萝卜硫素制剂及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种萝卜硫素制剂，该制剂包含：萝卜硫素、介孔二氧化硅、脂质膜，其中，介孔二氧化硅表面具有纳米级孔洞，该孔洞中载有萝卜硫素，所述脂质膜包覆在该载有萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒表面。本发明还公开了该萝卜硫素制剂的制备方法和应用。本发明的萝卜硫素制剂，对于癌症治疗具有积极作用，它不仅可以显著提高萝卜硫素的稳定性，而且具有缓释和靶向双重作用，维持较长的血液循环时间及必需的血药浓度，同时可以识别癌症组织或细胞，并且还可以通过细胞的内吞作用实现细胞内给药，应用前景非常广阔。
【专利说明】萝卜硫素制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体涉及一种萝卜硫素的新制剂，即脂质膜包覆介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒，以及该萝卜硫素纳米制剂的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤是人类健康的头号杀手，近些年来恶性肿瘤发病率有逐年上升的趋势，并且发病年龄越来越年轻化。一直以来医学研究都致力于治疗和防治癌症，但肿瘤患者死亡率未得到有效抑制。目前，从天然植物中寻求高效低毒的抗肿瘤药物已经成为肿瘤防治的重要方向之一。萝卜硫素，又称“莱菔硫烷”，是从十字花科蔬菜中提取出来的异硫氰酸盐物质，是所有天然抗癌物质里，效力最强、效果最好的活性成分。它有独特的抗癌功效，可以造成癌细胞的细胞凋亡和细胞阻滞；诱导人体内II相解毒酶，同时抑制I型酶的产生，最终通过多种酶体系排出致癌物和H自由基H等有害成分。目前越来越多的研究表明，癌症干细胞是肿瘤细胞中数量较少但生命力很强的细胞，它们对化疗和放疗有抵抗性，不易定位，还可以“生出”新的肿瘤细胞，手术、化疗对癌症干细胞没有作用，导致癌症复发，所以抑制癌症干细胞成为治疗癌症的一个重要课题。国内外研究表明，萝卜硫素不仅对肿瘤细胞有杀伤效果，更能抑制肿瘤干细胞。同时，萝卜硫素成分在人体内无残留，对机体无副作用，是一种新型抗癌成分。
[0003]萝卜硫素虽然有显著的抗癌和抑癌作用，但是结构不稳定，体内半衰期短，生物利用度极低，难以富集于病灶部位达到有效浓度，这些使萝卜硫素的临床应用有很大的局限性。鉴于萝卜硫素的不稳定性，目前研究多将其制备成与β环糊精、麦芽糖、戊二醛、乳清蛋白等的复合物或微胶囊，使之由不稳定的液体转化成较稳定的固态颗粒，方便用药。但是这些复合物或微胶囊中药物萝卜硫素的稳定性有限，且仍不能解决萝卜硫素体内半衰期短，生物利用度低的问题。而对于纳米制剂，由于萝卜硫素自身的物理性质，常规纳米粒的制备方法不能达到理想的载药量和包封效果，国内外至今未见萝卜硫素纳米制剂的报道。
【发明内容】
[0004]本发明要解决萝卜硫素稳定性差、体内半衰期短的技术问题，提供一种萝卜硫素制剂，该制剂以介孔二氧化硅纳米粒作为萝卜硫素的载体材料，在载有萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒表面包覆有脂质膜，该制剂不仅能显著提高萝卜硫素的稳定性，而且具有很好的缓释萝卜硫素的作用。
[0005]此外，还需要提供一种上述萝卜硫素制剂的制备方法及应用。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0007]在本发明的一个方面，提供了一种萝卜硫素制剂，该制剂包含:萝卜硫素、介孔二氧化硅、脂质膜，所述介孔二氧化硅表面具有纳米级孔洞，该孔洞中载有萝卜硫素，所述脂质膜包覆在该载有萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒表面。
[0008]所述介孔二氧化硅是由十六烷基三甲基胺溴化物和正硅酸四乙酯经反应制备而O O
[0009]所述脂质膜包含:D0PC或 DOTAP，DOPE，胆固醇，18: 1PEG2000-PE。
[0010]优选的，所述脂质膜表面修饰有抗体，通过抗体抗原反应将本发明的萝卜硫素制剂靶向肿瘤细胞及肿瘤干细胞。
[0011]本发明萝卜硫素制剂的粒径在200nm以下，可以通过细胞的内吞作用进入胞内，在细胞内环境中缓慢释放药物，达到抗癌作用。优选的，所述萝卜硫素制剂的粒径为100~200nm。
[0012]在本发明的另一方面，提供了一种上述萝卜硫素制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0013]将十六烷基三甲基胺溴化物溶于碱性溶液后，加入正硅酸四乙酯反应，得空白介孔二氧化硅纳米粒；
[0014]将萝卜硫素水溶液加入介孔二氧化硅纳米粒中，制成载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒；
[0015]将DOPC或DOTAP，DOPE，胆固醇，18: 1PEG2000-PE溶于氯仿中混匀，得脂质膜，再将该脂质膜水化后，用薄膜挤出器过聚碳酸酯膜多次，得纳米级脂质体混悬液；
[0016]将上述制备的脂质体混悬液，滴加入载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，搅拌孵育，获得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
[0017]本发明萝卜硫素制剂的上述制备工艺简单，条件温和，能充分保持药物活性，解决了萝卜硫素不稳定、不易被包封的问题。
[0018]优选的，所述载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液浓度为7.49~27.0mg/ml,脂质体混悬液浓度为1.5~3mg/ml,该载萝卜硫素介孔二氧化娃纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比为1:3~1:5。
[0019]在本发明的另一方面，还提供了上述萝卜硫素制剂的应用，用于制备治疗肿瘤的药物。
[0020]本发明的萝卜硫素制剂，对萝卜硫素有很好的包封作用，载药量高达6.2%。经过体外药物释放实验表明，该制剂在体液环境PH7.4的条件下不释放药物或少量释放药物，48h内累积释放量低于8%，极大的降低了药物在体内广泛释放所带来的毒性作用；在细胞内环境PH5的条件下能缓慢释放药物长达48h，体外48h累积释放量为85%左右。该制剂适用于癌症的治疗，将脂质膜用抗体修饰后，可以靶向肿瘤细胞，并且该制剂粒径小于200nm，易于进入细胞内部，在细胞内环境中缓慢释放药物。
[0021]因此，本发明的萝卜硫素纳米制剂，对于癌症的治疗具有非常积极的作用，它不仅可以显著提高萝卜硫素的稳定性，而且具有缓释和靶向双重作用，维持较长的血液循环时间及必需的血药浓度，同时可以识别癌症组织或细胞，克服了其他制剂全身给药的无选择性分布和严重毒性的缺点，并且特定粒径范围的纳米粒还可以通过细胞的内吞作用实现细胞内给药，应用前景非常广阔。
【专利附图】
【附图说明】 [0022]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0023]图1是本发明实施例1介孔二氧化硅纳米粒的氮气吸附-脱附等温线(图1A)和BJH模型孔径分布曲线图(图1B)；
[0024]图2是本发明实施例2脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒粒径分布图；
[0025]图3是本发明脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的场发射扫描电镜图； [0026]图4是本发明脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的场发射透射电镜图；
[0027]图5是本发明脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的体外释放曲线图。【具体实施方式】
[0028]为了克服萝卜硫素稳定性差、体内半衰期短的技术问题，本发明研制出了一种萝卜硫素新制剂，即脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。本发明萝卜硫素制剂选
择介孔二氧化硅纳米粒作为萝卜硫素的载体材料，该介孔二氧化硅表面有规则排列的纳米级孔洞，可以吸附大量萝卜硫素药物，使载药量显著提高。在萝卜硫素吸附于介孔二氧化硅后，再用脂质材料对介孔二氧化硅纳米粒进行包裹，使药物释放行为得到控制，使其在体液PH值条件下释放量低于8%，而在细胞内pH环境下缓慢持续释放48h。脂质膜上的功能基团，可以连接抗体，通过抗体抗原反应而靶向肿瘤细胞及肿瘤干细胞；制剂粒径在200nm以下，可以通过细胞的内吞作用进入胞内，在细胞内环境中缓慢释放药物，达到抗癌作用。
[0029]本发明萝卜硫素制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0030]1.制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0031]I)制备空白介孔二氧化硅纳米粒
[0032]将一定量的十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)溶解于去离子水中，加入氢氧化钠溶液，充分混匀。将混合溶液加热，得到澄清液体。将一定量的正硅酸四乙酯(TEOS)注入到上述澄清液体中，搅拌，得白色沉淀。
[0033]将白色沉淀固体在马弗炉中煅烧，充分去除介孔中的表面活性剂及其他有机残留物，研钵中研磨，使粒子均匀分散。所用材料的配比为:
[0034]CTAB 0.25-0.75g
[0035]去离子水120_360ml
[0036]NaOH 0.875-2.625ml
[0037]TEOS 1.25-3.75ml
[0038]将上述制备的脂质体混悬液，滴加入载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，搅拌孵育，获得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
[0039]2)制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0040]精密称取一定质量的介孔二氧化硅纳米粒，在磁力搅拌的作用下，将萝卜硫素水溶液逐滴加入，使二氧化硅纳米粒均匀分散于萝卜硫素水溶液中。所用材料的配比为:
[0041]介孔二氧化娃纳米粒7_25mg
[0042]萝卜硫素3.5_25mg
[0043]2.制备脂质体
[0044]精密称取脂质材料，按一定比例溶解于氯仿中，均匀混合后，真空干燥24h，挥去氯仿，得到脂质膜。将所制得的脂质薄膜以0.5X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，制得脂质体混悬液，再用薄膜挤出器过聚碳酸酯膜多次，得到一定浓度的纳米级脂质体混悬液。所用材料的配比为:
[0045]DOPC 或 DOTAP 2.75-8.25mg
[0046]DOPE 0.25-0.75mg
[0047]18:1PEG2000-PE 0.5-1.5mg
[0048]胆固醇1.5-4.5mg
[0049]0.5 X D-PBS 2_6ml
[0050]3.制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0051]在磁力搅拌的作用下，将上述制备的脂质体混悬液，逐滴加入至载萝卜硫素纳米粒的混悬液中，搅拌孵育。离心，弃去多余的脂质体，去离子水清洗。所用材料的配比为:
[0052]载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液浓度7.49-27.0mg/ml
[0053]脂质体混悬液浓度1.5-3mg/ml
[0054]纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比1:3-1:5。
[0055]本发明萝卜硫素制剂的上述制备工艺简单，条件温和，能充分保持药物活性，解决了萝卜硫素不稳定、不易被包封的问题。
[0056]下面通过具体实施例阐述本发明。
[0057]仪器和材料:
[0058]十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)，美国sigma公司；
[0059]原娃酸四乙酯(TE0S),美国sigma公司；
[0060]1，2_ 二油酸基卵憐脂(DOPC)，美国 Avanti Polar Lipid 公司；
[0061]1，2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE),美国 Avanti Polar Lipid 公司；
[0062]胆固醇，美国Avanti Polar Lipid 公司；
[0063]1,2-二油酰基-3-三甲胺丙烷(D0TAP)，美国 Avanti Polar Lipid 公司
[0064]甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺(18:1PEG2000-PE)，美国Avanti Polar Lipid 公司；
[0065]氢氧化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；
[0066]乙醇(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；
[0067]杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)，杭州吉诺生物医药有限公司；
[0068]Zetasizer nano ZS,英国马尔文公司；
[0069]薄膜挤出器，美国Avanti Polar Lipid公司；
[0070]碳酸酯膜，美国Avanti Polar Lipid公司。
[0071]实施例1制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0072]1.制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0073]I)制备空白介孔二氧化硅纳米粒
[0074]参考文献 Organic Functionalization and Morphology Control ofMesoporous Silica Materials via a Co-condensation Synthesis Method.SeongHuh, Jerzy ff.ffiench, J1-Chul Yoo, Marek Pruski and Victor S.-Y.Lin.Chem.Mater., 2003, 15 (22)，4247-4256。在500ml圆底烧瓶中，将0.5g十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)溶解于240ml去离子水中，加入1.75ml2.0mol/1的氢氧化钠水溶液，充分混匀。将混合溶液升温至80°C，维持30min，得到澄清液体。将2.5ml正硅酸四乙酯(TEOS)注入到上述澄清液体中，550rpm搅拌,3min后可见白色沉淀,维持反应温度在8(TC达2h。
[0075]混合溶液冷却至室温,分装至50ml离心管中，3000rpm, 20min离心分离弃去上清，得到固体产物，用适量去离子水和乙醇清洗后，真空干燥12h。
[0076]在马弗炉中550°C煅烧5h，充分去除介孔中的表面活性剂及其他有机残留物，研钵中研磨，使粒子均匀分散。
[0077]2)制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0078]精密称取7mg的介孔二氧化娃纳米粒,在低速磁力搅拌作用下,将Iml (3.5mg/ml)萝卜硫素水溶液逐滴加入，使二氧化硅充分分散于萝卜硫素水溶液中，4°C孵育24h。15000rpm离心10min,去除多余的萝卜硫素，去离子水洗三遍，得7.49mg/ml的载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液。
[0079]2.制备脂质体
[0080]分别精密称取脂质材料DOPC(1，2-dioIeoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, I,2- 二油酸基卵憐脂)或 DOTAP (I, 2-dioIeoy1-3-trimethyl-ammoniumpropane, I, 2- 二油酸基 _3_ 三甲胺丙烷)5.5mg, DOPE (I, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, I，2- 二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺)0.5mg，CH0L (胆固醇)3mg，18: 1PEG2000-PE (I, 2_dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethano lamine-N-[methoxy(polyethyleneglycoI)-2000](化合物侧链含18个碳原子，I个碳双键)，甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)Img,溶解于4ml氯仿中，充分混匀，真空干燥24h，形成脂质薄膜。将所制得的脂质薄膜以4ml0.5X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过IOOnm的聚碳酸酯膜20次,得到2.5mg/ml的纳米级脂质体混悬液。
[0081]3.制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0082]在磁力搅拌的作用下，将上述制备的脂质体混悬液，逐滴加入到载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比为1:4，4°C条件下搅拌孵育90min。5000rpm离心15min,弃去多余的脂质体,去离子水洗三遍,得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
[0083]实施例2制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0084]1.制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0085]I)制备空白介孔二氧化硅纳米粒
[0086]在500ml圆底烧瓶中，将0.25g十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)溶解于120ml去离子水中，加入0.875ml2.0mol/1的氢氧化钠水溶液，充分混匀。将混合溶液升温至80°C，维持30min，得到澄清液体。将1.25ml正硅酸四乙酯(TEOS)注入到上述澄清液体中，550rpm搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在80°C达2h。
[0087]混合溶液冷却至室温,分装至50ml离心管中，3000rpm, 20min离心分离弃去上清，得到固体产物，用适量去离子水和乙醇清洗后，真空干燥12h。
[0088]在马弗炉中550°C煅烧5h，充分去除介孔中的表面活性剂及其他有机残留物，研钵中研磨，使粒子均匀分散。
[0089]2)制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒[0090]精密称取16mg的介孔二氧化娃纳米粒,在低速磁力搅拌作用下,将4ml (3.5mg/ml)萝卜硫素水溶液逐滴加入，使二氧化硅充分分散于萝卜硫素水溶液中，4°C孵育24h。15000rpm离心10min,去除多余的萝卜硫素，去离子水洗三遍，得17.26mg/ml的载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液。
[0091]2.制备脂质体
[0092]分别精密称取脂质材料DOPC(1，2-dioIeoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, I, 2-二油酸基卵憐脂)或 DOTAP( I, 2-dioIeoyl-3-trimethyl-ammoniumpropane, I, 2- 二油酸基-3-三甲胺丙烷)2.75mg, DOPE (I, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, I, 2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺)0.25mg，CH0L(胆固醇)1.5mg, 18: 1PEG2000-PE (I, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethano lamine-N-[methoxy(polyethyleneglycoI)-2000],甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)0.5mg，溶解于4ml氯仿中，充分混匀，真空干燥24h，形成脂质薄膜。将所制得的脂质薄膜以2ml0.5X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过IOOnm的聚碳酸酯膜20次，得到1.5mg/ml的纳米级脂质体混悬液。
[0093]3.制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0094]在磁力搅拌的作用下，将上述制备的脂质体混悬液，逐滴加入到载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比为1:3，4°C条件下搅拌孵育90min。5000rpm离心15min,弃去多余的脂质体,去离子水洗三遍,得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
[0095]实施例3制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒
[0096]1.制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0097]I)制备空白介孔二氧化硅纳米粒
[0098]在500ml圆底烧瓶中，将0.75g十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)溶解于360ml去离子水中，加入2.625ml2.0mol/l的氢氧化钠水溶液，充分混匀。将混合溶液升温至80°C，维持30min，得到澄清液体。将3.75ml正硅酸四乙酯(TEOS)注入到上述澄清液体中，550rpm搅拌，3min后可见白色沉淀，维持反应温度在80°C达2h。
[0099]混合溶液冷却至室温,分装至50ml离心管中，3000rpm, 20min离心分离弃去上清，得到固体产物，用适量去离子水和乙醇清洗后，真空干燥12h。
[0100]在马弗炉中550°C煅烧5h，充分去除介孔中的表面活性剂及其他有机残留物，研钵中研磨，使粒子均匀分散。
[0101]2)制备载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒
[0102]精密称取25mg的介孔二氧化娃纳米粒,在低速磁力搅拌作用下,将7.2ml(3.5mg/ml)萝卜硫素水溶液逐滴加入，使二氧化硅充分分散于萝卜硫素水溶液中，4°C孵育24h。15000rpm离心10min,去除多余的萝卜硫素，去离子水洗三遍，得27.0mg/ml的载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米 粒混悬液。
[0103]2.制备脂质体
[0104]分别精密称取脂质材料DOPC(1，2-dioIeoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, I, 2-二油酸基卵憐脂)或 D0TAP( I, 2-dioIeoyl-3-trimethyl-ammoniumpropane, I, 2- 二油酸基-3-三甲胺丙烷)8.25mg, DOPE (I, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, I, 2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺)0.75mg，CHOL(胆固醇)4.5mg, 18: 1PEG2000-PE (I, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethano lamine-N-[methoxy(polyethyleneglycoI)-2000],甲氧基聚乙二醇2000- 二硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺)1.5mg，溶解于4ml氯仿中，充分混匀，真空干燥24h，形成脂质薄膜。将所制得的脂质薄膜以6ml0.5X杜氏磷酸缓冲液(D-PBS)充分水化，制得脂质体混悬液，再以薄膜挤出器过IOOnm的聚碳酸酯膜20次，得到3mg/ml的纳米级脂质体混悬液。
[0105]3.制备脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒 [0106]在磁力搅拌的作用下，将上述制备的脂质体混悬液，逐滴加入到载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比为1: 5，4°C条件下搅拌孵育90min。5000rpm离心15min,弃去多余的脂质体,去离子水洗三遍,得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
[0107]将实施例1~3制备的介孔二氧化硅纳米粒、载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒、以及脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒，进行如下的实验验证:
[0108]一、介孔二氧化硅纳米粒的性质考察
[0109]采用BK112全自动比表面积及孔隙分析仪测试实施例1~3中制备的空白介孔二氧化硅纳米粒的比表面积和孔径分布等性能指数。二氧化硅纳米粒在N2流中200°C脱气2小时，在77.35K (氮气的沸点)下，用多点Brunauer-Emmett-Teller (BET)法测定N2在不同的相对压力Ρ/Ρο下所对应的N2吸附量，从而得到N2的吸附曲线。结果显示该样品的BET多点比表面积为733.726m2/g, Barrett-Joyner-Halenda (BJH)吸附累积总孔体积为
0.695cm3/g, BJH吸附平均孔径为5.913nm，且具有较窄的孔径分布。
[0110]图1A是所制介孔二氧化硅纳米粒的氮气吸附-脱附等温线，该曲线属于LangmuirIV型吸附曲线，是典型的介孔结构吸附特征曲线。在Ρ/Ρ/0.3低分压段阶段，吸附量陡增产生突跃，这是N2分子低温下在介孔孔道内产生的毛细凝聚所致，吸附量的急剧增加表明介孔结构的存在并且孔径较均匀。之后N2分子吸附于外表面，曲线变化不大，较为平坦，在P/Po约为0.9处又出现突跃，这是颗粒间空隙所造成的毛细管凝聚。样品的吸附-脱附等温线出现比较明显的滞后环，说明毛细凝聚和毛细蒸发并不在同一压力下进行，这是由于吸附与脱附过程的热力学平衡和孔道的形状造成的。样品的吸附-脱附等温线几乎平行，属于Hl型滞后环，说明这些样品中存在形状规则且孔径高度均一的介孔孔道。
[0111]图1B是介孔二氧化硅纳米粒的BJH模型孔径分布曲线(即孔容-孔径微分分布曲线)，结果与氮气吸附-脱附等温线一致，也显示样品的孔径是介孔范畴且孔径分布较为集中。
[0112]二、粒径及电位的测定
[0113]使用Zetasizer nano ZS分别测得实施例1~3制得的载萝卜硫素介孔二氧化娃纳米粒的粒径为136.31 ±7.32nm, zeta电位为-30.3±4.6mv。
[0114]使用Zetasizer nano ZS分别测得实施例1~3制得的脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的粒径为152.9±5.47nm (见图2)，zeta电位为-24.8±3.9mv。
[0115]三、脂质膜包覆介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的场发射扫描电镜观察
[0116]分别取一定量的介孔二氧化硅纳米粒和脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒混悬液，滴加在样品板上，室温自然晾干后，在场发射扫描电镜下观察，得到介孔二氧化硅纳米粒(如图3(A)所示)和脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒(如图3(B)所示)的完整形态。
[0117]介孔二氧化硅纳米粒(如图3(A)所示)和脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒(如图3(B)所示)形态较圆整，粒径分布均匀，介孔形态和脂质膜形态需要在场发射透射电镜下进一步观察鉴定。
[0118]四、脂质膜包覆介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的场发射透射电镜观察
[0119]分别取一定量的介孔二氧化硅纳米粒和脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒混悬液，滴加在铜网上，室温自然晾干后，在场发射透射电镜下观察，得到介孔二氧化硅纳米粒(如图4(A)所示)和脂质膜包覆介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒(如图4(B)所示)的完整形态。
[0120]介孔二氧化硅是无机材料，直接在场发射透射电镜下观察，可以得到清晰的形态细节，但是脂质材料是有机物质，磷钨酸染色后，才能观察到清晰形态。所以脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒混悬液，滴加在铜网上，室温自然晾干后，2%磷钨酸染色，晾干后，在场发射透射电镜下观察(如图4 (C)所示)，同时，也将介孔二氧化硅纳米粒染色后再观察做对比参照(如图4(D)所示)。
[0121]结果显示，介孔二氧化硅纳米粒表面存在介孔，并且介孔分布均匀，规则排列(如图4(A)所示)，脂质膜清晰可见，并且均匀包覆在介孔二氧化硅表面(如图4(D)所示)。
[0122]五、脂质膜包覆介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒的体外释放实验
[0123]取IOmg脂质膜 包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒，置于IOml离心管中，用移液管取5ml磷酸盐缓冲溶液PBS(pH7.4)作为释放介质，将离心管放于37°C水浴摇床中，在设定时间点将离心管取出，20000rpm离心5min，取上清液0.5ml,同时补足新鲜PBS (pH7.4)释放液0.5ml。同样方法将PBS(pH5)作为释放介质进行萝卜硫素体外释放实验。用高相液相法测定样品中萝卜硫素的浓度，计算累积释放量，各处方平行三份，以时间为横坐标，累积释放量为纵坐标作图，结果如图5所示。
[0124]pH7.4是模拟人体内酸碱环境，pH5是模拟肿瘤细胞内酸碱环境。经过体外药物释放实验表明，该制剂在体液环境PH7.4的条件下不释放药物或少量释放药物，48h内累积释放量低于8% ;在细胞内环境pH5的条件下能缓慢释放药物长达48h,体外48h累积释放量为85%左右。
[0125]以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种萝卜硫素制剂，其特征在于，该制剂包含--萝卜硫素、介孔二氧化硅、脂质膜，所述介孔二氧化硅表面具有纳米级孔洞，该孔洞中载有萝卜硫素，所述脂质膜包覆在该载有萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒表面。
2.根据权利要求1所述的萝卜硫素制剂，其特征在于，所述介孔二氧化硅是由十六烷基三甲基胺溴化物和正硅酸四乙酯经反应制备而成。
3.根据权利要求1所述的萝卜硫素制剂，其特征在于，所述脂质膜包含:DOPC或DOTAP, DOPE，胆固醇，18:1PEG2000-PE。
4.根据权利要求1所述的萝卜硫素制剂，其特征在于，所述脂质膜表面修饰有抗体。
5.根据权利要求4所述的萝卜硫素制剂，其特征在于，所述抗体靶向肿瘤细胞、和/或肿瘤干细胞。
6.根据权利要求1所述的萝卜硫素制剂，其特征在于，所述制剂的粒径为100~200nmo
7.权利要求1所述萝卜硫素制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 将十六烷基三甲基胺溴化物溶于碱性溶液后，加入正硅酸四乙酯反应，得空白介孔二氧化娃纳米粒； 将萝卜硫素水溶液加入介孔二氧化硅纳米粒中，制成载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒; 将DOPC或DOTAP，DOPE，胆固醇，18: 1PEG2000-PE溶于氯仿中混匀，得脂质膜，再将该脂质膜水化后，用薄膜挤出器过聚碳酸酯膜多次，得纳米级脂质体混悬液； 将上述制备的脂质体混悬液，滴加入载萝卜硫素的介孔二氧化硅纳米粒的混悬液中，搅拌孵育，获得脂质膜包覆的介孔二氧化硅载萝卜硫素纳米粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液浓度为7.49~27.0mg/ml,脂质体混悬液浓度为1.5~3mg/ml。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述载萝卜硫素介孔二氧化硅纳米粒混悬液与脂质体混悬液体积比为1:3~1:5。
10.权利要求1所述萝卜硫素制剂的应用，其特征在于，用于制备治疗肿瘤的药物。
【文档编号】A61K47/04GK103989631SQ201310379840
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年4月15日
【发明者】张国庆, 钟延强, 周闺臣, 王新霞, 王东, 孙治国, 鲁莹, 张翮, 邹豪, 俞媛, 陈琰, 刘俊杰 申请人:中国人民解放军第二军医大学