专利名称：用于抑制HIV进入的α体的制作方法
技术领域：
本发明涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)和HIV感染的治疗领域。更具体来说，本发明涉及新型HIV进入抑制剂。本发明还涉及使用被称为“α体”的单链3股α-螺旋式卷曲螺旋分子，用作靶向gp41子区域的HIV进入抑制剂。
背景技术：
HIV-I Env复合体，也称为“包膜糖蛋白复合体”或“gpl20/gp41复合体”或“HIV 刺突”，是用于治疗HIV感染的首要靶点。它们展示在HIV病毒粒子和被工程化改造以表达包膜刺突的细胞的表面上。HIV进入靶细胞和细胞-细胞融合主要由展示在表面上的Env 糖蛋白复合体的作用介导。通常认为，阻断病毒进入或细胞融合的能力对于HIV感染的治疗来说有很高价值。病毒进入的抑制可以通过特异性靶向gpl20、gp41或融合介导受体CD4、CCR5或 CXCR4的子区域的抗病毒化合物来实现。特异性靶向gp41的化合物例如恩夫韦地(Fuzeon， T-20)旨在通过阻断融合机制中的关键步骤来行使其抗病毒效果。该关键步骤通常被称为六螺旋束的形成。六螺旋束作为gp41-HRl片段形成三聚体平行卷曲螺旋结构以及HR2片段紧密结合在该卷曲螺旋上的结果而形成。因为HRl可以通过位于N-端的融合肽附着到靶细胞膜上，而HR2通过位于C-端的跨膜片段附着到病毒膜上，因此据信gp41链的胞外结构域缩聚成紧凑的六螺旋束使两个膜接近，促进了膜融合并因此促进病毒粒子(或其内含物)进入靶细胞。发明概述本发明涉及一类新的HIV进入抑制剂，其特异性针对(靶向)gp41中的子区域，用于阻断六螺旋束形成。这种新的抑制剂类型对应于被称为“α体”的单链卷曲螺旋蛋白支架，其被工程化改造以与gp41_HRl (或序列中的邻近片段)或gp41-HR2(或邻近片段)结合。本发明还涉及能够同时与gp41的HRl和HR2区域或邻近区域结合的双功能α体。此夕卜，本发明涉及使用这样的α体来抑制HIV Env介导的细胞-细胞融合、抑制HIV病毒进入、抑制病毒复制、在哺乳动物和人类细胞中治疗HIV感染，涉及使用α体治疗HIV感染个体的方法、筛选新的抗HIV化合物的方法、被称为竞争测定法的方法和对个体进行抗HIV免疫接种的方法。本发明涉及被称为“α体”的单链3股卷曲螺旋支架的应用，所述α体被工程化改造以便结合HIV gp41的子区域，例如gp41氨基酸链中的HR1、HR2和邻近子区域。预期与这些子区域的结合将阻断六螺旋束形成，因此也阻断HIV进入、细胞-细胞融合、病毒复制和哺乳动物和人类细胞的感染。在优选实施方案中，本发明的α体与单一 gp41子区域结合，而在另一个优选实施方案中，它同时与两个不同子区域结合(双功能、双特异性结合)。 提供了产生这类α体的实用实例。本发明还涉及用于在个体中抑制HIV感染的方法。此夕卜，提出了将本发明的α体作为有用的筛选工具，通过直接结合测定法或通过竞争测定法鉴定新的HIV抑制分子。最后，提出了将本发明的α体作为疫苗或药物给药的方法。附图简述
图1、由HRl和HR2来源的肽构成的六螺旋束的形成。白色圆柱体表示形成三聚体平行卷曲螺旋(N-三聚体)的gp41-HRl来源的肽片段；灰色圆柱体表示与HRl-螺旋对之间的沟结合的gp41-HR2来源的肽片段。标记“N”和“C”分别表示螺旋的N-和C-末端。 因此，HR2螺旋以相对于HRl螺旋反平行取向结合。结合的结果是如白色箭头的右侧所示的六螺旋束。图2、由来自于gp41的HRl和HR2片段通过环区域互联而构成的六螺旋束的形成。 阴影和标记与图1中相同。弯曲箭头表示在六螺旋束形成之前(白色箭头的左侧)和六螺旋束形成之后(右侧)JfHIV Env刺突中的HRl片段(白色圆柱体)与HR2片段(灰色圆柱体)相连的环区域(二硫环、发夹环)。在天然或受体激活的刺突中HRl和HR2螺旋的相互取向不是必需与左图中所描绘的相同；后者旨在说明HRl和HR2片段是共价互联的并且在空间上仍然分离。图3、平行和反平行α体。图Α，平行α体；图B，反平行α体。平行的螺旋用白色圆柱体表示，而在图B中与另外两个螺旋反平行的螺旋被描绘成灰色圆柱体。将不同螺旋相连的弯曲尖头表示连接物片段。小的未连接箭头表示α体的N-和C-端延伸部分。螺旋按照它们在由单链氨基酸序列构成的α体中的出现顺序标记为A、B、C。图4、α体与gp41 HR2的结合。阴影和标记与图2和3中相同。α体用粗体圆柱体表示。该图显示，α体与gp41的HR2片段的结合阻止了后者与gp41 N-三聚体结合， 从而预先排除了六螺旋束的形成。图中没有显示HIV刺突中的两个或三个HR2片段被相等数量的α体结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图5、α体与gp41 HRl的结合。阴影和标记与图4中相同。该图显示，α体与 gp41 N-三聚体的结合阻止了后者与gp41 HR2片段结合，因此预先排除了六螺旋束的形成。 图中没有显示两个或三个α体与HIV刺突的相等数量的N-三聚体沟结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图6、α体与gp41 HRl和HR2的同时结合。阴影和标记与图4中相同。该图显示，α体与gp41 N-三聚体和gp41 HR2片段的同时结合阻止了后者与N-三聚体结合，从而预先排除了六螺旋束的形成。因此，该图显示了双功能α体。图中没有显示两个或三个 α体以相似方式与HIV刺突结合的可能性，但是它也不排除这种可能性。图7、与残基嫁接相关的结构特点。图A显示了 N-三聚体和HR2螺旋的示意图。在该实例中，N-三聚体取自发表在Root等，Science 2001,291 :884-888中的N40序列。HR2 序列取自C38序列(同上)。螺旋以N-三聚体的Z-轴指向后方(N-端在前)和HR2螺旋轴指向前方(N-端在后)的方向俯视。因此，被圈住的螺旋彼此反平行。圆圈之间的小箭头表明不考虑方向上的错配，HR2(C_)螺旋叠加在N-螺旋顶上。在实际情况中，这对应于将 HR2的c、f、b、e、a、d、g位分别作图在N_螺旋的d、a、e、b、f、c、g位上。用装配的C_螺旋代替N-螺旋将给出如图B中所描绘的类似构建物。然而，这种重组N-和C-肽片段的方式的直接和严重的问题是不可避免地扰乱核心包装。本发明的关键在于，当使用反平行α 体时不存在这样的问题。足以将图A中HR2的标记为d、a和e的位置分别嫁接到图B中标记为b、f和c的位置上，以获得具有良好包装的异亮氨酸核心，并显示出HR2结合性沟和带有沟结合性HR2残基的螺旋两者的α体构建物。图C和D说明了这样的构建物如何能够捕获病毒gp41分子中的相应区域；图C和D中的视图分别沿着和垂直于螺旋轴(所有螺旋都是理想化的并忽略了超螺旋)。双箭头表示非成键相互作用(结合)。连接来自病毒的N-螺旋和HR2螺旋的长箭头表示发夹环。图D清楚地显示了 α体(具有嫁接的HR2残基)中的螺旋B与来自病毒N-三聚体(形成结合位点)的一对螺旋是反平行的。同样地， α体的形成沟的螺旋A和C与病毒的HR2螺旋也是反平行的。因此，该图解释了构成具有同时靶向HIV-I Env刺突中的N-三聚体和HR2片段的能力的双特异性α体的构建基础的基本原理。图8、α体与HRl和HR2序列的序列比对。Α,被称为“Ν-40”的HRl序列(gpl60 HXB2的543至582位残基)与被称为“scAB013”的所选α体的序列(其仅仅1个螺旋)在三个不同框中的比对。七肽的a/d-位用灰色阴影表示。B，被称为“C38”的HR2序列(gpl60 HXB2的第625至662位残基与所选的α体SCAB013的序列(1个螺旋)在两个不同框中的比对，使得C38的a-、d-和e-位分别作图在α体的f-、b_和c_位上。通过这种方式， HR2(C38)接触残基(灰色阴影)当嫁接到α体上时，将背朝α体的中心。图9、沟氨基酸的初始选择。Α，在对于α体/HRl比对来说可能的三个候选者中选择将要嫁接到α体A-螺旋的g-和C-位(灰色阴影)处的残基。B，未突变的α体B-螺旋的氨基酸序列，其添加有适合的两侧连接物Ll和L2。C，在三个可能的七肽候选者中选择将要嫁接到α体C-螺旋的e-和b-位(灰色阴影)处的残基。图10、结构优化后的沟序列。A，在对于α体/HRl比对来说可能的三个候选者中结构优化后的A-螺旋的氨基酸序列。B，未突变的α体B-螺旋的氨基酸序列，添加有适合的侧翼连接物Ll和L2。C，在三个可能的比对候选者中结构优化后的C-螺旋的氨基酸序列。在参比α体scAB013中出现的残基未被下划线。单下划线的残基从HRl氨基酸嫁接。 双下划线的残基是在结构考虑的基础上选择的突变。图11、HR2残基的初始嫁接。B，具有在对于HR2肽C38的比对来说两个可能的候选者中的被嫁接HR2残基(灰色阴影)的α体B-螺旋的氨基酸序列。标记“B”仅用于指示嫁接将在α体的B-螺旋中进行。图12、结构优化后的B-螺旋序列。Α，未突变的α体A-螺旋的氨基酸序列，添加有适合的侧翼连接物Li。B，在对于α体/HR2比对来说可能的两个候选物中结构优化后的 B-螺旋。C，未突变的α体C-螺旋的氨基酸序列，前方带有适合的侧翼连接物L2。在参比 α体scAB013中出现的残基未被下划线。单下划线的残基从HR2氨基酸嫁接。双下划线的残基是在结构考虑的基础上选择的突变。图13、带有N-三聚体样结合性沟的最终α体构建物。Α，作为A-螺旋掺入到α 体中的3种氨基酸序列；Li，连接物1的序列；B，作为B-螺旋掺入到α体中的氨基酸序列， 与A-和C-螺旋的序列无关；L2，连接物2的序列；C，作为C-螺旋掺入到α体中的3种氨基酸序列。残基按照与图10中相同的惯例进行下划线。序列以Ai-Ll-B-L2-Ci的次序串联连接在α体中，其中i是指A和C下的序列之前的任何指数。因此，该图显示了被设计用于靶向HIV-I gp41中的不同HR2子区域的三种不同构建物。图14、带有HR2样界面残基的最终α体构建物。Α，作为A-螺旋掺入到α体中的氨基酸序列，与B-螺旋的序列无关；Li，连接物1的序列；B，作为B-螺旋掺入到α体中的2种氨基酸序列；L2，连接物2的序列；C，作为C-螺旋掺入到α体中的氨基酸序列，与 B-螺旋的序列无关；残基按照与图12中相同的惯例进行下划线。序列以A-Ll-Bi-L2-C的次序串联连接在α体中，其中i是指B下的序列之前的任何指数。因此，该图显示了被设计用于靶向HIV-I gp41中的N-三聚体的不同子区域的两种不同构建物。图15、scAB013_N3在不同GuHCl浓度中的CD热扫描。将α体溶解在20mM PBS, 150mM NaCl, pH 7. 2以及所示浓度的GuHCl中菱形，2M ；正方形，4M ；圆形，6M变性剂。α 体浓度约为12μΜ。在222nm波长处记录平均残基椭圆率([θ])。实心符号对应于向上 (加热)扫描，空心符号对应于向下(冷却)扫描。图16、用C36衍生物bL4_C36滴定的scAB013_N3的等温滴定量热术(ITC)。测量池装有在20mM PBS, 150mM NaCl, pH 7. 2中的2. 46 μ M scAB013_N3，注射器装有同样缓冲液中的50μΜ bL4_C36。图16A显示了在对基线漂移进行校正后的原始差示热分析图。对峰进行积分，通过减去最后4个峰的平均值以对摩擦/稀释效应进行校正，然后再次积分以获得图16B的累积焓变(ΔΗ)，其中图16B以bL4_C36与scAB013_N3的摩尔比为函数作图。 使用具有1 1结合化学计量的平衡模型进行的曲线拟合得出了热力学参数ΔΗ = -30 α/ mol 禾口 Kd = 150nMo发明详述1型人类免疫缺陷病毒(HIV-I)包膜糖蛋白复合体(HIV-1 Env，刺突)由糖蛋白 120(gpl20)和糖蛋白41(gp41)的异源二聚体的三聚体构成。这样的刺突天然地以融合前状态展示。在附着于靶细胞后，通过细胞受体⑶4和细胞因子共同受体(CXCR4或CCR5)的介导，发生了某些构象变化，最终产生融合后状态并伴有膜融合。在融合前与融合后状态之间，并且在部分构象变化之后，刺突采取一种被称为发夹前状态或融合中间体的状态。尽管对于发夹前状态的结构性质了解很少，但它被认为是定向的重要对象，因为某些在融合前和融合后状态中被隐藏的子区域变得可以接近抑制剂分子。HIV-I Env刺突中吸引了特别关注的子区域，是被称为七肽重复序列I(HRl)和七肽重复序列2(HR2)的片段。在从融合前状态转变到融合后状态后，HRl片段形成三聚体(3 股)平行卷曲螺旋结构，也称为“N-三聚体”。该卷曲螺旋结构由三个紧密相互作用的平行 α-螺旋构成。沿着这些α-螺旋并且在每对螺旋之间，存在一条浅沟。因此，每个N-三聚体具有三条沟。由于每个刺突中的HRl氨基酸序列相同，因此预计N-三聚体在原则上是结构对称的，尽管在从融合前向融合后状态的构象变化的动态过程中，推测不会在每个时刻保留这种结构对称性。正如从实验测定的代表了融合后状态的三维(3-D)结构所了解的，N-三聚体中的每个三条沟都具有至少与HR2片段结合的能力。因此，每个N-三聚体具有三个HR2结合性沟(位点、界面)。同样的3-D结构还显示，HR2片段以α-螺旋构象结合，并且这些螺旋以相对于N-三聚体的HRl螺旋反平行的取向结合。HRl螺旋形成内部三聚体平行卷曲螺旋，并且HR2螺旋形成外部螺旋。HRl和HR2来源的肽之间的复合体一般被称为“六螺旋束”(参见图1)。后者可以通过将HRl和HR2来源的肽、也分别被称为N-和C-肽进行简单混合来形成。然而，在HIV刺突的情形中，HRl和HR2片段不作为游离肽存在。在那里，它们形成被称为糖蛋白41(gp41)的连续氨基酸链中的子区域。该糖蛋白已被细分成下列功能区(参见例如 Noah 等，Biochemistry 2008,47 :6782-6792) (i)融合肽(FP,第 512 至 527 位残基)，融合肽近端区(FP-PR，第5 至540位残基)，N-肽区或七肽重复序列1(HR1，第Ml至581位残基)，二硫环或发夹形成环或环区(LR，第582至627位残基)，C-肽区或七肽重复序列2 (HR2，第6 至665位残基)，膜近端外部区(MPER，第666至683位残基)，跨膜区 (TM，第684至705位残基)和细胞内或细胞质区(CP，第706至856位残基)。本文中的残基编号是基于HIV-I HXB2的gpl60。在不同出版物中，所述功能区的边界可能差别多达约 5个残基。gp41的细胞外结构域(胞外结构域)对应于512至683位残基。因此，HRl和 HR2分别位于gp41胞外结构域的前一半(N-端)和后一半(C-端)中，并且它们被环区分尚开。在gp41胞外结构域的情形中，片段HRl和HR2可以形成在结构上与肽六螺旋束高度相似的六螺旋束。这时，六螺旋束由HR1/HR2异源二聚体的三聚体、也称为发夹的三聚体构成，其中每个HRl通过环区与HR2相连(参见图2)。因此，环区执行双重功能连接物和隔离物的功能。在本技术领域中尚不十分了解HRl和HR2如何在天然的融合前刺突中保持分离。 然而，已知刺突作为gpl20/gp41异源二聚体(不能与HR1/HR2异源二聚体混淆)的三聚体存在。关于来自gpl20和gp41的哪些残基在融合前状态中形成两种亚基类型之间的界面， 仅有很少的数据，并且完全不存在直接的结构证据。然而，越来越多的证据表明来自gp41 的不同子区域参与了与gpl20的相互作用，并且这些子区域或多或少彼此独立地结合(参见例如Kim等，J Mol Biol 2008，376 :786-797)。因此，gpl20可能在融合前状态中起到 gp41片段的空间隔离物的作用。此外，已知gp41通过它经FP-I3R与HRl相连的融合肽插入到靶细胞中。后者产生了融合前中间状态，其中HRl必需位于HR2远端(在空间上分离)， 而HR2本身通过MPER和TM区附着于病毒膜上。所有构象变化由⑶4和/或共同受体与 gpl20(而不是gp41)的结合触发。因此，据信在融合机制期间存在“机会窗口 ”，其中原本被封闭的HRl和HR2片段变得可以接近，用于靶向并随后抑制融合过程。普遍认为，gp41中的HRl和HR2片段的功能作用是通过形成六螺旋束来驱动病毒与靶细胞膜的融合。因此，抑制六螺旋束的形成被认为是阻止膜融合和病毒感染的有效策略。对于本发明来说，特别重要的是直接源于gp41 HRl和HR2序列的某些肽。例如， 据认为，HR2来源的肽例如C34(res. 628-661)直接靶向N-三聚体，在那里它们形成对HR2 的离体阻断，从而阻止六螺旋束形成和膜融合。相反，对N-肽例如N36 (res. 546-581)所提出的作用机制之一是它们在溶液中形成三聚体复合体，其在HR2变得可接近时能将其捕获。尽管后一种可能性仍存在争论，然而它已刺激了五螺旋束的设计(参见例如Root等， Science 2001，:884-888和专利申请US 2006/0014139A1)。此外，其他研究人员设计了稳定化的N-三聚体构建物(例如NCCG-gp41、N35CCG-N13、IQ-N23，参见Gustchina等， J Virol 2008,82 :10032-10041中的参考文献)。它们都显示出强的抗病毒性，其IC50典型地在纳摩尔浓度偏下范围内。因此，证实了 HRl和HR2子片段都是HIV-I gp41内的有效靶区域。过去，已经开发了多种HIV进入抑制分子(进入或融合抑制剂)，获得了不同程度的成功。它们可以粗略地细分成抗体、非免疫球蛋白蛋白、肽和小分子。单克隆抗体的非限制性实例是D5、2F5和4E10。非免疫球蛋白蛋白的非限制性实例是可溶性CD4和5-螺旋。 肽的非限制性实例是T20、T-1249和N36。小分子的非限制性实例是BMS-806、Maraviroc和AMD070。到目前为止，唯一获批用于临床使用的进入抑制剂是恩夫韦地(Fuzeon，T20)。 然而，后一种药物受到与安全性、耐受性、注射位点反应、患者顺从性和发生耐药性相关的问题的困扰。因此，对于新的抗HIV药物包括HIV进入抑制剂，存在着持续的需求。对于与现有抗病毒药物和先导物相比具有改进的特性的新药物和药物先导物，也存在着持续的需求。更具体来说，对于以改进的活性(抗病毒效价、抗病毒效能、在较低剂量下、在较低EC50 值下)抑制HIV进入和细胞-细胞融合的肽或蛋白类药物，存在着需求。对于在分子尺寸上与例如抗体或5-螺旋相比更小的蛋白类药物，例如，抗体或5-螺旋也存在着需求；这样的药物可能可以以较低成本生产，需要较少量原料(对于恒定的摩尔EC50来说)，能够潜在地表面给药(例如在霜剂、贴片
中)，并可能更适合于靶向刺突中的部分封闭结合区(即它们可能对空间位阻效应不太敏感并具有较高的扩散系数)。此外，对于具有长储存期限、高溶解性和蛋白酶抗性的稳定药物，也存在着需求。最重要的是，对于具有引发逃逸突变(抗性突变)的低倾向性的新药物，存在着高度需求。本发明的所有实施方案都涉及单链卷曲螺旋分子，其在本文中被合称为“ α体”。 在Desmet等的EP 08172017. 9和Desmet等的US61/120, 642中已经描述了类似的单链卷曲螺旋。简单来说，本文中的α体是指具有式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的单条连续氨基酸链的单链卷曲螺旋，并任选添加有N-和C-端延伸部分，产生式N-HRSl-L1-HRS2-L2-HRS3-C， 其中(a)HRSl、HRS2和HRS3的每个独立地是由2至7个连续的七肽重复(HR)单位构成的七肽重复序列(HRQ，所述七肽重复单位的序列可以命名为a-b-c-d-e-f-g，其中所有七肽的a-和d-位中的至少50%被异亮氨酸残基占据，并且HRS 1、HRS2和HRS3 —起构成了 3 股α -螺旋式卷曲螺旋结构；(b) Ll和L2的每个独立地是连接物片段，分别将HRSl共价连接至HRS2和将HRS2共价连接至HRS3，以脯氨酸或甘氨酸开始和结束，并由3至30个氨基酸残基构成，其中至少50%的氨基酸残基选自脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸；以及(c) N和C独立地是任选的延伸部分，其分别与HRSl和HRS3的N-和C-末端共价连接，该连接以打开螺旋的脯氨酸或甘氨酸为标志。如上所述，所有七肽的a_和d-位中的至少50%被异亮氨酸残基占据。剩余的 a-和d-位可以是任何20种天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。此外，每个Ll和/或L2中不是脯氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸，可以是任何20 种天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。b、C、e、f和g位处的氨基酸也可以是任何20种天然存在的氨基酸或非天然存在
的氨基酸。术语“天然存在的氨基酸”是指下列氨基酸丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸和酪氨酸。当在本文中使用时，术语“非天然存在的氨基酸”是指具有在天然存在的L-氨基酸中不存在的侧链的氨基酸。非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于胍丁胺、 (S)-2-氨基-4-((2-氨基)嘧啶基)丁酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、 4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、6-氨基己酸、α -氨异丁酸、二苯酮、叔丁基甘氨酸、瓜氨酸、 环己基丙氨酸、去氨基酪氨酸、L-(4-胍基)苯丙氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、高赖氨酸、η-甲酰基色氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯甘氨酸、(S)-4-哌啶基-N-脒基甘氨酸、鸟氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、肌氨酸、抑酶氨酸、2-噻嗯基丙氨酸和/或天然或非天然存在的氨基酸的D-异构体。α体尺寸相对较小(约为10至20kDa)。因此，该性质符合对治疗性蛋白分子的尺寸小于抗体或5-螺旋的要求。α体也是高度热稳定的，并且对ρΗ变化和蛋白水解降解相对不敏感。这些性质为开发具有保留了所需物理化学性质和获得的治疗功能的工程化改造的α体，形成了坚实基础。因此，α体符合对治疗性分子具有长保存期限的要求。α体也是高度可溶的，其符合对治疗性分子可以在体外容易地测试的要求。最重要的是，α体可高度工程化改造(可取代、可突变)这一事实，符合产生对所选靶分子具有高亲和性和特异性的新治疗分子的要求。总的来说，α体非常适合作为用于靶识别的支架分子，因为它们对多种氨基酸自发取代相对不敏感。例如，当单一沟的所有氨基酸残基同时突变时，α体的结构完整性总体上基本不受影响。类似地，当单一 α-螺旋的所有表面暴露的氨基酸残基同时突变时，结构完整性基本上不改变。因此，本申请人考虑到了将多个取代导入参比α体中，旨在提供与HIV-I gp41的细胞外结构域结合的α体的可能性，所述细胞外结构域被定义为SEQ ID Ν0:1的第1至 683位氨基酸残基。因此，本发明涉及与HIV-I gp41的HRl片段结合的α体，所述HRl片段被定义为 SEQ ID NO 1的第546至581位氨基酸残基。本发明还涉及与HIV-I gp41的HR2片段结合的α体，所述HR2片段被定义为SEQ ID NO 1的第6 至661位氨基酸残基。本发明还涉及与HIV-I gp41的HRl和HR2片段同时结合的α体，所述HRl和HR2 片段分别被定义为SEQ ID NO 1的第546至581和第6 至661位氨基酸残基。此外，本发明还涉及展示出用于HRl附近的gp41子区域的结合位点的α体，所述子区域即融合肽、融合肽近端区和环区的前一半。类似地，在本发明中包括了提供展示出用于HR2附近的gp41子区域的结合位点的α体，所述子区域即环区的后一半和膜近端外部区，还包括了展示出用于HRl附近和HR2附近的gp41子区域两者的结合位点的α体，即双功能α体。α体可以作为平行或反平行单链卷曲螺旋存在(图3)。平行和反平行α体适用于靶向gp41内的子区域。预计与这样的子区域结合的直接功能效应是阻断(例如阻止或抑制)六螺旋束的形成。通过与HR2附近的gp41子区域结合而进行的这类阻断显示在图4 中。通过与HRl附近的gp41子区域结合而进行的这类阻断显示在图5中。通过与HRl和 HR2附近的gp41子区域同时结合而进行的这类阻断显示在图6中。鉴于六螺旋束中的HR2片段相对于中心N-三聚体的螺旋是反平行的这一事实，本申请人设想反平行α体与平行α体相比可能更适合于同时结合HRl和HR2附近的gp41 子区域，尽管平行α体也可以提供双功能结合。双功能结合的一个优点可能是更高的结合亲和性或更强的抗病毒效应。双功能结合的另一个优点可能是引发抗性突变的更低的倾向性。因此，本发明的某些实施方案可能符合对病毒抗药性易感度更低的新抗病毒药物的要求。在优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV-I gp41结合的特征在于解离常数(Kd)或半最大有效浓度(EC50)在亚微摩尔范围内，优选情况下解离常数(Kd)或半最大有效浓度(EC50)低于1.0微摩尔浓度，或在亚纳摩尔范围内，优选情况下解离常数(Kd)或半最大有效浓度(EC50)低于1.0纳摩尔浓度，或在亚皮摩尔范围内，优选情况下解离常数 (Kd)或半最大有效浓度(EC50)低于1. 0皮摩尔浓度。这些技术包括但不限于RIA(放射免疫测定法)、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹心”免疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、Western印迹法、沉淀反应、凝集测定法(例如凝胶凝集测定法、血凝测定法等)、补体结合测定法、免疫荧光测定法、蛋白A测定法和免疫电泳测定法寸。当在本文中使用时，术语“Western印迹”是指固定化在支持物例如硝酸纤维素或膜上的蛋白(或多肽)的分析。将蛋白在丙烯酰胺凝胶上电泳以分离蛋白，然后将蛋白从凝胶转移到固相支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上。然后将固定化的蛋白暴露于对目标抗原有反应性的抗体。α体的结合可以通过各种方法检测，包括使用放射性标记的抗体、酶偶联抗体等。本发明的α体的结合特异性可以通过体外结合测定法例如放射免疫测定法 (RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。这样的技术和测定法在本技术领域中是已知的。α体的结合亲和性可以通过例如katchard分析、Friquet分析、表面等离子体共振或等温滴定来测定。对于靶向HIV erw抗原来说，鉴定具有高度特异性和高结合亲和性的 α体是有利的。在另一个优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV-I gp41的结合抑制HIV Env 介导的细胞-细胞融合，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1.0微摩尔浓度，或在亚纳摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1.0纳摩尔浓度，或在亚皮摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度 (IC50)低于1.0皮摩尔浓度，所述HIV Env介导的细胞-细胞融合的抑制通过细胞-细胞融合测定法来测量。在另一个优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV_lgp41的结合抑制HIV病毒进入，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度 (IC50)低于1.0微摩尔浓度，或在亚纳摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1. 0纳摩尔浓度，或在亚皮摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1. 0皮摩尔浓度，所述HIV病毒进入的抑制通过单循环抗病毒感染测定法来测量。在另一个优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV-I gp41的结合抑制HIV病毒复制，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度 (IC50)低于1.0微摩尔浓度，或在亚纳摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1. 0纳摩尔浓度，或在亚皮摩尔范围内，优选情况下半最大抑制浓度(IC50)低于1. 0皮摩尔浓度，所述HIV病毒复制的抑制通过病毒复制测定法来测量。在另一个优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV-I gp41的结合在体外或体内抑制HIV感染哺乳动物细胞。在另一个优选实施方案中，提供了 α体，其中与HIV-I gp41的结合在体外或体内抑制HIV感染人类细胞。在另一个优选实施方案中，提供了在个体中抑制HIV感染的方法，所述方法包含
11向个体给药本发明的HIV-I gp41结合性α体。在另一个优选实施方案中，本发明的HIV-I gp41结合性单链卷曲螺旋被用于治疗 HIV感染。当在本文中使用时，相关领域的技术人员可能通常将术语“治疗”理解为一般是指用于获得有益或所需结果的方法。有益或所需结合可以包括但不限于防止或预防、减轻或改善一种或多种症状或病症，减低疾病的程度，使疾病状态稳定(即不变糟)，阻止疾病的传播，延迟或减缓疾病进展，改善或缓和疾病状态，以及缓解(无论是部分还是完全的)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”也可以是指与如果不接受治疗时所预期的存活相比延长存活。当在本文中使用时，相关领域的技术人员可能通常将术语“治疗有效量”理解为当给药于需要治疗的对象时足以实现治疗的量。在本发明的实施方案的情形中，治疗有效量可以包括但不限于消除或减轻疾病在对象中的效应的量。本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的本发明的HIV_lgp41结合性单链卷曲螺旋和可药用载体。相关领域的技术人员应该理解，在本文中考虑到的对本发明的α体进行修饰。可以通过本技术领域已知的方法，通过偶联、标签或标记到任何已知诊断或治疗药剂，包括但不限于细胞毒性药剂(例如免疫毒素偶联物)、前体药物、药物(例如药物活性物质)或其他在疾病的治疗中有效的效应分子，以及已知的报告分子上，对本发明的α体进行修饰。 这样的修饰过的α体包括但不限于(a)标记的(例如放射性标记、酶标记、荧光染料或化学发光化合物)本发明的α体，使用已知成像技术用于诊断目的，以及(b)本发明的α体的免疫毒素偶联物，其中本发明的α体与已知的细胞毒性、放射活性、放射性标记、药物前体或药物组成部分偶联(例如放射免疫疗法)。相关领域的专技术人员应该理解，当在本文中使用时，术语“细胞毒性药剂”、“细胞毒素”或“细胞毒性”一般是指抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质，并且包括但不限于放射性同位素、化疗药剂和毒素例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素，包括其片段和/或变体。相关领域的技术人员还应该理解，当在本申请中使用时，术语“前体药物”一般是指药物活性物质的前体或衍生形式，其与药物活性物质相比对靶细胞的细胞毒性较低，并且能够被活化或转变成更具药物活性的物质。本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的本发明的HIV_lgp41结合性单链卷曲螺旋的修饰以及可药用载体。相关领域的技术人员应该理解，本发明的组合物，包括但不限于α体，可以使用标准的药物配制化学和方法配制成药物组合物，用于以这类物质惯常给药的方式给药。相关领域的技术人员还应该理解，这样的药物组合物可以包括一种或多种赋形剂、载体、稳定剂或其他无药物活性化合物，例如但不限于润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。可药用盐也可以包括在其中。本发明的药物制剂也可以包含其他治疗药剂或与其组合。本发明的α体可以肠胃外给药，包括但不限于肌肉内、静脉内、皮下或腹膜内注射或输注，以及通过透皮或透黏膜给药。或者，本发明的α体的给药可以是局部的，包括但不限于肛门或阴道给药。治疗有效剂量可以随着体重而变，并且给药的时间安排和持续时间将通过特定的临床研究流程来确定。
抗gp41的α体的主要用途是结合于gp41子区域，从而阻断六螺旋束形成。可以通过多种不同方法获得这样的α体。最为人熟知的是应用组合文库(例如具有所选的随机氨基酸位置的文库)和适合的展示技术(例如噬菌体展示)与适合的筛选方法(例如生物淘选)相组合。出于产生gp41结合性α体的目的并且为了初始结合物的进一步成熟(优化)，本申请人已经考虑到了组合文库方法的使用。本发明的其他实施方案涉及使用gp41或其片段的D-异构体(与天然存在的L-同种型相反)，对天然的L-异构型α体文库进行筛选或生物淘选。从这样的筛选或生物淘选中出现的与L-异构型α体结合的D-异构型gp41，然后可用于构建针对天然L-异构型 gp41的具有同样序列的D-异构型α体。D-异构型α体在体内得益于其对蛋白水解切割的抗性并可能得益于改变的药物动力学。在实施例1和2中，提供了在本文中充分详细说明的两种可选方法。这些方法在本技术领域中被称为通过嫁接进行的设计。它们部分依赖于α体与gp41N_三聚体之间的结构相似性。事实上，就其构造来说，α体基本上也是三聚体平行卷曲螺旋，尽管在两种卷曲螺旋类型之间存在重大差异(i) α体是单链蛋白分子，而N-三聚体是三个单独的、非共价结合的HRl片段的复合体；(ii) α体的核心大部分由异亮氨酸构成，而N-三聚体的核心相对非均质(ΗΧΒ2毒株的第543至582位片段中的11个七肽a/d_位中有4个异亮氨酸， 其余的a/d-位被亮氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸占据)；(iii) α体可以作为平行或反平行卷曲螺旋存在，而N-三聚体总是平行的；(iv) α体不是由天然存在的氨基酸序列构成或源于天然存在的氨基酸序列，相反，它是经优化后采取稳定折叠的非天然序列。然而，在平行或反平行α体中存在至少一对平行螺旋，其在理论上适合于重新设计，以便模拟gp41的N-三聚体沟。在本技术领域中，一种这样的重新设计方法被称为嫁接。尽管由于存在大量同时 “被移植”的氨基酸侧链使得嫁接不是显而易见的方法，但它可以形成快速方便的方式来获得先导构建物，所述先导构建物可以任选在随后的多轮优化中进一步优化。因此，本申请人考虑到了通过将N-三聚体/HR2界面残基嫁接到α体来重新设计 α体的沟，以模拟N-三聚体的沟。同样地，本申请人还考虑到了重新设计单一 α体螺旋以模拟在六螺旋束复合体中与N-三聚体进行接触的HR2表面。本申请人还考虑到了重新设计 α体中两个螺旋之间的沟和同一 α体的第三个螺旋的表面这两者，以便同时展示N-三聚体样结合沟和HR2样螺旋表面。正如本技术领域的专业人员所认识到的，这样的通过嫁接的重新设计完全不是显而易见的，因为被嫁接的侧链附着到非天然的(非病毒的、外来的) 蛋白支架上。在那里它们“到达”与其天然背景不同的其他侧链的背景中，可能引起构象扰乱效应和亲和性丧失。此外，在双功能α体构建物的情形中，存在自身结合的高风险。如果在α体情形中模拟N-三聚体的结合性沟的设计成功，所述α体也可用于 gp41结合之外的其他应用。事实上，这样的模拟物可用于搜索(筛选)与α体无关的，能够与模拟N-三聚体的α体结合并与病毒刺突中的gp41 HR2片段交叉反应的其他分子。因此，本申请人考虑到了与模拟gp41 N-三聚体的α体结合并抑制HIV感染的化合物或分子的鉴定方法，所述方法包含(i)将候选化合物或分子暴露于所述模拟N-三聚体的α体， ( )测定所述候选化合物或分子与所述α体的结合，(iii)如果发生结合则选择所述候选化合物或分子，以及(iv)通过适合的HIV抑制测定法评估所述所选候选化合物或分子的 HIV抑制活性。
本发明的α体可以使用本技术领域已知的化学合成方法来合成。或者，本发明的 α体可以通过遗传工程技术来生产。因此，本发明涉及编码本发明的α体的核酸例如DNA 或RNA，包含所述核酸的表达载体，用所述核酸或表达载体转化或感染的宿主细胞，以及用于生产本发明的α体的方法，所述方法包含用本发明的核酸、优选为本发明的载体转化或感染宿主细胞。本发明的α体可以使用本技术领域已知的化学合成方法来合成。或者，本发明的 α体可以通过遗传工程技术来生产。因此，本发明涉及编码本发明的α体的核酸，例如DNA 或 RNA。本发明还涉及包含编码本发明的α体的所述核酸的载体，优选为表达载体。当在本文中使用时，术语“载体”被用于指称将DNA区段从一个细胞转移到另一个细胞的核酸分子。当在本文中使用时，术语“表达载体”是指含有所需核酸靶序列和核酸或氨基酸序列在宿主中表达所需的适合核酸序列的重组核酸分子。在原核生物中表达所需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(任选)和核糖体结合位点，通常还包含其他序列。真核细胞已知利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷化信号。本发明还涉及用所述核酸、载体或表达载体转化或感染的宿主细胞。当在本文中使用时，术语“宿主”或“宿主细胞”是指任何真核或原核细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌(E. coli)，酵母细胞如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、哺乳动物细胞、 鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论是位于体外还是体内。例如，宿主细胞可以位于转基因动物中。相关领域的技术人员可以理解，本发明的α体可以通过重组DNA方法来制造。编码本发明的α体的DNA可以使用常规程序容易地合成。在制备后，可以将DNA置于表达载体中，然后将载体转化或转染到宿主细胞例如大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母中，以便在重组宿主细胞中获得α体的合成。因此，本发明涉及用于生产本发明的α体的方法，所述方法包含用本发明的核酸、优选为本发明的载体、更优选为本发明的表达载体转化、转染或感染宿主细胞。当在本文中使用时，术语“转化”和“转染”是指将外来DNA相应地导入原核和真核细胞。这些程序可以通过本技术领域已知的各种手段来实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂质转染 (Iipofection)、原生质体融合、反转录病毒感染和基因枪轰击(biolistics)。此外，本发明涉及模拟N-三聚体的α体在竞争测定法中用作药物筛选工具的用途。后一种用途对应于抑制HIV感染的化合物或分子的鉴定方法，所述方法包含(i)将表达Env的细胞同时暴露于模拟N-三聚体的α体和候选化合物或分子，(ii)确定所述候选化合物或分子与所述模拟N-三聚体的α体的竞争性结合，(iii)如果发生竞争性结合则选择所述候选化合物或分子，以及(iv)通过适合的HIV抑制测定法评估所述所选候选化合物或分子的HIV抑制活性。此外，本发明涉及模拟gp41的α体作为疫苗的用途。后一种用途对应于在个体中引发针对HIV的免疫应答的方法，所述方法包含使所述个体暴露于模拟gp41的α体(或用其进行免疫接种)。实施例实施例1、嫁接有N-三聚体沟的α体本实施例的目的是证实产生模拟gp41 N-三聚体的α体的实践中可行的方法。本申请人分析了与Fab抗原结合结构域D5复合的五螺旋束的晶体学测定的结构 (Root 等，Science 2001,291 :884-888 ;PDB 结构 2CMI )。图 7 的 A 显示了五螺旋束的 N-三聚体部分的示意图。根据作者描述，构成与HR2的界面的N-三聚体沟的残基位于七肽的e_和g_位处。 然而，根据我们自己的结构分析，至少还应该考虑b-和C-残基。因此，当将gp41的沟残基嫁接到α体中的结构对等位上时，应该考虑到位于b-、c-、e_和g_位处的一组氨基酸残基，而不是在Root等(同上)的图4中所建议的，其中只有e-和g_残基被描述为界面残基。在图7的图例说明中，解释了与将特定氨基酸残基从N-三聚体沟嫁接到α体上相关的一些结构特点。在图8Α中，在三个不同框中提供了被称为“SCAB013”的α体与被称为“Ν_40” 的HRl序列的序列比对。SCAB013是由于其高热稳定性而由被申请人选择的特定α体。 SCAB013被定义为如SEQ ID No :2中所示的氨基酸序列。用结构术语来说，第一个α体螺旋(“螺旋Α”，“七肽重复序列1”)通过连接物序列(“Li”)与第二个螺旋(“螺旋B”， “七肽重复序列2”)相连，第二个α体螺旋通过连接物序列(“L2”)与第三个螺旋(“螺旋C”，“七肽重复序列3”)相连。这意味着，不论螺旋B相对于相互平行的螺旋A和C的取向如何(因此不论α体是平行还是反平行的)，螺旋A和C都形成一对平行螺旋，其在结构和取向上类似于N-三聚体中的任何螺旋对。图8Α中的比对形成了嫁接程序的基础。鉴于α体与Ν_三聚体沟之间的结构相似性，将N-三聚体的c和g位嫁接到α体的A-螺旋上，并将b和e位嫁接到C-螺旋上。 这产生了具有如图9中所示的嫁接的沟残基的初始(未优化的)α体序列。正如本技术领域的专业人员所认识到的，将界面残基从一个结构直接“复制-粘贴”到另一个结构通常不产生功能性的完全转移；换句话说，结合亲和性常常丧失或至少显著降低。因此，通过用标准扭转角突变SCAB013CI体的3-D模型，将在图9中所示的序列基础上嫁接的所有氨基酸残基有效地置于所述模型上。接下来，在结构背景中检查每个突变的残基。在这种分析造成对结构相容性的怀疑的情形中，然后可以考虑可选替代物。后者作为双下划线残基显示在图10中。正如在其中看到的，大多数不确定残基被突变成一般被认为是更安全的丙氨酸。最后，图13中显示了具有被嫁接的N-三聚体样结合性沟的结构优化过的α体构建物。所选的用于连接螺旋A与B(Ll)和螺旋B与C(U)的连接物序列，被选择成各自具有6个残基的氨基酸序列“甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸”。合并的序列被提供成 SEQ ID No :3(被称为“scAB013_Nl”)、SEQ ID No :4( “scAB013_N2”)禾口 SEQ ID No 5( “scAB013_N3，，)。实施例2、嫁接有HR2结合位点的α体本实施例的目的是证实产生模拟在六螺旋束中与N-三聚体沟进行接触的HR2表面的α体(嫁接有HR2结合位点的或模拟HR2的α体)的实践中可行的方法。遵照与实施例1中基本上相同的策略，并进行了下文中讨论的具体修改。图7的A的下方螺旋轮显示了五螺旋束的HR2螺旋的示意图。根据作者描述，构成与N-三聚体的界面的HR2残基位于七肽的a_和d_位处。然而，根据我们自己的结构分析，至少还应该考虑e-残基。因此，当将gp41的沟残基嫁接到 α体中的结构对等位上时，应该考虑到位于a-、d_和e_位处的一组氨基酸残基，而不是在 Root等(同上)的图4中所建议的，其中只有a-和d-残基被描述为界面残基。在图7的图例说明中，解释了与将特定氨基酸残基从HR2螺旋嫁接到α体上相关的一些结构特点。在图8Β中，在两个不同框中提供了 α体scAB013(SEQ ID No 2)与被称为“C-38” 的HR2序列的序列比对。在这种情形中，特别之处在于HR2中的七肽的a、d和e位被嫁接到α体中暴露最多的位置上，以便可以充分接近进行gp41N_三聚体结合。所选的用于此目的的α体位置是b-、C-和f-位，其图谱如图7的图例说明中所解释。该图谱被用于图 8B中显示的比对。对于α体类型来说，α体是平行还是反平行的不造成本质差别，因为唯一的目的是制造通过单一 α-螺旋与gp41 N-三聚体的沟结合的α体。选择哪个螺旋(Α、Β或C)在原则上也是无关紧要的，但是鉴于最终目的是开发双功能α体，因此最优选择是B-螺旋。图8Β中的比对形成了嫁接程序的基础。其中，将所有HR2的a_残基转移到α体的f-位上，将HR2的d-和e-残基分别转移到α体的b_和c_位上。这产生了具有如图 11中所示的嫁接的HR2残基的初始(未优化的)α体序列。与实施例1类似，通过用标准扭转角突变SCAB013 α体的3-D模型，将在图11中所示的序列基础上嫁接的所有氨基酸残基有效地置于所述模型上。接下来，在结构背景中检查每个突变的残基。在这种分析造成对结构相容性的怀疑的情形中，可以考虑可选替代物。后者作为双下划线残基显示在图12中。与实施例1中不同，此时大多数不确定残基不被突变成丙氨酸，而是突变成同配的或略微更大的残基类型，以补偿朝向α体中心的螺旋挠曲，而对于与gp41 N-三聚体的理想结合来说，挠曲应该是相反的。最后，图14中显示了具有被嫁接的HR2样表面的结构优化过的α体构建物。所选的用于连接α体螺旋的连接物序列再一次选择成具有6个残基的氨基酸序列“甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸”。合并的序列被提供成SEQ ID Νο:6(被称为 “scAB013_Cl”)和 SEQ IDNo 7( “scAB013_C2”)。实施例3、scAB013_N3的可溶性表达和表征本实施例的目的是证实模拟gp41 N-三聚体的α体可以通过在大肠杆菌中重组表达来获得，可以从细胞质级份中纯化并进行物理化学表征。第二个目的是证实获得的α 体在体外与其识别靶序列结合。购买了用于N-端附带01化)6标签的8(^8013_吧的合成基因(GeneArt)。将该编码序列亚克隆到pET16b载体(Novagen)中。将得到的构建物转化到宿主大肠杆菌BL21 (DE3) 菌株中，所述菌株带有lacUV5启动子控制下的T7聚合酶基因的染色体拷贝(DE3溶源体)。 将转化后的细胞生长在添加有氨苄青霉素的培养基中，并通过向指数生长的培养物添加 IPTG来诱导蛋白表达。通过离心收集含有所表达的α体的细胞，并将沉淀物重悬浮在50mMTris,500mM NaCl,pH 7. 8中。然后通过超声破碎细胞，离心沉淀以除去细胞碎片。将澄清的上清液施加到载有Ni2+离子的HITrap IMAC HP柱(GE Healthcare)上。通过施加从5 至IOOOmM的咪唑梯度，洗脱结合的蛋白。将含有α体的级份合并、浓缩并上样到Superdex 75孔径排阻层析(SEC)柱(GEHealthcare)上。在该最后的纯化步骤中，将缓冲液更换成 50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.8。图 15 显示了纯化的 scAB013_N3 α 体在 20mM PBS, 150mMNaCl, pH 7. 2 和各种不同浓度的GuHCl中的222nm下的CD热扫描。分别在2M、4M和6M GuHCl存在下(实心符号)进行了三次从低至高温度的热扫描(“向上扫描”)。也记录了一次从高至低温度的扫描(“向下扫描”；空心符号)。2M向上扫描显示，scAB013_N3构建物在几乎整个温度范围内保持定量折叠。在温度超过9o°c时观察到热解折叠的开始(曲线拟合的Tm = iorc)。 4M向上扫描显示出几乎完全的热解折叠，拟合的Tm = 74堆叠式。4M向下扫描显示出热解折叠过程是完全可逆的(空心正方形与实心正方形相符)。6M向上扫描表明蛋白在整个温度范围内解折叠。合在一起，热解折叠实验显示出scAB013_N3a体是高度热稳定的，并且折叠/解折叠过程是完全可逆的。图16A和16B显示了在用生物素标记的C36肽滴定的scAB013_N3上进行的等温滴定量热术(ITC)实验的结果。被称为“bL4_C36”的生物素标记的C36肽对应于α体的识别靶序列。它由HIV-I ΗΧΒ2 Env序列的第拟8至663位残基构成(SEQ ID Νο:1)，其在 N-端用生物素标记并在C-端酰胺化，并且其中生物素基团通过4个残基的Gly/Ser连接物(-Gly-Ser-Gly-Ser-)附着于C36序列。差示热分析图(图16A)显示，在添加bL4_C36 后释放出少量放热，其逐渐减少直至接近摩尔比为1的饱和点。根据1 1结合模型通过曲线拟合产生了基线校正和积分的图(图16B)。这得出了下列热力学参数ΔΗ = -30kJ/ mol和Kd = 150nM。合在一起，ITC实验显示scAB013_N3 α体以相当高的亲和性与其识别靶序列结合。鉴于构建物是基于包含与原始SCAB013 α体相比25个取代(图13中的下划线残基)的合理设计这一事实，这种结果并不是显而易见的。
权利要求
1.一种HIV-I gp41结合性单链卷曲螺旋，其具有式HRS1-L1-HRS2-L2-HRS3的单条连续氨基酸链，任选添加有N-和C-端延伸部分，产生式N-HRSI-Ll-HRS2-L2-HRS3-C，其中a)HRSl、HRS2和HRS3的每个独立地是由2至7个连续的七肽重复单位构成的七肽重复序列，所有七肽的a-和d-位中的至少50%被异亮氨酸残基占据，并且HRSl、HRS2和HRS3 一起构成了 3股α-螺旋式卷曲螺旋结构；b)Ll和L2的每个独立地是连接物片段，分别将HRSl共价连接至HRS2和将HRS2共价连接至HRS3，以脯氨酸或甘氨酸开始和结束，并由3至30个氨基酸残基构成，其中至少50% 的所述氨基酸残基选自脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸；c)N和C独立地是任选的延伸部分，其分别与HRSl和HRS3的N-和C-末端共价连接， 该连接以打开螺旋的脯氨酸或甘氨酸为标志。
2.权利要求1的单链卷曲螺旋，其与HIV-Igp41的细胞外结构域结合，所述细胞外结构域被定义为SEQ ID NO 1的第1至683位氨基酸残基。
3.权利要求1或2的单链卷曲螺旋，其与HIV-Igp41的HRl片段结合，所述HRl片段被定义为SEQ ID NO 1的第546至581位氨基酸残基。
4.权利要求1或2的单链卷曲螺旋，其与HIV-Igp41的HR2片段结合，所述HR2片段被定义为SEQ ID NO 1的第6 至661位氨基酸残基。
5.权利要求1的单链卷曲螺旋，其与HIV-Igp41的HRl和HR2片段同时结合，所述HRl 和HR2片段分别被定义为SEQ ID NO=I的第546至581和第6 至661位氨基酸残基。
6.权利要求1至5任一项的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41结合的特征为解离常数 (Kd)或半最大有效浓度(EC50)在亚微摩尔范围或亚纳摩尔范围或亚皮摩尔范围内。
7.权利要求1至6任一项的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41的结合抑制HIV env介导的细胞-细胞融合，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围或亚纳摩尔范围或亚皮摩尔范围内。
8.权利要求1至6任一项的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41的结合抑制HIV病毒进入，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围或亚纳摩尔范围或亚皮摩尔范围内。
9.权利要求1至6任一项的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41的结合抑制HIV病毒复制，其特征为半最大抑制浓度(IC50)在亚微摩尔范围或亚纳摩尔范围或亚皮摩尔范围内。
10.权利要求1至9任一项的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41的结合抑制HIV感染哺乳动物细胞。
11.权利要求10的单链卷曲螺旋，其中与HIV-Igp41的结合抑制HIV感染人类细胞。
12.一种用于鉴定与权利要求1至11任一项的单链卷曲螺旋结合并抑制HIV感染的化合物或分子的方法，所述方法包含将候选化合物或分子暴露于所述单链卷曲螺旋，测定所述候选化合物或分子与所述单链卷曲螺旋的结合，如果发生结合则选择所述候选化合物或分子，以及评估所述选择的候选化合物或分子的HIV抑制活性。
13.一种用于鉴定抑制HIV感染的化合物或分子的方法，所述方法包含将表达env的细胞同时暴露于权利要求1至11任一项的单链卷曲螺旋和候选化合物或分子，测定所述候选化合物或分子对所述单链卷曲螺旋的竞争性结合，如果发生竞争性结合则选择所述候选化合物或分子，以及评估所述选择的候选化合物或分子的Hiv抑制活性。
14.一种药物组合物，其包含权利要求1至11任一项的HIV-lgp41结合性单链卷曲螺旋和可药用载体。
15.一种在个体中抑制HIV感染的方法，所述方法包含向个体给药权利要求1至11任一项的HIV-I gp41结合性单链卷曲螺旋。
16.一种在个体中引发针对HIV的免疫应答的方法，所述方法包含将所述个体暴露于权利要求1至11任一项的单链卷曲螺旋。
17.权利要求1至15任一项的HIV-Igp41结合性单链卷曲螺旋，其用作药物或疫苗。
18.权利要求1至15任一项的HIV-Igp41结合性单链卷曲螺旋，其用于治疗或预防 HIV感染。
19.权利要求1至15任一项的HIV-Igp41结合性单链卷曲螺旋，其用于诊断HIV感染的方法。
20.一种核酸分子，其编码权利要求1至11任一项的HIV-I gp41结合性单链卷曲螺旋的氨基酸序列。
21.一种宿主细胞，其包含权利要求20的核酸分子。
全文摘要
本发明涉及被称为“α体”的HIV-1 gp41结合性单链3股α-螺旋式卷曲螺旋分子、编码所述α体的核酸、包含所述核酸的宿主细胞和包含所述α体的药物组合物，以及使用所述α体治疗、预防和诊断HIV感染的方法。
文档编号C07K14/16GK102471372SQ201080030846
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月7日 优先权日2009年7月8日
发明者伊格纳斯·拉斯特尔斯, 索菲·凡维特斯温克尔, 约翰·德斯麦特 申请人:康普里斯有限公司