度吉非替尼或者埃罗替尼处理A549细胞24小时后，用western blot方法检测Atg5或者Atg7水平,结果见图4。图中数据用mean土SD表示,用Student’ s t test 检验分析，**Ρ〈0.01。
[0026]结果:
[0027](I) EGFR-TKIs呈时间和浓度依赖性地诱导肺癌细胞LC3-1I表达。
[0028](2)吉非替尼可以诱导肺癌细胞内自曬溶酶体形成。用lyso-tracker标记溶酶体，用FITC荧光二抗标记LC3抗体后，激光共聚焦显微镜成像。细胞内出现LC3与溶酶体的共定位(绿色与红色共定位后成黄色)，即形成自噬溶酶体。
[0029](3)透射电镜显示吉非替尼及埃罗替尼可以诱导肺癌细胞系A549细胞内自噬体的形成，即药物处理后出现大量具有典型双层膜结构的自噬泡，自噬泡内具有各种损伤破裂的细胞器结构。
[0030](4)EGFR-TKIs可以诱导自噬关键基因ATG5及ATG7基因在mRNA及蛋白水平表达升高。
[0031]实施例2:
[0032]EGFR-TKI诱导肺癌细胞自噬的机理研究，用25 μ M吉非替尼或者埃罗替尼处理肺癌细胞系Α549、Η1299细胞不同时间后，western blot方法检测细胞内 phospho-(S2448)-mTOR, total mTOR,phospho-(S473)-Akt, total Akt,andphospho- (T389) -p70s6k水平变化,结果见图5。
[0033]结果:EGFR-TKI通过抑制Akt/mT0R/p70S6K信号通路诱导肺癌细胞A549及H1299自噬。
[0034]实施例3:
[0035]用小分子自噬抑制剂Chloroquine (CQ)或者RNA干扰方法敲除ATG5/7基因阻断肺癌细胞自噬后，分析肺癌细胞对于两种EGFR抑制剂治疗的敏感性变化:
[0036]5μΜ Chloroquine(CQ)(溶剂为无菌水)或者对应溶剂(无菌水)处理后，用12.5μ M吉非替尼或者埃罗替尼处理非小细胞肺癌细胞系(Α549，Η1299及SK-MES-1 )48小时，用MTT方法测定细胞的生长抑制曲线，结果见图6Α。[0037]siRNA敲除ATG5/7基因后，用12.5 μ M吉非替尼或者25 μ M埃罗替尼处理A549细胞48小时，用western blot检测A549细胞ATG5及ATG7基因表达量，结果见图6B(左侧)，并用MTT方法测定细胞的生长抑制曲线，结果见图6B (右侧)。图中数据用mean±SD表示，用 Student’ s t test 检验分析。*Ρ〈0.05, **P〈0.01。[0038]结果:自噬小分子抑制剂CQ可以增加吉非替尼或者埃罗替尼引起的肺癌细胞毒性。siRNA方法敲除自噬必需基因ATG5或者ATG7可以显著增加吉非替尼或者埃罗替尼引起的肺癌细胞毒性。
【权利要求】
1.自噬抑制剂在制备肿瘤多药耐药逆转剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述自噬抑制剂用于逆转表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂引起的多药耐药。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述自噬抑制剂为氯喹。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼或埃罗替尼。
【文档编号】A61K31/4706GK103505458SQ201310380007
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】韩卫东, 潘宏铭 申请人:浙江大学